Name: Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprenda a preparar rebanadas de pulmón de precisión en ratón para visualizar células dendríticas in vivo. Esta técnica permite estudiar la localización y migración de células inmunes en tejido pulmonar tridimensional.

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Agradecemos a Jeff Tucker, Erica Scappini, y Agnes Janoshazi por su ayuda con la microscopía, Ligon Perrow por su gestión de la colonia de ratones, y Jun Chen y Michael Sanderson para obtener ayuda con la máquina de cortar el tejido, y Michael Fessler y Derek Cain para la lectura crítica el manuscrito. Este trabajo fue financiado por la rama intramural del NIEHS, NIH (Zia ES102025-09), que a su vez está patrocinado por el Departamento de Salud y Servicios Humanos.

procedimientos experimentales con animales descritos en este documento fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de NIEHS (IACUC). 1. Pulmón Preparación <ol><li> Los ratones domésticos entre 6 y 12 semanas de edad en condiciones libres de patógenos específicos, de acuerdo con las directrices establecidas por los Comités de Cuidado y Uso de Animales institucional. NOTA: Imaged ratones pueden ser ingenuo, o tratada, dependiendo de los intereses específicos de cada investigador. A continuación, describimos la localización de células inmunes en los ratones no tratados previamente y en ratones tratados con 100 mg de ovoalbúmina (OVA) y 0,1 g de lipopolisacárido (LPS), utilizando solución salina tamponada con fosfato (PBS) como vehículo en un volumen total de 50! L. Para inculcar oropharyngeally OVA / LPS en las vías respiratorias, los animales fueron anestesiados con inhalación de isoflurano y verticalmente suspendidas por sus dientes con una banda de goma. La lengua se agarró suavemente con fórceps y se mantuvo a un lado para evitar que tragar, y 50 &amp; #181; L de la solución de OVA / LPS depositado en la parte posterior de la cavidad oral como se describió anteriormente 17. </li><li> La eutanasia del ratón con inyección intraperitoneal de pentobarbital sódico (100 mg / kg), y el pin del animal a una base de poliestireno. </li><li> Abra la cavidad abdominal con tijeras cortando la piel y el peritoneo desde la mitad del abdomen hasta la mandíbula. Tirar de los intestinos a un lado con fórceps o el borde romo de las tijeras y cortar la vena cava inferior para drenar la sangre desde los pulmones. Perforar el diafragma con la punta afilada de las tijeras para permitir la expansión de la caja torácica, teniendo cuidado de no cortar los pulmones. </li><li> glándulas salivares y otros tejidos claros lejos de la tráquea por el acaparamiento y el tejido manualmente tirando de él lejos de la tráquea subyacente con unas pinzas. Hacer una pequeña incisión en la tráquea en la cara anterior de la banda gruesa de cartílago utilizando unas pinzas finas o tijeras, teniendo cuidado de no cortar todo el camino a través de la traChea. La incisión será lo suficientemente grande como para permitir que una aguja 20 G pase a través. </li><li> Deslizar un 1,5 pulgadas, 20 aguja G sobre una sección de tubo de polietileno, dejando aproximadamente 1 cm de tubo más allá del extremo de la aguja. Corte el tubo en un ángulo de aproximadamente 45 ° para biselar el extremo, conecte la aguja a una jeringa de 1 ml, y la carga de la jeringa mediante la elaboración 0,8 ml de tibia (40 ° C) 2% de bajo punto de fusión de agarosa a través de la aguja. </li><li> Coloque el extremo del tubo en la incisión de la tráquea e inyectar lentamente la agarosa en los pulmones. Sin mover la aguja o jeringa, la cinta de la jeringa a la base de poliestireno para asegurar la aguja permanece en la tráquea. NOTA: Después de la inyección, los pulmones será más grande y se infla dentro del pecho. Los lóbulos derechos expanden primero, luego el lóbulo izquierdo. Si sólo hay un lóbulo se expande, la aguja