Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

El objetivo general de esta técnica es generar tejido cardíaco tridimensional diseñado que pueda utilizarse como plataforma de análisis de contracciones in vitro para el cribado de fármacos y el modelado de enfermedades. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardíaco sobre el modelado de enfermedades, la seguridad, la farmacología y los efectos de las variantes genéticas o los fármacos en la fuerza contráctil. La principal ventaja de esta técnica es que la fuerza contráctil se puede medir en tejidos cardíacos modificados de diferentes especies en condiciones estériles, durante largos períodos de tiempo.

Los científicos nuevos en este método podrían luchar con la falta de calidad celular. O la falta de un en el medio. Es importante optimizar la autopreparación y evitar ciclos de la Demostrando este procedimiento serán Anika Benzin y Umber Saleem.

Antes de comenzar el procedimiento, agregue 1,6 mililitros de agarosa tibia al dos por ciento en los pozos de primeros auxilios de una placa de 24 pocillos. E inmediatamente coloque politetrafluoroetileno en espaciadores en la agarosa. Después de unos 10 minutos a temperatura ambiente, la agarosa se volverá opaca, lo que significa su solidificación.

Retire los espaciadores y coloque los bastidores de PDMS en las piezas fundidas de modo que los pares de postes de los bastidores lleguen a cada molde de agarosa. Una vez colocados todos los racks, suspendemos los cardiomiocitos en medio a una concentración mínima de 1,5 veces 10 a las siete células por mililitro y se reconstituye con fibrinógeno de 10 a 15 veces con la pipeta serológica hasta que se disuelva el coágulo de fibrinógeno. Compruebe la homogeneidad de la mezcla de reconstitución en la pipeta.

Luego, para cada tejido cardíaco modificado, o EHT, mezcle 100 microlitros de mezcla de reconstitución con tres microlitros de trombina en un tubo de 200 microlitros. E inmediatamente alicuota 100 microlitros de esta mezcla de trombina EHT en las ranuras de agarosa. Utilice una nueva punta de filtro para cada EHT.

Una vez que se hayan llenado todas las ranuras con la mezcla de reconstitución, cierre la tapa de la placa de cultivo celular e incube las preparaciones durante dos horas a 37 grados centígrados y siete por ciento de dióxido de carbono. Al final de la incubación, coloque la placa en una campana estéril y cubra cada pocillo con 200 a 500 microlitros de medio. Agite la placa suavemente y devuelva los EHT a la incubadora.

Después de 10 minutos, transfiera con cuidado las gradillas a una nueva placa de 24 pocillos que contenga 1,5 mililitros de medio EHT por pocillo y coloque la placa en una incubadora de cultivo celular en las condiciones de cultivo adecuadas. Alimentación de los EHT's todos los lunes, miércoles y viernes, transfiriendo los racks de PDMS a una segunda placa con medio fresco. De siete a 10 días después de la fundición, los EHT deben demostrar contracciones espontáneas que desvían los postes de los bastidores del PDMS.

Para analizar las contracciones del EHT, el día del experimento, encienda el dispositivo de calentamiento en el instrumento de análisis EHT dos horas antes de la medición. Inmediatamente antes del análisis, encienda los suministros de gas y electrónicos del sistema de ejes. Para un registro de referencia, coloque la placa EHT en el instrumento de análisis EHT e inicie el software de análisis de contracción de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Utilizando las instrucciones del manual del software para iniciar una nueva ejecución, haga clic en la pestaña de protocolo para introducir la información relevante del estudio. Abra la pestaña de configuración y elija los pozos para el análisis. Debido a las limitaciones de tiempo, esto se demuestra solo para dos EHT en este video.

A continuación, haga clic en la pestaña de vista de la cámara e inicie el modo en vivo de la cámara con el modo de detección automática de figuras. Ajuste la posición de la cámara con las coordenadas xyz para cada pocillo seleccionado en el plato de 24 pocillos, teniendo cuidado de que cada EHT esté en el centro de la ventana y enfocado. Asegúrese de que las cruces azules estén en los extremos superior e inferior de los EHT y se muevan para que coincidan con las contracciones de los EHT.

