Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

El objetivo general de este método es utilizar rebanadas pulmonares cortadas con precisión, o PCLS, para visualizar la localización y el tráfico de diversos tipos de células inmunitarias en el pulmón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como los patrones de localización y migración de las células inmunitarias en el pulmón. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden visualizar varias interacciones en tejido ex vivo vivo que mantiene la arquitectura tridimensional del pulmón.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la localización y el tráfico de células inmunitarias durante la inflamación, también puede utilizarse para visualizar la contracción del tejido de la vía aérea y del músculo liso. Para obtener el tejido pulmonar, primero use tijeras para abrir la piel y el peritoneo desde la mitad del abdomen hasta la mandíbula de un ratón de seis a doce semanas de edad, y desplace los intestinos hacia un lado de la cavidad abdominal. Corte la vena cava inferior para drenar la sangre de los pulmones, y use la punta afilada de las tijeras para perforar el diafragma y permitir la expansión de la caja torácica.

A continuación, use pinzas para extraer manualmente las glándulas salivales y otros tejidos de la tráquea, y utilice pinzas finas para hacer una incisión en la tráquea en el lado anterior de la banda de cartílago más gruesa, lo suficientemente grande como para permitir que una aguja de calibre 20 penetre. Ahora deslice una aguja de calibre 20 de 1,5 pulgadas sobre un segmento de tubo de polietileno, y corte el tubo en un ángulo de aproximadamente 45 grados. Fije la aguja a una jeringa de un mililitro y aspire 0,8 mililitros de agarosa al 2% de punto de fusión bajo a 40 grados Celsius en la jeringa.

Una vez que todo el agarosa haya sido cargado, inserte el extremo biselado del tubo en la incisión e inyecte lentamente el agarosa en los pulmones. Sin mover la aguja ni la jeringa, sujete la jeringa con cinta adhesiva a la base de poliestireno para asegurar la aguja dentro de la tráquea, y coloque el animal en almacenamiento a 4 grados Celsius durante al menos 10 minutos. Una vez que el agarosa haya solidificado, use tijeras para extirpar cuidadosamente los pulmones y colóquelos en un platillo de tres centímetros que contenga PBS frío con hielo.

Luego gire el lóbulo para el corte de tejido de modo que la sección interna del pulmón que se conecta con la tráquea quede hacia abajo. Para cortar el tejido pulmonar, coloque primero una pequeña gota de gel adhesivo universal sin escurrimiento sobre el émbolo de una jeringa metálica, extendiendo el adhesivo en movimiento circular. Una vez aplicado todo el adhesivo, use pinzas para agarrar inmediata pero suavemente el lóbulo extirpado con la tráquea hacia abajo, y toque ligeramente el lóbulo sobre un tejido para eliminar el exceso de líquido.

Coloque cuidadosamente el lóbulo seco encima del émbolo y corte cualquier tejido sobrante que sobresalga del borde del émbolo. Mueva el émbolo hacia abajo de modo que los lados de la jeringa metálica suban y cubran el tejido, creando un pozo con el pulmón en la parte inferior del cilindro de la jeringa, que no tenga más de varios centímetros de profundidad. Sujete con cinta adhesiva la parte inferior de la jeringa para mantener el émbolo en su lugar.

Luego, vierta cuidadosamente agarosa al 2 % de baja fusión a 40 grados Celsius en la jeringa hasta que cubra ligeramente la parte superior del lóbulo, y rodee la jeringa metálica con un bloque refrigerante helado. Después de uno a dos minutos, coloque la jeringa con la muestra en el cortador automático y alinee la cuchilla nueva. A continuación, llene el tanque de tampón con PBS frío con hielo.

Alinee la unidad de accionamiento del motor paso a paso con la jeringa de la muestra y retire la cinta. Gire el interruptor a la posición de avance rápido hasta que la unidad de accionamiento del motor paso a paso toque ligeramente la parte posterior del émbolo. Ajuste el grosor del tejido, la sección continua individual, la oscilación y la velocidad en el cortador.

Luego, presione inicio y use una espátula delgada para recoger cada PCLS a medida que cae en el tanque de tampón, colocando las secciones en pozos individuales de una placa de 24 pozos que contiene PBS frío con hielo. Para la imagen estática de PCLS, transfiera las muestras de pulmón que contienen el área anatómica de interés a placas individuales de tres centímetros que contienen un mililitro de la mezcla de anticuerpos adecuada de interés. Después de 30 a 60 minutos sobre hielo con agitación y protegido de la luz, enjuague las secciones dos veces con un mililitro de PBS frío con hielo.