se ha insertado demasiado profundamente (pasado el bronquio), y será necesario para tirar de él hacia fuera ligeramente antes de proceder. Esta parte de laprocedimiento que hay que hacer con relativa rapidez, antes de que la agarosa comienza a solidificarse. </li><li> Coloque el ratón, con la base y la jeringa aún insertada en la tráquea, en una habitación fría o en el refrigerador durante al menos 10 min. Si es necesario, el animal puede mantenerse allí por hasta varias horas, incluso si proceder a la migración de células de imagen por microscopía de vídeo. </li><li> Una vez que el ratón es frío, escindir cuidadosamente los pulmones de agarosa-inflado con unas tijeras, y colocarlos en una placa de 3 cm con PBS enfriado en hielo. Mantener en hielo. </li><li> Elige el lóbulo deseada para cortar en rodajas de tejido (por ejemplo, el lóbulo superior derecho). Asegúrese de que la parte interior de los pulmones (donde se conecta a la tráquea) está boca abajo en el plato. NOTA: El lóbulo utiliza y su orientación en el émbolo determinará el tamaño de los vasos y las vías respiratorias que serán visibles. La orientación se describe aquí es ideal para la visualización de las vías respiratorias grandes, y el parénquima. Los ratones tienen un gran lóbulo izquierdo y cuatro lóbulos más pequeños de la derecha. porformación de imágenes PCLS después de la introducción de los alergenos en los pulmones a través de la orofaringe o aspiración intranasal, el lóbulo superior derecho está típicamente seccionado, en parte debido a que es un tamaño conveniente, pero también porque los agentes inhalados dispersar uniformemente dentro de ella. Sin embargo, otros lóbulos, especialmente el lóbulo izquierdo, también pueden ser estudiados. Al comparar las cepas de ratón o tratamientos, es importante comparar el mismo lóbulo. </li></ol> 2. Pulmón rebanar NOTA: rebanadas utilizando una máquina de cortar automatizado, metal de refrigeración de bloque, el émbolo y la jeringa de metal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. <ol><li> Ponga una pequeña gota de todo uso, sin plazo pegamento gel sobre el émbolo y separar el pegamento en un movimiento circular, teniendo cuidado de no dejar que el pegamento toque los lados de la jeringa de metal. Si el pegamento toca los lados de la jeringa, se pega la jeringa y el émbolo juntos. </li><li> Inmediatamente después de cubrir el émbolo con pegamento, agarre suavemente ellóbulo extirpado con pinzas con el lado tráquea hacia abajo, DAB en un tejido para eliminar el exceso de líquido, y que lo coloque en la parte superior del émbolo. Se quita tejido adicional que se extiende más allá del borde del émbolo. </li><li> Mover el émbolo hacia abajo de manera que los lados de la jeringa de metal se mueven hacia arriba y sobre el tejido, creando un bien con el de pulmón, pegada en la parte inferior, no más de varios centímetros de profundidad. Cinta alrededor de la parte inferior de la jeringa de metal para mantener esta posición en su lugar. </li><li> Con cuidado, vierta 2% de agarosa de baja fusión a 40 ° C en el pozo por lo que sólo cubre la parte superior del lóbulo. </li><li> Rodea la jeringa de metal con el bloque de refrigeración enfriado con hielo y enfriar el lóbulo y agarosa para 1 - 2 min. NOTA: Un enfriamiento de tiempo más corto de la agarosa que rodea el tejido podría conducir a la desintegración de la agarosa durante el corte, lo que podría resultar en un PCLS desigual cortar. </li><li> Cargar la jeringa ejemplar en la máquina de cortar automatizado y llene el tanque tampón con PBS enfriado en hielo. alinear el<html> el paso de accionamiento del motor con la jeringa de muestra y retirar el trozo de cinta de la parte inferior. Coloque el interruptor en la posición de avance rápido (FF) hasta que la unidad de motor paso a paso que toque la parte posterior del émbolo. </li><li> Alinear la hoja fresca con la jeringa