Name: Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Aprende a purificar ADN genómico de alto peso molecular de oídio para secuenciación de lecturas largas. Este método permite extraer ADN de alta calidad de conidias haploides y facilita el estudio de genomas fúngicos complejos en fitopatología.

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Este protocolo fue desarrollado en apoyo de un Proyecto Conjunto de Secuenciación del Instituto del Genoma y la Comunidad (#1657). El trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Filomatia, la Fundación Nacional de Ciencias (#0929226) y el Instituto de Biociencias Energéticas para S. Somerville; y por la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (#310030_163260) a B. Keller. Nos gustaría agradecer a nuestros colegas, M. Figureroa y M. Miller (Universidad de Minnesota), R. Panstruga (Universidad RWTH de Aquisgrán), C. Pedersen (Universidad de Copenhague), P. Spanu (Imperial College), J. Taneja (Universidad de California Berkeley), M. Wildermuth (Universidad de California Berkeley), R. Wise (Universidad Estatal de Iowa) y S. Xiao (Universidad de Maryland) por su generoso asesoramiento y por ofrecer voluntariamente sus protocolos mientras desarrollábamos el protocolo descrito aquí.

1. Preparación de Fungal materiales <ol><li> La creciente Oidio <ol><li> Cultivar plantas en cámaras de crecimiento con las siguientes condiciones: 22 ° C día la temperatura, 20 ° C Temperatura de la noche, 80% de humedad relativa, 14-h día de longitud y una intensidad de luz de 125 E · / m 2 / s (proporcionado por la iluminación fluorescente ). </li><li> Infectar plantas de pepino (variedad sativa Cucumis Bush Champion) con Golovinomyces cichoracearum UCSC1 cepa como se ha descrito 18, 29. </li></ol></li><li> La recolección Oidio conidios <ol><li> conidios Harvest de las plantas infectadas a los 7 - 10 días después de la inoculación usando un pequeño vacío con un filtro en línea (11 m) en el que los conidios se acumulan. La aplicación de presión suave, ejecute la boquilla de vacío a lo largo de la superficie de la hoja para recoger los conidios. NOTA: El rendimiento medio de G. cichoracearum es de 20 mg de conidios de un fuertemente infected hoja de pepino de aproximadamente 130 cm 2 en la zona. </li><li> Cepillo alrededor de 150 mg de los conidios (aproximadamente 375 l de volumen, o conidios de 7-8 hojas de pepino infectadas) desde el filtro en una hoja de papel limpia. Desde aquí, la transferencia de conidios en crioviales de 2 ml con un diámetro de dos 5/32 pulgadas pre-enfriado (en nitrógeno líquido) bolas de molienda de acero. Inmediatamente volver tubos para nitrógeno líquido. tubos almacenar a -80 ° C. </li></ol></li><li> Abriendo conidios por molienda de bolas <ol><li> Flash congelar placas de aluminio de molino de bolas en nitrógeno líquido. Cargar crioviales en rack de molino de bolas. Agitar vigorosamente los crioviales con conidios y bolas de acero en el molino de bolas durante 30 s a 30 ciclos / s (a temperatura ambiente). Inmediatamente vuelva a congelar crioviales en nitrógeno líquido. NOTA: En un principio, acceder a una muestra de conidios por microscopía con un aumento de 100X para la eficiencia de la ruptura de la pared celular durante la molienda. Si es necesario, moler para un adicional de 1 - 2 rondas de 30 s durante 30 ciclos / s, but mantener el número de rondas a un mínimo. La evaluación rutinaria de rotura de conidias por microscopía en esta etapa no es necesaria una vez que se han establecido las condiciones óptimas. </li></ol></li></ol> 2. Purificación de ADN genómico <ol><li> conidios de lisis <ol><li> Trabajar con rapidez para