Question 1

¿Qué es el RNA-seq y en qué se diferencia de los microarrays?

Accepted Answer

RNA-seq es una técnica de secuenciación de alto rendimiento que mide la secuencia y cantidad de todo el ARN expresado en una población celular, llamada el transcriptoma. A diferencia de los microarrays, que sondean secuencias de ARN conocidas, RNA-seq puede perfilar expresión génica de organismos con genomas no secuenciados y medir con precisión un rango más amplio de niveles de expresión de transcritos, especialmente a niveles muy bajos o muy altos.

Question 2

¿Por qué se elimina el ARNr antes de la preparación de la biblioteca de RNA-seq?

Accepted Answer

La mayoría del ARN en las células es ARN ribosomal (ARNr), que es el componente central de la maquinaria de producción de proteínas de la célula. Eliminar el ARNr facilita la recuperación de otros tipos de transcritos para una medición precisa. El ARNr se elimina típicamente hibridando la muestra con oligonucleótidos complementarios unidos a cuentas magnéticas, luego usando un imán para separar el ARNr del resto de la muestra.

Question 3

¿Cómo se convierten las muestras de ARN en ADN para la secuenciación?

Accepted Answer

Debido a que el ARN es inherentemente propenso a la degradación, primero se transcribe a la inversa a ADN de doble cadena. Luego, se ligan secuencias de oligonucleótidos llamadas adaptadores a los fragmentos de ADN. Estos adaptadores contienen regiones constantes que sirven como sitios de unión de cebadores para la amplificación por PCR y secuencias únicas llamadas códigos de barras que identifican fragmentos de cada muestra.

Question 4

¿Qué papel juegan los códigos de barras en la preparación de la biblioteca de RNA-seq?

Accepted Answer

Los códigos de barras son secuencias oligonucleotídicas únicas contenidas dentro de adaptadores que identifican todos los fragmentos de ADN que se originan de una sola muestra. Esto permite que las bibliotecas de diferentes muestras se mezclen y secuencien simultáneamente. Después de la secuenciación, los códigos de barras permiten a los investigadores clasificar y analizar las lecturas por su muestra de origen.

Question 5

¿Cómo se evalúa la calidad de los datos de RNA-seq durante la secuenciación?

Accepted Answer

La calidad de la secuenciación se indica por la puntuación Q, que refleja la probabilidad de que se identifique una base incorrecta. Las puntuaciones Q mayores que 30 corresponden a menos de 1 en 1,000 posibilidades de una lectura incorrecta. Además, las secuencias de ADN de referencia agregadas en baja concentración sirven como control de calidad, y su recuperación a la tasa esperada indica que todas las secuencias de la biblioteca están representadas uniformemente.

Question 6

¿Qué puede revelar RNA-seq sobre las diferencias de expresión génica entre muestras?

Accepted Answer

RNA-seq puede identificar genes que se expresan de manera diferencial bajo diferentes condiciones comparando transcriptomas entre muestras. Los investigadores pueden contar el número de lecturas por transcrito para medir la abundancia de ARN. Incluso para organismos sin genomas secuenciados, la información del transcriptoma puede compararse con otras especies secuenciadas para identificar genes con niveles de expresión aumentados o disminuidos.

Question 7

¿Cómo se utiliza el RNA-seq para estudiar las interacciones ARN-proteína?

Accepted Answer

RNA-seq puede adaptarse para identificar los transcritos a los que se une una proteína de interés mediante la inmunoprecipitación de la proteína con anticuerpos y la definición de los ARN unidos mediante secuenciación. Cuando los complejos ARN-proteína se reticulan al principio, el análisis de secuenciación puede mapear el sitio de reticulación e identificar el sitio de unión de la proteína en el ARN hasta el nivel del nucleótido.

Secuenciación de RNA - Cuestionario de evaluación