A continuación, agregue 50 microlitros de PBS en un nuevo platillo redondo de vidrio de tres centímetros de diámetro por cada muestra, y transfiera rápidamente las secciones a cada gota, manipulando suavemente los fragmentos de tejido para que queden extendidos uniformemente. Luego aspire el PBS con una pipeta, coloque una gota de medio de montaje a temperatura ambiente sobre el portaobjetos y cúbralo con un cubreobjetos de vidrio. Para obtener imágenes del tejido, coloque el platillo sobre la platina de un microscopio confocal bajo un objetivo de 20x y utilice la herramienta de mosaico para localizar y marcar los bordes del tejido en el modo envolvente convexa, con el fin de reducir el tiempo del escaneo de mosaico.

Luego, configure el rango de z-stack, asegurándose de que los rangos establecidos sean adecuados en varias áreas del corte, particularmente a lo largo de los bordes. Para la imagen de células vivas, después de 30 minutos de incubación en la mezcla de anticuerpos de interés, enjuague los cortes dos veces con un mililitro de Leibovitz 10 frío. A continuación, agregue 50 microlitros de Leibovitz 10 fresco en un compartimento de una cubreobjetos con cámara por muestra, seguido del traslado inmediato de cada PCLS al medio, manipulando suavemente los tejidos hasta que queden extendidos de forma plana.

Luego, use una pipeta para aspirar el medio de cada cámara y fije cada PCLS con un peso de platino. Añada cuidadosamente matriz extracelular recién preparada y enfriada con hielo sobre cada PCLS, teniendo cuidado de que el gel se coloque encima de las secciones de pulmón y de que las secciones no floten sobre el gel. Después de cinco minutos a 37 grados Celsius, transfiera el portaobjetos a una cámara precalentada del microscopio confocal ajustada a 37 grados Celsius bajo un objetivo de 20x.

Luego, configure el rango de z-stacks y de mosaicos según el intervalo deseado entre los cuadros, utilizando la herramienta de mosaico para delimitar el área de interés en el tejido, y la configuración de cuadrícula centrada para centrar la muestra en el campo de visión. Las células dendríticas convencionales de alto contenido de CD11b se localizan en el parénquima pulmonar, mientras que las células dendríticas convencionales positivas para CD103 residen principalmente alrededor de las vías respiratorias y en la zona subpleural. La tinción doble para CD88 y CD172a permite distinguir los macrófagos alveolares negativos para CD172a y positivos para CD88, de los macrófagos intersticiales positivos para CD172a y positivos para CD88, siendo estos últimos preferentemente localizados en el parénquima y no en la zona subepitelial.

La doble marcación para CD90.2, un marcador bien conocido de linfocitos T, y la proteína fluorescente TdTomato, un transgén bajo el control transcripcional de un factor de transcripción maestro necesario para la linfangiogénesis, facilita la identificación de estructuras linfáticas en el pulmón. Las células dendríticas convencionales positivas para CD103 se encuentran en varias áreas anatómicas, incluyendo el epitelio de las vías respiratorias que expresa CD324, los vasos linfáticos y la zona subpleural. El movimiento celular y las interacciones entre células pueden registrarse mediante imágenes de células vivas, como se acaba de demostrar.

Por ejemplo, en el experimento representativo, 16 horas después de la instalación oral de ova-LPS, se pueden observar claramente células dendríticas positivas para CD103 interactuando con linfocitos T específicos para ova transferidos adoptivamente durante un período de cuatro horas. Una vez dominadas, la preparación del tejido y las técnicas de corte pueden completarse en dos horas y media si se realizan adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar lograr una buena inflación pulmonar con agarosa y mantener posteriormente los cortes pulmonares lo más planos posible para la adquisición de imágenes.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como tratar los cortes pulmonares de precisión con acetilcolina o metacolina, para responder preguntas adicionales sobre la señalización de calcio y la contractilidad de las vías respiratorias en diversas condiciones de enfermedad. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar cortes pulmonares finos de precisión para visualizar la localización, el tráfico y las interacciones de las células inmunitarias en el pulmón.