de la muestra. espesor Set tejido, continua / rebanada única, la oscilación y la velocidad en la máquina de cortar. Por ejemplo, el espesor del tejido: 150 m, corte continuo (cont.), La oscilación: 9, y la velocidad: 3 - 4. Pulse comienzo. Los ajustes anteriores necesitan ser ajustados a las especificaciones máquina de cortar automatizados específicos. </li><li> Usando una espátula fina o pincel, recoger el PCLS uno a la vez a medida que caen en el tanque tampón y los colocan en una placa de 24 pocillos que contenía PBS enfriado en hielo. NOTA: Es importante mantener las rebanadas con el fin de mantener la coherencia entre los experimentos. Aunque cada pulmón es diferente dependiendo de la edad, sexo y peso, el 10 de rebanada, por ejemplo, generalmente rendimientos de tamaño similar vías respiratorias. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 3. tinción de anticuerpos <ol><li> Diseño de un panel de anticuerpos marcados con fluorescencia en función del tipo de célula de interés, teniendo en cuenta el potencial solapamiento espectral fluorescente y las capacidades de detección del microscopio. NOTA: Como un ejemplo, un panel para la detección subconjunto DC es el siguiente: CD11c / alfa X integrina - BrilliantViolet (BV) 605 (Excitación: 405 nm, pico de emisión: 605 nm), CD324 / E-cadherina - Alexa 488 (AF488 ) (excitación: 488 nm, emisión de pico: 519 nm), CD88 / C5Ra1 - ficoeritrina (PE) (excitación: 561 nm, emisión de pico: 578 nm), CD103 / alfa E integrina - aloficocianina (APC) (excitación: 633 nm , pico de emisión: 660 nm). Fluorescencia herramientas de visualización espectrales (ver Lista de Materiales) son útiles para diseñar paneles. </li><li> Hacer una cóctel de anticuerpos que contiene los anticuerpos deseados. <ol><li> Para imágenes PCLS estático, añadir 800 l de tampón de tinción, 100! L Fc blocker, 50! L de suero de ratón normal, y 50! L de suero de rata normal a un ml microcentrifu 1,5tubo gación para un volumen total de 1 ml. Para imágenes de células vivas, utilice 800 medio de l Leibovitz (1x) que contiene 10% de FBS (Leibovitz-10) en lugar de tampón de tinción. </li><li> Añadir anticuerpos para ajustar una concentración final deseada de cada anticuerpo. Transferir la solución de anticuerpo a un plato de 3 cm, y mantener en la oscuridad hasta que esté listo para su uso. NOTA: Las concentraciones finales necesitan ser optimizados para cada anticuerpo individuo (por lo general de 1 - 5 mg / ml). </li></ol></li><li> Elegir un PCLS con un área anatómica de interés, tales como las vías respiratorias grandes o periferia del pulmón, y el lugar en el plato 3-cm que contiene 1 ml solución de anticuerpo. </li><li> PCLS la mancha en la oscuridad, en el hielo, mecedoras lentamente durante 30 o 60 min. </li><li> Para la imagen PCLS estática, vaya a la sección 4. Para imágenes de células vivas, pase a la sección 5. </li></ol> 4. estática de imagen de PCLS <ol><li> Después de 60 min de incubación de PCLS con anticuerpos, eliminar la solución de anticuerpo a partir del plato y enjuague tque rebana dos veces con 1 ml de hielo frío PBS. </li><li> Pipetear 50 l de PBS en un 3 cm plato de fondo redondo de vidrio. Usando una espátula o pincel, transferir la PCLS manchadas a la baja, manipular con cuidado el corte hasta que quede plano y hacia fuera. Retire el PBS con una pipeta. El corte debe estar lo más plana posible. Los procedimientos anteriores deben realizarse rápidamente para evitar photobleaching. </li><li> Colocar 1 gota de medio de montaje temperatura ambiente sobre la rebanada y soltar suavemente un cubreobjetos de vidrio en el pozo de la placa. Mantenga PCLS en la oscuridad a 4 ° C durante hasta una hora antes de formación de imágenes. </li><li> Cuando se ve bajo un microscopio confocal, utilice un objetivo 20X (ver Lista de Materiales). Utilice la herramienta de &quot;baldosas&quot; para localizar y marcar los bordes