evitar conidios descongelación, eliminar las bolas de acero de crioviales con un imán. Añadir 700! L 65 ° C tampón de lisis (Tabla 1) y agitar 5 - 10 s hasta que se forma una suspensión. </li><li> Añadir 300! L precalentado (65 ° C) 5% (v / v) sarcosil y invertir suavemente para mezclar (1 inversión por cada 3 s) cinco veces. Incubar los tubos durante 30 minutos a 65 ° C; invierta suavemente 3 veces en 10, 20 y 30 min. Utilizando una punta de pipeta de gran calibre, Trasvasar toda la solución a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml. En todas las etapas posteriores, se mezcla por inversión suave, lento y transferir las soluciones que contienen ADN con puntas de pipeta de gran calibre. </li></ol></li><li> Extracción de ADN I <ol><li> Añadir 1 volumen de cloroformulario: alcohol isoamílico (24: 1 v / v) a la solución de lisis y se invierta suavemente para mezclar cinco veces. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente, suavemente invirtiendo para mezclar cinco veces en el punto a mitad de camino y de nuevo al final de la incubación. Centrifugar a temperatura ambiente durante 15 min a 14.000 x g. Utilizando puntas de pipeta de gran calibre, transferir cuidadosamente la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 ml; evitar la inclusión de material de la interfaz. </li></ol></li><li> ADN precipitación I <ol><li> Añadir 1 volumen de temperatura ambiente 100% de isopropanol (aproximadamente 750 l) y invertir suavemente para mezclar seis veces. Centrifugar a temperatura ambiente durante 15 min a 14.000 x g. Retirar con cuidado el sobrenadante y desechar. </li><li> Añadir 450! L pre-refrigerada% de etanol (-20 ° C) 70. Centrifugar durante 5 min a temperatura ambiente a 14000 x g. Retirar con cuidado el sobrenadante y desechar. Centrifugar a 1000 xg durante 3 s, retirar cuidadosamente el sobrenadante con punta de pipeta fina y desechar. Aire seco en el sedimento durante 15 min unatemperatura ambiente t. No seque durante más de 15 minutos. </li><li> Resuspender el precipitado en 300! L de TE (10 mM Tris-Cl, ácido tetra-acético de etileno diamina 1 mM, pH 8,0). Incubar durante la noche a 4 ° C. golpee suavemente para volver a suspender cualquier material residual que no entró en solución. </li></ol></li><li> Para eliminar la contaminación de RNA, añadir 10 l de RNasa A (10 mg / ml). Invertir suavemente para mezclar tres veces. Centrifugar a 1000 xg durante 3 s. Incubar a 37 ° C durante 2 h. </li><li> Extracción de ADN II <ol><li> Añadir 300! L de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1 v / v) y invertir suavemente para mezclar cinco veces. Incubar 10 minutos a temperatura ambiente, suavemente invirtiendo para mezclar cinco veces a mitad de camino y de nuevo al final de la incubación. Centrifugar 15 min a temperatura ambiente a 14000 x g. Utilizando una punta de pipeta de gran calibre, transferir el sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. </li></ol></li><li> ADN precipitación II <ol><li> Añadir 0,01 volumen de 3 M de acetato de sodio pH 5,2 (approximately 3 l), invertir suavemente para mezclar cinco veces. Añadir 2,5 volúmenes pre-enfriada (-20 ° C) 100% de etanol (aproximadamente 750 l). Invertir suavemente para mezclar cinco veces. Incubar durante la noche a -20 ° C. </li><li> Centrifugar 30 minutos a 4 ° C a 14.000 x g. Retirar con cuidado el sobrenadante y desechar. </li><li> Añadir 450! L pre-refrigerada% de etanol (-20 ° C) 70. Centrifugar durante 5 min a 4 ° C a 14.000 x g. Retirar con cuidado el sobrenadante y desechar. Centrifugar a 1000 xg durante 3 s. Retirar con cuidado el sobrenadante con pipeta de punta fina y descarte. </li><li> Aire