Y presione el botón de posición OK para guardar las posiciones de configuración de cada pozo. Ahora haga clic en la pestaña de parámetros para definir los criterios por los cuales el software identifica un pico de contracción, marcando los picos con cuadrados verdes. Guarde todos los ajustes introducidos pulsando el botón Utilizar parámetros en todos los pocillos.

A continuación, haga clic en la pestaña automática y en el botón de inicio para registrar las contracciones basales del EHT y calcular la contractilidad basal espontánea para cada EHT. El análisis de contracción en vivo se mostrará en la pestaña en tiempo real. Asegúrese de que las cruces azules se muevan solo verticalmente para que coincidan con las contracciones de los EHT.

Para analizar los efectos de un medicamento específico de interés en las contracciones, primero transfiera una placa de 24 pocillos llena de solución tiroidea libre de proteínas bajo una campana estéril y coloque electrodos de carbono en los pocillos. Transfiera los EHT en sus bastidores PDMS encima de los electrodos y devuelva los EHT a la incubadora. Después de aproximadamente media hora, coloque los EHT en el enclavamiento del instrumento de análisis EHT y registre la contractilidad basal espontánea durante 20 segundos por EHT.

A continuación, conecte los electrodos de carbono al cable de estimulación y comience a estimular eléctricamente los EHT. Registre la línea de base con ritmo durante 10 segundos por EHT, teniendo cuidado de que todos los EHT tengan el ritmo adecuado. La señal de estimulación ahora está marcada por líneas verticales azules, incluidas en el injerto de contracción antes de cada pico.

Después del registro de la línea de base, transfiera los electrodos y los bastidores de PDMS a una nueva placa de 24 pocillos que contenga la primera concentración de fármaco e inmediatamente devuelva los EHT al enclavamiento del instrumento de análisis EHT para una incubación de 20 minutos. Vuelva a conectar los cables de estimulación, ajuste el reconocimiento de la figura y registre las contracciones del EHT en respuesta a la primera concentración del fármaco. Una vez que se hayan analizado todas las concentraciones del fármaco, guarde todas las grabaciones PDF resultantes y verifique cada grabación para el reconocimiento de figuras y la posición correcta de los cuadrados y artefactos del pico de contracción.

Para el análisis sin conexión, haga clic en seleccionar ejecución para la ejecución respectiva de la base de datos de ejecuciones y, en la pestaña de parámetros, cambie el parámetro para el análisis de contracción. Luego, en la pestaña sin conexión, elija análisis sin conexión para volver a analizar los videos. Para ajustar el reconocimiento de figuras y grabar un nuevo archivo de vídeo.

Ajuste el reconocimiento de figuras en la pestaña en tiempo real y seleccione revisión de muestras. A partir de ahora, se analizará el EHT en función de las nuevas posiciones. El análisis de cada EHT se basa en el reconocimiento de figuras en los extremos superior e inferior del tejido.

A continuación, el algoritmo del software del instrumento de análisis EHT analiza automáticamente las contracciones EHT filmadas y los picos se determinan de acuerdo con los criterios predefinidos pertinentes. La medición a largo plazo del análisis de contracción EHT demuestra que no hay cambios aparentes dependientes del tiempo en la fuerza de contracción, la frecuencia de batido, la contracción T1 o los tiempos de relajación T2 durante un máximo de 20 horas. Lo que indica un alto nivel de estabilidad para los constructos.

De hecho, los resultados para cada señal EHT son reproducibles con una baja variabilidad. Sin embargo, la exposición a un bloqueador de los canales hERG da lugar a una prolongación significativa del tiempo de relajación de T2, comenzando en la concentración. Y un patrón de batido irregular a concentraciones más altas.

Una vez dominado, se pueden generar 24 EHT en 30 minutos si la preparación se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo del modelado de enfermedades exploraran el efecto de las variantes genéticas in vitro. La versatilidad de este modelo, permite combinarlo con células madre inducidas humanas o con la tecnología de edición genómica.

Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar métodos adicionales como la histología o el análisis de ARN y proteínas para responder preguntas adicionales sobre la transcripción y la expresión de genes. Después de ver este video, deberías tener una buena idea de cómo emitir y analizar EHT. Si tienes alguna pregunta sobre este procedimiento, no lo dudes y ponte en contacto con nosotros directamente.