del tejido en el ajuste &quot;casco convexo&quot;. Esto ayudará a reducir el tiempo de la exploración del azulejo. </li><li> Durante el ajuste del rango de z-stack, verificar en múltiples áreas de la rebanada, especialmente a lo largo de los bordes, que los intervalosson apropiados. NOTA: El Z-rango probable tendrá que ser mayor que el espesor del tejido en sí, ya que es muy difícil conseguir que el tejido se encontraba completamente plana. Por ejemplo, con un PCLS gruesa 150! M, probablemente tendrá que ser fijado a 200 el rango z-stack - 250 micras para acomodar los golpes y las curvas de la rebanada. Dependiendo del rango de z-pila y el tamaño del tejido, cada exploración de pulmón completo tomará entre 7-12 h con un objetivo 20X. Cada pulmón es único y la configuración se debe ajustar para cada experimento. </li></ol> 5. Imágenes de células vivas de PCLS <ol><li> Después de 30 min de incubación de PCLS con anticuerpos, eliminar la solución de anticuerpo a partir del plato y enjuagar las rodajas dos veces con 1 ml fríos Leibovitz-10. </li><li> Pipeta fresco 50 l Leibovitz-10 en una ranura de un cubreobjetos cámaras (8 ranuras). Use una espátula para transferir la PCLS al medio, manipular con cuidado hasta que el corte es plana y extenderse. Los procedimientos anterioresnecesario llevar a cabo rápidamente para evitar photobleaching. </li><li> Eliminar el medio 50 l usando una pipeta. El corte está mintiendo a ser lo más plana posible. NOTA: Es aceptable si los bordes de la rodaja estén levantados verticalmente contra la pared de la cámara. Además, si está disponible, un peso de platino metal puede ser utilizado para anclar la rebanada antes de proceder al siguiente paso. Ver la Lista de materiales adjunta de un ejemplo de alambre de platino que se puede cortar y doblar en pequeñas pesas. </li><li> En un 4 ° C habitación fría, mezclar 100 l de crecimiento reducido factor, fenol matriz extracelular libre de rojo con 100! L Leibovitz-10. Utilice puntas de pipeta preenfriados para esto, o la matriz extracelular se solidificará en la punta. NOTA: Esta proporción de matriz y medio (1: 1) crea un gel suficientemente denso para mantener los PCLS en condiciones de cultivo de tejidos. </li><li> pipetear suavemente la matriz para mezclar, y la pipeta con cuidado en la parte superior de la PCLS, asegurándose de que el gel va en la parte superior de la lung rebanada, y que la rebanada no flota en la parte superior del gel. El gel debe trabajar como un peso, el anclaje de los PCLS hacia abajo sobre la parte inferior de la placa. </li><li> transferir con cuidado el cubreobjetos con cámaras a una incubadora a 37 ° y dejar que la matriz se solidifique durante ~ 5 min. </li><li> Transferir todo el cubreobjetos de cámara en la etapa de pre-calentado de un microscopio confocal. Mantener la cámara a 37 ° C en toda la imagen. No se requiere suministro de CO 2 durante la incubación de células cuando se utiliza medio de Leibovitz. </li><li> Establecer el rango de gama Z-pila y el azulejo basado en el intervalo deseado entre bastidores. Cuando se ve bajo un microscopio confocal, utilice un objetivo 20X (ver Lista de Materiales). Utilice la herramienta de &quot;baldosas&quot; para denotar el área de interés en el tejido, usando el ajuste &quot;rejilla centrada&quot; (por ejemplo, una cuadrícula de 2x2 centrada). </li><li> Durante el ajuste del rango de z-stack, verificar en múltiples áreas de la rebanada que los intervalos son apropiados. NOTA: El zrange probable será igual al espesor del tejido. Cada pulmón es único y la configuración se debe ajustar para cada experimento. azulejos 2x2 y 10 z-pilas generalmente resultará en ~ 1 marco / 2 min. Asegúrese de que la función de enfoque automático se activa antes de iniciar el experimento para minimizar xy y z-deriva durante el período de formación de imágenes. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