seco en el sedimento durante 30-60 minutos a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado en 27,5 l de TE. Incubar durante la noche a 4 ° C. golpee suavemente para volver a suspender cualquier material residual que no entró en solución. </li><li> Alícuota de 2,5 l en 22,5 l de TE (volumen final 25 l) para las pruebas de control de calidad (ver abajo). Tiendas muestras de ADN a 4 ° C hasta la presentación para la secuenciación. Para el almacenamiento, almacenar muestras a largo plazoa -80 ° C y minimizar los ciclos de congelación-descongelación para evitar cizallamiento. NOTA: Tenga cuidado al pipetear en este paso como el ADN genómico de alto peso molecular puede ser difícil de pipetear correctamente, y es importante para asegurarse de que &quot;QC Alícuota&quot; es una representación exacta de la muestra de ADN genómico. </li></ol></li></ol> 3. Control de Calidad <ol><li> pureza de la muestra <ol><li> El uso de un TE en blanco, evaluar la pureza de la muestra del ADN mediante la carga de 1 l de la QC alícuota en un espectrofotómetro de pequeño volumen. Registro A260 / A280 y A260 / A230 lecturas. ADN puro tendrá una relación A260 / A280 de la relación de aproximadamente 1,8 y A260 / A230 entre 1,8 y 2,2. </li></ol></li><li> Cuantificación de ADN genómico <ol><li> Realizar cuantificación de QC alícuota utilizando un kit de ensayo de cuantificación de ADN de doble cadena comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> ADN I Evaluación de la Calidad <ol><li> Cargar aproximadamente 60 ng de ADN genómico y unaescalera de ADN en un gel de agarosa al 0,7% en 1X TAE (Tris 40 mM, ácido acético 20 mM, y EDTA 1 mM, pH 8,0). aparato de gel correr a 70 V durante 40 - 45 min hasta que las bandas de ADN genómico son aproximadamente 2 cm desde el pozo y cinta de separación en la escalera es aparente. Estas condiciones pueden necesitar ser ajustado basado en aparato de electroforesis de gel disponibles. </li></ol></li><li> ADN II Evaluación de la Calidad <ol><li> Cargar aproximadamente 60 ng de ADN genómico y una escalera de ADN de alto peso molecular (adecuado para la electroforesis en gel de campo pulsado) en un gel de agarosa al 1% en TBE 0,5x (Tris 44,5 mM, 44,5 mM de ácido bórico, EDTA 1 mM, pH 8,3) y correr en tampón de ejecución 0,5x TBE usando un 5 - de campo pulsado protocolo de electroforesis en gel de forma de onda de 80 kpb durante 16 h. </li></ol></li><li> Evaluación de origen bacteriano, fúngico, y contaminantes de plantas <ol><li> Realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar los espaciadores transcritos internos apropiados (ITS) regiones de los genes ribosómicos utilizando cebadores y condiciones de amplificación de la listaed en la Tabla 2. Cargar 10 l de la reacción resultante en un gel. NOTA: una banda que representa el oidio región ITS debe ser amplificado con el hongos SU cebadores. ADN de este amplicón y cualquier amplicón generado con los cebadores, o bacterianas de las plantas debe ser secuenciado para determinar el origen de la contaminación. Sólo oidio secuencias de ITS se debe encontrar en el amplicón hongos. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Con el fin de obtener ADN puro, de alto peso molecular genómico de la obligado hongos oidio biotrófico, una versión modificada de los métodos descritos anteriormente se desarrolló 30. El rendimiento promedio utilizando este protocolo optimizado es 7 g de ADN por 150 conidios mg, una duplicación de los rendimientos obtenidos con un protocolo anterior. Además, el tamaño promedio se incrementó de aproximadamente 20 kpb a más de 48,5 kpb. Este protocolo se ha optimizado en el sistema cichoracearu...

