La utilización de receptores de etiquetado pHluorin de Seguimiento de localización subcelular y el Tráfico

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

El objetivo general de este método de imágenes de fluorescencia es monitorear los cambios en el tráfico de proteínas de membrana y la distribución intracelular. Este método proporciona información sobre los cambios en el tráfico de proteínas, como el efecto de las mutaciones genéticas o los agentes farmacológicos en la tasa de entrega de vesículas y la expresión de proteínas en la superficie celular. La principal ventaja de esta técnica es que las mediciones se pueden realizar rápidamente, a alta resolución, en tiempo real, sin destruir la muestra.

48 horas antes de la toma de imágenes, las células de neuroblastoma 2A de ratón se transfectan con una construcción plásmida que contiene SEP, un fluoróforo sensible al pH incorporado en la región extracelular de la proteína de interés. Cuando las células transfectadas estén listas para la obtención de imágenes, con fluorescencia de reflexión interna total o microscopía TIRF, agregue dos mililitros de solución extracelular de pH 7.4 o ECS a las células. Coloque una antena parabólica de celdas en la platina de traslación y utilice soportes de platina para asegurar la antena en su lugar.

En el modo de epifluorescencia, enfoque el microscopio y localice las células transfectadas fluorescentes. Las células permanecerán enfocadas en varios planos de enfoque. Localice celdas individuales y aisladas para continuar con TIRF.

En el programa de imágenes, establezca el tiempo de exposición en 200 milisegundos y optimice la intensidad de fluorescencia configurando la ganancia EM. Convierta el rayo láser en TIRF utilizando el motor paso a paso para trasladar el rayo a través del objetivo de forma escalonada. A medida que se acerca el ángulo crítico, el haz se trasladará visiblemente a través del borde de la antena hasta que converja en el punto de reflexión interna total en el plano de la muestra, momento en el que el haz ya no es visible a lo largo del borde de la antena.

Verifique que las celdas estén en modo TIRF ajustando la perilla de enfoque. En TIRF, solo se puede enfocar un plano de células, produciendo una imagen altamente definida con alta resolución de la membrana plasmática. Para comenzar este procedimiento, localice las células individuales transfectadas sanas en el plano de imagen.

Adquiera una imagen enfocada de las células a pH 7.4. Los receptores marcados con SEP en la membrana plasmática y el retículo endoplásmico deben ser visibles. Bloquee rápidamente el rayo láser para que no llegue a la muestra para evitar el fotoblanqueo.

Utilice un software de imágenes de microscopio capaz de registrar múltiples ubicaciones XY para registrar las posiciones de las etapas correspondientes a cada celda. De esta manera, capture imágenes de 20 a 30 celdas por plato mientras usa el software para registrar la posición de cada celda. Una vez recogidas todas las imágenes celulares a pH 7,4, retire manualmente el ECS de pH 7,4 pipeteando sin tocar la placa.

Agregue con cuidado dos mililitros de pH 5.4 ECS al plato y espere 10 minutos. Durante este tiempo, guarde las imágenes adquiridas anteriormente. En el conjunto idéntico de condiciones utilizadas para recopilar imágenes a pH 7,4, mueva la etapa a cada posición guardada y adquiera una imagen de la misma célula a pH 5,4.

Las células deberían tener un aspecto menos definido, ya que toda la fluorescencia detectada se origina en receptores marcados con SEP confinados en el retículo endoplásmico. Guarde las imágenes de celda de pH 5.4. Para obtener imágenes de inserciones de vesículas individuales, primero reemplace el medio de crecimiento de las células transfectadas con dos mililitros de pH 7.4 ECS.

A continuación, coloque la placa de células transfectadas en la platina del microscopio y utilice soportes de platina para asegurar la placa en su lugar. Enfoque una sola celda en TIRF como se demostró anteriormente. Si está equipado, configure el enfoque automático para que el enfoque no se desvíe durante el período de imagen.

Grabe una serie de 1.000 fotogramas capturando imágenes de forma continua a una velocidad de fotogramas de 200 milisegundos. Las ráfagas de fluorescencia serán visibles durante este tiempo, lo que corresponde a las vesículas de tráfico de pH bajo que se fusionan con la membrana plasmática, exponiendo la PSI al pH extracelular 7,4. Para comenzar el análisis de la fluorescencia SEP para determinar la localización subcelular, abra las imágenes celulares utilizando un software de análisis de imágenes como ImageJ.

Reste el fondo de las imágenes de pH 5,4 y pH 7,4 utilizando el ajuste de bola rodante. Usando el umbral basado en la intensidad para cuantificar la fluorescencia de una sola célula a pH 7.4, primero seleccione la imagen, ajuste y umbral. A continuación, seleccione manualmente una región de interés alrededor de la celda.

Con la función de medición incorporada en la pestaña Analizar, mida el área de celda, la intensidad media y la densidad integrada. Repita estas mediciones para la misma celda a pH 5.4. Una vez obtenida la densidad integrada para las imágenes celulares a pH 7,4 y 5,4, se calcula la densidad integrada de la membrana plasmática restando el valor de pH 5,4 del valor de pH 7,4.

La diferencia corresponde al número relativo de receptores en la membrana plasmática dentro de la región de excitación TIRF. Como medida del tráfico, calcule el porcentaje relativo de receptores marcados con SEP ubicados en la membrana plasmática en comparación con los receptores restantes visibles en el volumen de excitación de TIRF dividiendo la densidad integrada de la membrana plasmática por la densidad integrada total a pH 7.4, multiplicada por 100. Para analizar eventos de inserción de vesículas individuales, abra la serie de 1.000 imágenes TIFF mediante un software de análisis de imágenes.

Reste el fondo de todos los fotogramas utilizando el ajuste de bola rodante. Ajuste el balance de color de la grabación para maximizar las regiones intensas correspondientes a los eventos de inserción de vesículas. Cuente manualmente las ráfagas de fluorescencia que duran más de tres fotogramas o 600 milisegundos.

Este ejemplo de una imagen celular a pH 7,4 muestra receptores ubicados en la membrana plasmática y el retículo endoplásmico. A pH 5,4, los receptores de la membrana plasmática no emiten fluorescencia, por lo que solo son visibles los receptores residentes del retículo endoplásmico. La diferencia entre la densidad integrada de la fluorescencia a pH 7,4 y pH 5,4 corresponde a receptores localizados en la membrana plasmática.

Los eventos de inserción de una sola vesícula se visualizan a pH 7,4 como un estallido de fluorescencia en la membrana plasmática, que dura al menos 600 milisegundos. Inmediatamente antes de una inserción, no hay ninguna ráfaga perceptible. Se observa un aumento en la intensidad de la fluorescencia a medida que llega una vesícula transportadora que transporta SEP.

A continuación, los receptores marcados con SEP se difunden a través de la membrana plasmática hasta que son indistinguibles de los receptores insertados anteriormente. Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en 45 minutos por plato, si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear los cambios en la distribución de proteínas entre el RE periférico y la membrana plasmática.