El protocolo descrito aquí fue desarrollado originalmente para visualizar las ubicaciones de dos subconjuntos de CDC dentro del pulmón. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar fácilmente para estudiar muchos tipos de células diferentes, mientras que el mantenimiento de la viabilidad celular y la arquitectura tridimensional de los pulmones. Esta última característica es una ventaja importante sobre los sistemas de cultivo celular y facilita la identificación de tipos de células raras. El método se basa en la generac...

Tras la inhalación de los estímulos pro-inflamatorias tales como lipopolisacárido (LPS), hay un movimiento coordinado de las células inmunes en, dentro de, y desde el pulmón. Por ejemplo, los neutrófilos se reclutan rápidamente en el parénquima pulmonar y de las vías respiratorias. Además, algunas células presentadoras de antígeno profesionales conocidas como células dendríticas convencionales (CDC) se someten a un patrón de migración relativamente complejo 1, 2. CDC se pueden identificar utilizando la citometría de flujo, basadas en parte en su pantalla del marcador de la superficie, CD11c. Subconjuntos distintos de DCs se pueden distinguir por la expresión en la superficie diferencial de CD103 y CD11b 3. Al adquirir antígeno inhalado, algunos CDCs salen del pulmón y migran a través de los vasos linfáticos a los nodos linfáticos pulmonares de drenaje (LNS) donde presentan péptidos de antígeno específico de células T 4. Este es un evento temprano crítico en la iniciación de r inmune adaptativaesponses. Por razones desconocidas, sin embargo, no todos los CDCs que adquieren antígenos inhalados salen del pulmón, y muchas de estas células permanecen en ese órgano durante varios meses 5, 6. Esta observación puede explicarse en parte por la ascendencia de desarrollo de estas células porque CD11c derivadas de monocitos + células que carecen del receptor de quimioquinas, CCR7, son incapaces de migrar a los LN regionales 7, 8. Parece probable que el potencial de migración de los CDC también está determinada, al menos en parte, por su posición anatómica dentro del pulmón. Sin embargo, la localización precisa de estas diferentes poblaciones de CDC en el pulmón no se caracteriza completamente. Un mejor conocimiento de la localización de las células inmunes en el pulmón, y de las moléculas que lo dirigen, es necesaria para una mejor comprensión de cómo se activa el sistema inmunológico del pulmón. PCLS se están aumentandoly utiliza como un enfoque ex vivo para visualizar posicionamiento celular y interacciones célula-célula, mientras se mantiene la integridad estructural de la arquitectura pulmonar 9, 10. PCLS se han utilizado para estudiar los pulmones de muchas especies, incluyendo ratones, vacas, monos, ovejas, caballos y seres humanos 11. Una ventaja principal de esta técnica es que aproximadamente 20 rebanadas se pueden preparar a partir de un único lóbulo de un pulmón de ratón, lo que reduce el número de animales necesarios para los experimentos individuales. Prácticamente todos los tipos de células inmunes, incluyendo DCs, macrófagos, neutrófilos y células T, están presentes en PCLS y mantener sus estructuras normales. PCLS también se puede utilizar para estudiar la señalización del calcio y de la contractilidad de las células de las vías respiratorias y el músculo liso después del tratamiento con la acetilcolina 12 o metacolina 13. En este enfoque, sólo una pequeña porción del pulmón es unaalyzed microscópicamente, pero un estudio informó que las mediciones de contracción de las vías respiratorias en PCLS varían sólo alrededor del 10% a partir de la rebanada de cortar, y esta variación es comparable a la observada usando pruebas de función pulmonar en animales intactos 14. Otros investigadores han utilizado PCLS como un enfoque ex vivo para estudiar los cambios en la expresión de citocinas y marcadores de la superficie celular después de la incubación con LPS 15. PCLS también se han utilizado en un modelo ex vivo de la vasoconstricción pulmonar hipóxica en pequeñas arterias intra-acinares. Estos vasos se encuentran en la parte del pulmón que no puede ser alcanzado mediante otros procedimientos, incluyendo las grabaciones de segmentos o análisis de los vasos subpleurales 16 arteriales diseccionados. Nuestro laboratorio ha utilizado principalmente PCLS para visualizar la localización de células inmunes en el tejido pulmonar en vivo en estado estacionario, y tras un estímulo inflamatorio in vivo. Los procedimientos que hemos desarrollado para esto son las siguientes.