<html> Cenicillas son un grupo de obligado planta de hongos patógenos que biotrófica, tomados en conjunto, son la principal causa de enfermedades de las plantas en todo el mundo 1. Hay más de 900 especies descritas de oídio, que se han agrupado en cinco tribus taxonómicamente dentro de la familia Erisyphaceae 2. Debido tanto a su importancia económica y la relación íntima que desarrollan con sus anfitriones, las enfermedades de moho han sido objeto de investigación para&gt; 100 años. Tras la infección, oídios provocan cambios drásticos en la estructura celular, el metabolismo y la biología molecular de sus anfitriones, en beneficio de este patógeno. Sin embargo, el estudio de oídios es particularmente difícil debido a su estilo de vida obligado, y el crecimiento del hongo en cultivo puro todavía no se ha descrito 3, 4, 5,&quot;xref&quot;&gt; 6, 7, 8. Fiable transformación, estable genética de cenicillas aún no ha logrado también ha sido, a pesar de la transformación transitoria se ha reportado en algunas especies 9, 10. La secuenciación y ensamblaje de genomas de moho en polvo ha demostrado ser difícil debido a una serie de características de la propia genoma. Genomas de moho en polvo son grandes (120 a 180 Mbp) en relación con otros genomas de hongos, y se componen de 60 - 90% de elementos repetitivos distribuidas uniformemente 11. Estos elementos incluyen repeticiones terminales no largos, así como elementos repetitivos no categorizados. Dos formas especiales de una sola especie oídio, Blumeria graminis f. sp. hordei y f. sp. tritici (Bgh y Bgt, respectivamente), así como el polvo de uva moho Erysiphe necator, tienen abejan secuenciaron, y los proyectos de genomas de varios otros se han completado 12, 13, 14. La naturaleza repetitiva de los genomas ha hecho ensamblaje difícil, y el genoma Bgh terminado fue ensamblado en 6.989 supercontigs con un L50 de 2 Mb 12. A pesar del gran genoma, los oídios parecen tener un pequeño número de genes de proteínas de codificación, con 5.845 y 6.540 genes predichos en Bgh y Bgt, respectivamente. Los mildius pulverulentos secuenciados también parecen carecer de al menos 99 genes esenciales que son esenciales en otros hongos, que es consistente con la dependencia de los hongos en su planta huésped para la supervivencia 11, 12, 13, 14. Las secuencias repetitivas cerca de telómeros, centrómeros, RN ribosomalA arrays y regiones enriquecidas en elementos de transposición de genes están mal ensambladas a partir de estrategias de secuenciación-leer cortas y son a menudo insuficientemente representadas en asambleas del genoma 15. Se cree que estas regiones para ser responsable de muchos de los huecos que se producen en secuencias del genoma, y esto se aplica a los oídios con su amplia expansión de elementos repetitivos 16. Altamente regiones del genoma de plástico se encuentran a menudo en tales regiones repetitivas 3. Ellos sirven como un sitio de reordenamientos cromosómicos y, a menudo codifican genes bajo fuerte presión selectiva, tales como los genes que codifican las proteínas efectoras y los genes que codifican enzimas del metabolismo secundario. Los avances en una sola molécula de tecnologías de secuenciación de lectura larga proporcionan una solución potencial para la secuenciación a través de las regiones repetitivas de genomas 15. Por ejemplo, FAINO et al. (2015) encontraron que la inclusión de la secuencia larga leer tecnologías y m ópticoapping les permitió producir una secuencia de genoma GAP-menos por dos cepas de la planta de hongos patógenos dalia Verticillium, triplicando la proporción de secuencias repetitivas de ADN en el genoma, aumentando el número de anotaciones de genes (y reducir el número de parcial o falta anotaciones de genes ) y el genoma revelador reordenamientos 17. Para emplear estas tecnologías de secuenciación de larga leer, altas concentraciones de ADN genómico de alta calidad, con un mínimo de tamaños&gt; 20 kpb, son necesarios. Aquí describimos nuestros métodos para la recolección de conidial, la purificación de ADN de alto peso molecular a partir de conidios y nuestras evaluaciones de control de calidad utilizando las especies de moho en polvo Golovinomyces cichoracearum cultivadas en pepino 18. Este protocolo se basa en un protocolo desarrollado en el grupo de laboratorio B. Keller (Universidad de Zürich, Zürich Suiza) 13, 19e incluye varias modificaciones que condujeron a un aumento de los rendimientos de ADN y una mayor proporción de ADN&gt; 48,5 kpb de tamaño. El protocolo también incluye medidas de control de calidad basado en las recomendaciones del Departamento de Energía de los Estados Unidos Joint Genome Institute 20, 21, 22. La función de cada reactivo incluido en el tampón de lisis, y la justificación de cada etapa de purificación, son como se describe en Henry (2008) 23. Disponibles protocolos publicados para el aislamiento de ADN genómico de alto peso molecular a partir de tejidos vegetales y microbianas también fueron consultados durante el diseño de este protocolo 24, 25, 26, 27, 28.

