Name: Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Aprende un protocolo HPLC personalizado para purificar péptidos beta amiloide 42 y 40 con alta pureza, capaces de formar oligómeros. Este método facilita investigaciones sobre la enfermedad de Alzheimer.

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Los autores desean agradecer a Agilent para su asistencia técnica. Kate Markham y Rafael Palomino se acreditan por su ayuda inicial para la síntesis y purificación del péptido Aß y el Dr. Hsiau-Wei Lee se dio las gracias por su ayuda en la preparación de la Figura 1 del manuscrito.

1. La HPLC preparativa purificación del Aß40 o Aß42 Péptido <ol><li> Preparar los siguientes tampones para la purificación por HPLC. <ol><li> Preparar el tampón A (20 mM NH 4 OH) mediante la adición de 1,3 ml de NH4OH (solución al 28%) a 1000 ml de agua ultrapura. </li><li> Preparar el tampón B (80% de acetonitrilo con 20 mM NH 4 OH) mediante la adición de 1,3 ml de NH 4 OH (solución al 28%) a una solución de 800 ml de acetonitrilo de grado HPLC y 200 ml de agua ultrapura. </li><li> Preparar tampón de disolución de la muestra (0,1% NH 4 OH) mediante la adición de 100 l de NH 4 OH (solución al 28%) a 100 ml de agua ultrapura. </li></ol></li><li> Configuración del instrumento HPLC como se muestra en la Figura 1. <ol><li> Montar las botellas de disolvente que contienen tampón A y tampón B a las entradas de la bomba HPLC utilizando tubo de polímero. Una el tubo de polímero a la bomba de HPLC con una sola pieza de ajuste. Asegúrese de que el tubo de polímero decada memoria intermedia se ajusta a la válvula de entrada correcto del instrumento. Montar la bomba de HPLC con un desgasificador. </li><li> Acoplamiento de la bomba de HPLC con la entrada de 300 Å 8 m 25 х 300 mm mm columna preparativa (Figura 1B, lejos columna izquierda, ver Lista de Materiales) usando un tubo de polímero. <ol><li> Una el tubo de polímero a la columna preparativa con una sola pieza ajustada dedo. Asegúrese de que la columna del polímero está orientada de la manera correcta. NOTA: La fase estacionaria de la columna de preparación se compone de poli (estireno-divinilbenceno) partículas. La orientación correcta de la columna del polímero está marcado en la carcasa exterior con una sola flecha direccional. </li></ol></li><li> Conectar la salida de la columna al detector de longitud de onda dual usando un tubo de polímero y ajustar el detector de longitud de onda a 214 nm y 280 nm. <ol><li> Alterar la longitud de onda al cambiar los parámetros de longitud de onda de detección en la opción del método de configuración del instrumentoel software incorporado de HPLC. </li></ol></li><li> Una el tubo de polímero a la entrada del detector de longitud de onda con una sola pieza ajustada dedo. Adjuntar tubo de polímero a la válvula de salida del detector de longitud de onda. Una el tubo de polímero a la válvula de salida del detector de HPLC con una sola pieza ajustada dedo. Este será el tubo de recogida de muestras. NOTA: La falta de una fuerte cromóforo en el péptido Aß dicta que 214 nm se utiliza como la longitud de onda ultravioleta primaria (UV) para la recogida de pico. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55482/55482fig1.jpg" /> Figura 1: Montaje experimental del instrumento de HPLC utilizado para la purificación de los péptidos de amiloide beta. (A) La bomba de HPLC cuaternaria equipada con un desgasificador y el detector de longitud de onda variable ajustado a 214 nm y 280 nm; Columnas (B) de HPLC utilizado para la purificación de los péptidos de amiloide beta, a partir dede izquierda a derecha, 25 x 300 mm columna de preparación 2, 7,5 x 300 mm 2 semi columna preparativa y 4,6 x 250 mm2 columna analítica; (C) del inyector manual con 20 l bucle de inyección de acero inoxidable utilizado para HPLC analítica; (D) de inyector manual con 10 ml bucle de inyección de acero inoxidable utilizado para la purificación preparativa y preparativa semi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Programar el software HPLC para ejecutar el método de purificación como se muestra en la Tabla 