<table><tbody><tr><td>Ratones C57BL/6J</td><td>Laboratorio Jackson 000664</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ratones transgénicos Prox1-TdTomato&nbsp;</td><td>Laboratorio Jackson</td><td>018128</td><td>B6; 129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J</td></tr><tr><td>OT-II Ratones transgénicos específicos de OVA, TCR x Nur77-GFP</td>, <td>Jackson Laboratory 004194</td><td>, 016617</td><td>B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J&nbsp;</td></tr><tr><td>Ratones knock-out Rag1</td><td>Jackson Laboratory</td><td>002216</td><td>B6.129S7-Rag1tm1Mom/J</td></tr><tr><td>Ovoalbúmina, Endo Baja, Purificada</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LS003059</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacáridos de Escherichia coli</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de polietileno (no estéril) 100 pies</td><td>BD Diagnostic Systems</td><td>427421</td><td>0,86 mm de diámetro interior, 1,27 mm de diámetro exterior</td></tr><tr><td>GeneMate Sieve GQA Low Melt</td><td>Agarose BioExpress</td><td>E-3112-125</td><td>solución al 2% disuelta en PBS a 70 & deg; C y se mantuvo a 40 &deg;C.</td></tr><tr><td>Compresstoma VF-300</td><td>Instrumentos de Precisión, Inc.</td><td>VF-300</td><td></td></tr><tr><td>Hoja de afeitar de acero inoxidable de doble filo</td><td>Ciencias de la microscopía electrónica</td><td>72000</td><td>Desechable; 250/caja. Se debe cambiar la cuchilla para cada pulmón.</td></tr><tr><td>Krazy Glue All Purpose Instant Gel</td><td>VWR</td><td>500033-484</td><td>Comúnmente disponible por $3/tubo en farmacias locales&nbsp;</td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium, sin rojo fenol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21083027</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal para ratas (NRS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de ratón (NMS)</td><td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td><td>015-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de tinción</td><td>hecho en casa</td><td>N/A</td><td>PBS con 0.5% albúmina sérica bovina, 0.1% NaN3, pH 7.4</td></tr><tr><td>Fc Bloqueador (anticuerpos anti-CD16/32)</td><td>Hecho en casa</td><td>N/A</td><td>Supernadante de línea celular de hibridoma cultivado 2.4G2</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11b eFluor 450</td><td>eBioscience</td><td>48-0112-80</td><td>Anti-ratón CD11b eFluor 450 (clon: M1/70)&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11c Brilliant Violet 605</td><td>BioLegend</td><td>101237</td><td>Brilliant Violet 605 anti-ratón CD11c (clon: M1/70)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11c Phycoerythrin</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-82</td><td>PE conjugado anti-ratón CD11c (clon: N418)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD11c Aloficocianina</td><td>BD Phamingen</td><td>550261</td><td>anti-ratón marcado con APC CD11c 9clon: HL3)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD88 Ficoeritrina</td><td>BioLegend</td><td>135806</td><td>PE anti-ratón CD88 (clon: 20/70)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD103 Aloficocianina</td><td>eBioscience</td><td>17-1031-82</td><td>Anti-ratón CD103 APC (clon: 2E7)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD90.2/Thy1.2 eF450</td><td>eBioscience</td><td>48-0902-82</td><td>Anti-ratón CD90.2 eFluor 450 (clon: 53-2.1)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD172a/Sirp1a Aloficocianina</td><td>eBioscience</td><td>17-1721-82</td><td>Anti-ratón CD172a APC (clon: P84)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD324 Violeta Brillante 421</td><td>BD Horizon</td><td>564188</td><td>BV421 ratón anti-E Cadherin (clon: 5E8 también conocido como 5E8-G9-B4)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD324 Alexa Fluor 488</td><td>eBioscience</td><td>53-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clon: DECMA-1)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD324 Alexa Fluor 647</td><td>eBioscience</td><td>51-3249-82</td><td>Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clon: DECMA-1)</td></tr><tr><td>Placas de micropocillos con fondo de vidrio Placa de Petri de 35 mm, Micropocillo de 14 mm, Nº 1.5 cubreobjetos</td><td>MatTek Corperation</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Vitrina con cámara</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>155411PK&nbsp;</td><td>Paquete de 16</td></tr><tr><td>Cubreobjetos de 15 mm, n.º 1,5 de espesor de vidrio</td><td>MatTek Corperation</td><td>PCS-1.5-15</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de platino desnudo</td><td>World Precision Instruments</td><td>PTP201</td><td>0,020" (0,5 mm) de diámetro cortado en trozos de ~1 cm de largo y doblado en forma de "L"</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P36934</td><td>Mantener a 4 & deg; C, calentar a la temperatura ambiente antes de usar.</td></tr><tr><td>Matrigel Factor de Crecimiento Reducido (GFR) Matriz de Membrana Basal, Libre de Fenol Rojo, *Libre de LDEV</td><td>Microscopio</td><td></td> láser multifotónico Corning 356231 <td></td></tr><tr><td>Zeiss 880</td> Software <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Zen Black versión 8.1, 2012 (Zeiss)</td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 20X/0.8 M27 objetivo presta</td><td>Carl Zeiss</td><td>420650-9901-000</td><td></td></tr></tbody></table>