<table><tbody><tr><td>MM400 Molino de bolas</td><td>Retsch</td><td>20.745.0001</td><td>O equivalente molino</td></tr><tr><td>de bolas 2 mL tubos para molienda de bolas</td><td>Sarstedt&nbsp;</td><td>72.694.007</td><td></td></tr><tr><td>Bolas de fresado de acero inoxidable de 5/32"</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 165-5000-01</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua de la serie 280 controlado por microprocesador Preajustado a 65 &deg; C&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>o equivalente Baño de agua</td></tr><tr><td>controlado por microprocesador Serie 280 Baño de agua Preestablecido a 37 &deg; C</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2825</td><td>O equivalente baño de agua</td></tr><tr><td>Eppendorf 5417R microcentrífuga refrigerada</td><td>Krakeler Scientific&nbsp;</td><td>38-022621807</td><td>O microcentrífuga equivalente</td></tr><tr><td>Clorformo:IAA (24:1 v/v)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>C0549</td><td>Peligroso en caso de contacto con la piel o inhalación. Use guantes de nitrilo, gafas protectoras, bata de laboratorio y trabaje con capucha química</td></tr><tr><td>Fenol:Cloroformo:IAA (25:24:1 v/v)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593031</td><td>Peligroso en caso de contacto con la piel o inhalación. Use guantes de nitrilo, gafas protectoras, bata de laboratorio y trabaje con capucha química</td></tr><tr><td>100% Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>W292907</tr><tr><td>100% etanol</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>34923</td><td>Enfriar a -20 ° C</td></tr><tr><td>Acetato de sodio de uso</td> previo <td>Sigma-Aldrich &nbsp;</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Rnasa, sin dnasa (10 mg/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Metabisulfito de potasio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P2522</td><td></td></tr><tr><td>Lauril sacroinato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L9150</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td><td></td>10708976001</tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de cetiltrimetilo amonio (CTAB)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H6269</td><td></td></tr><tr><td>Uvex by Honeywell Futura Goggles S345C, Uvextreme</td><td>Staples</td><td>423263</td><td>O equivalentes</td></tr><tr><td>Guantes de nitrilo de COBALTO High Five High Five, GRANDES</td><td>Neta Scientific</td><td>HFG-N193</td><td>O guantes equivalentes</td></tr><tr><td>GelRed Gel de ácido nucleico Tinción 10,000x en agua</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro de etidio 10 mg/mL</td><td>Biotium</td><td>40042</td><td>Peligroso en caso de contacto con la piel. Use guantes de nitrilo y gafas protectoras</td></tr><tr><td>Biorreactivo ultrapuro de agarosa</td><td>VWR International LLC</td><td>JT4063</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1332</td><td></td></tr><tr><td>8 - 48 kb CHEF Estándares de tamaño de ADN</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3707</td><td></td></tr><tr><td>Pippin Prep</td><td>Life Technologies Corporation</td><td>4472172</td><td>O equivalente gel de campo de pulso aparatus</td></tr><tr><td>Papel de filtro cualitativo Whatman, Grado 1</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>WHA1001042</td><td>o equivalente cámara de crecimiento</td></tr><tr><td>Percival Cámara de crecimiento</td><td>Percival</td><td>AR66LXC9</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 8000 Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td><td>o equivalente espectrofotómetro</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P11496</td><td></td></tr><tr><td>Tampón TAE (Tris-acetato-EDTA) (50x)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B49</td><td>Diluir 1/50 con agua antes de usar (hasta 1x)</td></tr><tr><td>TE Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific 12090015</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Borato-EDTA, 10x Solución (Electroforesis)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP13334</td><td>Diluir 1/10 con agua antes de usar (hasta 1x)</td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido <td>Nitrógeno líquido (-196 &deg; C) es un peligro de congelación. También se expandirá rápidamente al calentarse y no debe mantenerse en un recipiente herméticamente cerrado</td></tr></tbody></table>

purificación de adn de alto peso molecular genómico de oídio para long-read sequencing

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Los hongos oídio son un grupo de económicamente importantes patógenos fúngicos de plantas. Se sabe relativamente poco acerca de la biología molecular y la genética de estos patógenos, en parte debido a la falta de recursos genéticos y genómicos bien desarrolladas. Estos organismos tienen, genomas repetitivas grandes, que han hecho la secuenciación del genoma y montaje prohibitivamente difícil. A continuación, describimos métodos para la recogida, extracción, purificación y control de calidad de la evaluación de ADN genómico de alto peso molecular a partir de especies de moho uno pulverulentos, Golovinomyces cichoracearum. El protocolo descrito incluye la rotura mecánica de las esporas, seguido de una extracción de ADN genómico optimizado fenol / cloroformo. Un rendimiento típico fue de 7 g de ADN por cada 150 conidios mg. El ADN genómico que se aísla usando este procedimiento es adecuado para la secuenciación de larga leer (es decir,&gt; 48,5 kpb). medidas de control de calidad para asegurar el tamaño, el rendimiento y pureza del ADN genómico son tambiéndescrito en este método. La secuenciación del ADN genómico de la calidad descrita aquí permitirá que para el montaje y la comparación de varios genomas oídio, que a su vez dará lugar a una mejor comprensión y un mejor control de este patógeno agrícola.

Un ejemplo representativo de 60 ng de ADN genómico purificado de G. cichoracearum ejecuta en un gel de agarosa usando electroforesis en gel y usando electroforesis en gel de campo pulsado se muestra en las Figuras 1 y 2, respectivamente. preparaciones de ADN genómico que pasan, marginalmente aprobación y rechazo del control de calidad se representan. preparaciones de ADN genómico que pasan completamente el control de calidad son...

Aquí se describe un método para la extracción, purificación y control de calidad del ADN genómico del patógeno fúngico biotrófico obligado, el mildiú polvoriento, para su uso en la secuenciación del genoma de lectura larga.

Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

El objetivo general de este protocolo es aislar ADN genómico de alto peso molecular a partir de conidios haploides de mildu blanco para la secuenciación del genoma con lecturas largas. Este método puede responder preguntas clave en el campo de la biología de hongos patógenos de plantas, como la estructura y composición de genomas difíciles de estudiar. La principal ventaja de esta técnica es que permite la extracción de ADN genómico de alta calidad a partir de un patógeno difícil de manipular.Para comenzar el experimento, retire rápidamente las bolas de acero de los criotubos con conidios utilizando un imán. Añada 700 microlitros de tampón de lisis a 65 grados Celsius y vortexee la solución durante cinco a 10 segundos. Después de cinco a 10 segundos, se forma una suspensión.Añada 300 microlitros de sarkosyl al 5% volumen en volumen, precalentado a 65 grados, e invierta suavemente cinco veces. Incube los tubos durante 30 minutos a 65 grados Celsius. Utilizando una punta de pipeta de gran orificio, transfiera toda la solución a un nuevo tubo microcentrífugo de dos mililitros.Añada un volumen de cloroformo-isoamil alcohol a la solución de lisis e invierta suavemente el tubo para mezcl

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Una metodología para aislar de alto peso molecular y ADN genómico de alta calidad de la comunidad microbiana del suelo se describe.