precisión de corte pulmón de ratón rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

Precision-cut Mouse Lung Slices to Visualize Live Pulmonary Dendritic Cells

La inhalación de alérgenos y patógenos provoca múltiples cambios en una variedad de tipos de células inmunes en el pulmón. La citometría de flujo es una técnica poderosa para el análisis cuantitativo de proteínas de superficie celular sobre las células inmunes, pero no proporciona información sobre los patrones de localización y migración de estas células dentro del pulmón. Del mismo modo, los ensayos de quimiotaxis se pueden realizar para estudiar el potencial de las células para responder a factores quimiotácticos in vitro, pero estos ensayos no reproducen el complejo entorno del pulmón intacto. En contraste con estas técnicas antes mencionadas, la ubicación de distintos tipos de células dentro del pulmón puede ser visualizado fácilmente mediante la generación de corte de precisión de pulmón rebanadas (PCLS), la tinción con anticuerpos disponibles comercialmente, marcado con fluorescencia, y la visualización de las secciones por microscopía confocal. PCLS se pueden utilizar tanto para vivir y fijan el tejido pulmonar, y las rodajas pueden abarcar áreas tan grandes como una sección transversal de un lóbulo completo. Hemos utilizado este protocolo para visualizar correctamente la localización de una amplia variedad de tipos de células en el pulmón, incluyendo distintos tipos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T y células B, así como células estructurales tales como linfático, endotelial, y células epiteliales. La capacidad de visualizar las interacciones celulares, tales como las que existen entre las células dendríticas y las células T, en el tejido pulmonar en vivo, tridimensional, puede revelar cómo las células se mueven dentro del pulmón e interactúan uno con el otro en el estado estacionario y durante la inflamación. Por lo tanto, cuando se utiliza en combinación con otros procedimientos, como la citometría de flujo y la PCR cuantitativa, PCLS puede contribuir a una comprensión global de eventos celulares que subyacen en las enfermedades alérgicas e inflamatorias del pulmón.

Para identificar la ubicación de dos subconjuntos de DC, CD11b CDCs hi y CD103 + CDC, PCLS de ratones C57BL / 6 fueron cortadas y teñidas con anticuerpos monoclonales (mAbs) específicos para CD11c, CD88, CD103, y CD324 (E-cadherina). Los anticuerpos frente a células epiteliales de las vías respiratorias mancha CD324, CD88 y se visualiza en los macrófagos y neutrófilos, pero no CDCs 8. Esto nos permitió distinguir CDCs de CD11c + ma...

Se describe un método para generar la precisión de corte de pulmón rebanadas (PCLS) y la inmunotinción ellos para visualizar la localización de diversos tipos de células inmunes en el pulmón. Nuestro protocolo se puede extender a visualizar la ubicación y la función de muchos tipos celulares diferentes bajo una variedad de condiciones.

Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

Inhalation of allergens and pathogens elicits multiple changes in a variety of immune cell types in the lung. Flow cytometry is a powerful technique for ...

El objetivo general de este método es utilizar rebanadas pulmonares cortadas con precisión, o PCLS, para visualizar la localización y el tráfico de diversos tipos de células inmunitarias en el pulmón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunología, como los patrones de localización y migración de las células inmunitarias en el pulmón. La principal ventaja de esta técnica es que se pueden visualizar varias interacciones en tejido ex vivo vivo que mantiene la arquitectura tridimensional del pulmón.Aunque este método puede proporcionar información sobre la localización y el tráfico de células inmunitarias durante la inflamación, también puede utilizarse para visualizar la contracción del tejido de la vía aérea y del músculo liso. Para obtener el tejido pulmonar, primero use tijeras para abrir la piel y el peritoneo desde la mitad del abdomen hasta la mandíbula de un ratón de seis a doce semanas de edad, y desplace los intestinos hacia un lado de la cavidad abdominal. Corte la vena cava inferior para drenar la sangre de los pulmones, y use la punta afilada de las tijeras para perforar el diafragma y permitir la expansión de la caja torácica.A continu

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Disociar las células de tipos específicos de tejido requiere de parámetros específicos para la agitación del tejido para obtener un alto volumen de células viables, cultivables. El Miltenyi gentleMACS disociador optimiza esta tarea con un protocolo simple y práctico. En esta publicación, el uso de este aparato en el tejido pulmonar se explica.

La preparación estandarizada de un solo suspensiones de células de tejido pulmonar de ratón con el disociador gentleMACS

Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.

No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo

Una preparación altamente purificada de células dendríticas del pulmón del ratón se describe. Especial énfasis se da al aislamiento de subgrupo de células dendríticas convencionales.

Aislamiento de células dendríticas del pulmón de ratón

El nuevo protocolo reportados en el presente estudio permite la detección selectiva de metástasis pulmonares en la celda de resolución única en ratones por...

Visualización mejorada de metástasis pulmonares en la Resolución sola célula en ratones por Combinada<em&gt; In-situ</em&gt; La perfusión del tejido pulmonar y X-Gal tinción de<em&gt; LacZ</em&gt;-Etiquetados células tumorales

Este video describe la preparación de la suspensión de células pulmonares de ratón para el análisis de citometría de flujo para estudiar la expresión de PD-L1 de las células de adenocarcinoma de pulmón.

Preparación del pulmón de ratón para la citometría de flujo: generación de suspensión celular a partir de tejido pulmonar para el análisis de citometría de flujo

Teniendo en cuenta el principio 3R, están evolucionando los modelos respiratorios como alternativas a los estudios en animales. Especialmente para la evaluación del riesgo de las sustancias respiratorias, existe una falta de ensayos adecuados. Aquí, describimos el uso de cortes de pulmón humano de precisión de corte para la evaluación de sustancias aerotransportadas.

Evaluación de la citotóxica y efectos inmunomoduladores de sustancias en lonchas de pulmón humano de precisión de corte

Aquí se presenta un protocolo para preservar la contractilidad vascular del tejido pulmonar murino PCLS, lo que resulta en una imagen tridimensional sofisticada de la vasculatura pulmonar y las vías respiratorias, que se puede preservar hasta por 10 días que es susceptible a numerosos procedimientos.

Cortes pulmonares de corte de precisión como herramienta eficiente para estudios ex vivo de estructura de vasos pulmonares y contractilidad

En este estudio, presentamos un protocolo eficaz y reproducible para aislar las poblaciones inmunes del sistema respiratorio murino. También proporcionamos un método para la identificación de todas las células inmunes innatas y adaptativas que residen en los pulmones de ratones sanos, utilizando un panel de citometría de flujo basado en 9 colores.

Análisis citométrico de flujo para la identificación de las células inmunes innatas y adaptativas del pulmón murino

El presente protocolo describe la preparación y utilización de cortes pulmonares cortados con precisión en ratones para evaluar la contractilidad del músculo liso arterial intrapulmonar y de las vías respiratorias en un entorno casi in vivo .

Utilizando la rebanada pulmonar cortada con precisión para estudiar la regulación contráctil de las vías respiratorias y el músculo liso arterial intrapulmonar

Aquí, describimos un protocolo simple y económico para realizar una cuantificación no sesgada de la densidad microvascular pulmonar para tejido pulmonar de ratones enteros utilizando la tinción única de Isolectin B4.

Cuantificación de la densidad microvascular pulmonar en ratones a través de los lóbulos

Aprenda a preparar rebanadas de pulmón de precisión en ratón para visualizar células dendríticas in vivo. Esta técnica permite estudiar la localización y migración de células inmunes en tejido pulmonar tridimensional.

Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

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