La extracción de ADN de alta molecular genómico de peso de los suelos y los sedimentos

Ofrecemos un protocolo mejorado para la extracción de ADN de alto peso molecular de tapetes microbianos hipersalinos. Las células microbianas son separados de la matriz de alfombra antes de la extracción y purificación del ADN. Esto mejora la concentración, calidad y tamaño de la DNA. El protocolo puede ser utilizado para otras muestras de refractario.

La extracción de ADN de alto peso molecular a partir de tapetes microbianos

Uso de la vía aérea fibrosis quística como un ejemplo, el manuscrito presenta un flujo de trabajo integral que comprende una combinación de enfoques de metagenómica y metatranscriptomic para caracterizar el microbiana y comunidades virales en muestras asociadas con animales.

Purificar el Impuro: Secuenciación metagenomes y Metatranscriptomes de complejos animales asociados a las muestras

Este artículo presenta un método sensible llamado Circle-Seq para purificar el ADN circular extracromosómico (eccDNA). El método abarca la purificación en columna, la eliminación del ADN cromosómico lineal restante, la amplificación en círculo rodante y la secuenciación de alto rendimiento. Circle-Seq es aplicable al cribado a escala genómica del ECCDNA eucariota y al estudio de la inestabilidad del genoma y la variación del número de copias.

La purificación de todo el genoma de ADN circular Extracromosómica a partir de células eucariotas

Se presentan la comparación y optimización de dos métodos de enriquecimiento de ADN organelar de plantas: centrifugación diferencial tradicional y fraccionamiento del gDNA total basado en el estado de metilación. Evaluamos la cantidad y calidad de ADN resultante, demostramos el rendimiento en secuenciación de próxima generación de lectura corta y discutimos el potencial de uso en la secuenciación de una molécula de larga lectura.

Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

Nanopore technology para secuenciación de biomoléculas tiene amplias aplicaciones en Ciencias de la vida, incluyendo la identificación de patógenos, supervisión de la seguridad del alimento, análisis genomic, metagenomic monitoreo ambiental y caracterización de bacterias resistencia a los antibióticos. En este artículo, el procedimiento de secuenciación de ADN de suelo de metagenómica para identificación de especies utilizando la tecnología de secuenciación nanopore es demostrado.

Secuencia de la DNA Nanopore para análisis de metagenómica suelo

Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia &gt; 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

El propósito de este protocolo es utilizar una combinación de computacional y de investigación del Banco para buscar nuevas secuencias que no se puede separar fácilmente de una secuencia Co purificador, que puede ser conocida sólo parcialmente.

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Secuencias de largo leer facilitan enormemente el montaje de genomas complejos y la caracterización de la variación estructural. Se describe un método para generar secuencias muy largas por plataformas de secuenciación basada en nanopore. El enfoque adopta una extracción de ADN optimizada seguida por las preparaciones de la biblioteca modificada para generar cientos de kilobases Lee con una cobertura moderada de células humanas.

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Extracción mejorada de ADN de bajo peso molecular de aguas residuales para una evaluación integral de la resistencia a los antimicrobianos 

Aprende a purificar ADN genómico de alto peso molecular de oídio para secuenciación de lecturas largas. Este método permite extraer ADN de alta calidad de conidias haploides y facilita el estudio de genomas fúngicos complejos en fitopatología.

Purificación de ADN de alto peso molecular genómico de oídio para Long-Read Sequencing

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