1. Entre el método de purificación cambiando el parámetro calendario de disolvente (en la opción método instrumento de instalación integrada en el software HPLC). Encienda la bomba de HPLC haciendo clic en el botón de &quot;on&quot; en el software de HPLC. NOTA: La bomba comenzará a suministrar relación de arranque de tampón A y tampón B a través de la preparacióncolumna arative y el instrumento HPLC. <ol><li> Dejar el sistema durante 30 min se equilibren totalmente. </li></ol></li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Tiempo / min </td><td> % De Tampón A una </td><td> % De tampón B b </td><td> Velocidad de flujo d / mL min -1 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 45 </td><td> 75.5 </td><td> 24.5 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 45.01 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 52.01 </td><td> 80 </td><td> 20 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 52.02 </td><td> 73 </td><td> 27 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 85 </td><td> 73 </td><td> 27 </td><td> 6 </td></tr><tr><td> 92 </td><td> 5 </td><td> 95 c </td><td> 6 </td></tr></tbody></table> &lt;strong&gt; Cuadro 1: Calendario para la purificación de los péptidos Aß42 y Aß40 utilizando mm de columna de polímero del 25 × 300. un tampón A - H2O con 20 mM NH 4 OH; b 80% MeCN / 20% H 2 O con 20 mM NH 4 OH; c Ran durante 15 min para lavar la columna antes de la siguiente inyección de muestra; d Con el fin de ejecutar una velocidad de flujo de 6 ml / min en la instrumentación de HPLC, el límite de presión necesita ser reducido a 200 bar. <ol start="4"><li> La purificación de la muestra de péptidos Aß Nota: El péptido crudo se obtiene a través de la síntesis de péptidos en fase sólida automatizada. 10 <ol><li> Disolver 3 mg de crudo péptido Aß en 4 ml de tampón de muestra de la disolución. Sonicar la muestra durante 30-60 s a temperatura ambiente y a una frecuencia de 40 kHz para ayudar a la disolución. </li><li> Inyectar toda la muestra en la columna de HPLC utilizando una jeringa de plástico de 5 ml equipado con un calibre 16aguja de acero inoxidable. Ejecutar el método de purificación como se indica en la subetapa 1.3. NOTA: El sistema permite la inyección de muestra que se realiza mediante el uso de un inyector manual equipado con un acero inoxidable de bucle de inyección de 10 ml (Figura 1D). El péptido Aß deseado se eluye entre 72 y 74 minutos como un pico agudo resuelto (Figura 2C). </li><li> Recoger la muestra en un tubo de centrífuga cónico de 50 ml. Confirmar la identidad del pico Aß a través de inyección directa de espectrometría de masas del eluyente recogido. 11 tienda eluyente para un máximo de 12 horas a -20 ° C. NOTA: El almacenamiento de la solución por períodos de más de 12 h no se recomienda debido al potencial de oxidación del péptido. </li><li> Aislar el péptido purificado por el flash congelar la alícuota de recogida / alícuotas del péptido Aß en nitrógeno líquido y se liofiliza. Realizar liofilización liofilizando la muestra a una temperatura de -60 ° C y una presiónAsegúrese de 20 mTorr durante un periodo de 24 h. </li><li> Ejecutar el protocolo de HPLC analítica tal como se describe a continuación para determinar la pureza del péptido Aß. péptidos almacenar en su forma liofilizada a -20 ° C durante un período de hasta 6 meses. </li></ol></li></ol> 2. Analítica Análisis por HPLC de la proteína purificada Aß <ol><li> Preparar los tampones de HPLC como se describe en la subsección 1.1. del protocolo anterior. </li><li> Configuración de la HPLC analítica como en la etapa 1.2.1 y como se representa en la figura 1 con 4,6 × 250 mm columna analítica (Figura 1B, la columna más a la derecha) y el inyector manual con 20 l bucle de inyección de acero inoxidable (Figura 1C) montada en el instrumento. </li><li> Programar el software HPLC para ejecutar el método de análisis tal como se muestra en la Tabla 2, siguiendo las instrucciones similares a los en el paso 1.3. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr><td> Hora /min </td><td> % De Tampón A una </td><td> % De tampón B b </td><td> CAUDAL / ml min -1 </td></tr><tr><td> 0 </td><td> 95 </td><td> 5 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 50 </td><td> 50 </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabla 2: Calendario para el análisis de HPLC la pureza del péptido Aß. un tampón A - H2O con 20 mM NH 4 OH; b 80% MeCN / 20% H 2 O con 20 mM NH 4 OH. <ol start="4"><li> Análisis de pureza del péptido Aß <ol><li> Preparar una solución de 1 mg / ml de péptido purificado a través de la disolución del péptido en la solución de tampón de muestra. NOTA: La receta de amortiguación se puede encontrar en la subsección 1.1. La concentración de proteína se determina midiendo la absorción de proteína a 280 nm (A 280 nm). El 12 m<html> coeficiente de extinción mu molar (ε) que se utiliza para determinar la concentración es ε = 1.490 dm 3 mol -1 cm -1. 13 </li><li> Inyectar 20 l de la solución de 1 mg / ml (222 mM) en la columna de HPLC y ejecutar el método de análisis que fue instalado en el paso 2.3. NOTA: La solución restante no utilizada para el análisis puede ser de flash congelado en nitrógeno líquido y se liofilizó para recuperar el péptido Aß. liofilización detalles se pueden encontrar en la subsección 1.4.4. El péptido Aß se eluye de la columna analítica entre 16 y 18 min (Figura 2D). Utilice el software de análisis de integración integrado que acompaña al instrumento de HPLC para determinar la pureza del péptido Aß. La pureza se determinó mediante la integración de cada uno de los picos individuales en el espectro y el cálculo de péptido-pico de porcentaje de área. Por lo general, una purificación de&gt; 95% debe ser comprobada. </li></ol></li></ol><img alt="&lt;/ Html">&quot;Figura 2&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55482 / 55482fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2: trazas de HPLC representativos de? 42. (A) tradicional C 4 purificación de sílice, condiciones: Tampón A: H 2 O con 0,1% de ácido trifluoroacético (TFA), tampón B: MeCN (acetonitrilo) con 0,1% de TFA, gradiente: 20 a 27% de tampón B durante 40 min seguido por isocrático 27% de tampón B; (B) la purificación preparativa usando columna de 25 x 300 mm 2 de polímero, condiciones: Tampón A: H 2 O con 20 mM NH 4 OH, tampón B: 80% MeCN / 20% H 2 O con 20 mM NH 4 OH, gradiente : de 20 a 27% de tampón B durante 70 min seguido de isocrático 27% de tampón B; (C) Optimizado purificación preparativa utilizando una columna de polímero del 25 x 300 mm 2, se describen las condiciones en la Tabla 1 se encuentra en la subsección 1.3 del texto de la descripción de protocolo; (D) La HPLC analítica usando la columna de 250 x 4,6 mm polímero 2, conditions: Tampón A: H 2 O con 20 mM NH 4 OH, tampón B: 80% MeCN / 20% H 2 O con 20 mM NH 4 OH, gradiente de 5 a 50% de tampón B durante 30 min. Para las partes A, B y C del pico correspondiente al Aß42 está marcado por un asterisco. Se utilizó la colección del pico Aß42 marcada en la parte C revela una pureza de&gt; 95% como se muestra en parte la espectrometría de D. masa para determinar la identidad del pico Aß42. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55482/55482fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<ol><li>Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20107219">Alzheimer's Disease.</a> N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).</li>
<li>McGowan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A%CE%B242+Is+Essential+for+Parenchymal+and+Vascular+Amyloid+Deposition+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice.</a> Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).</li>
<li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/100/18/10417.abstract">Alzheimer's disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).</li>
<li>Selkoe, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Oligomers+of+the+Amyloid+%CE%B2-Protein+Impair+Synaptic+Plasticity+and+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Behav+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior.</a> Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).</li>
<li>Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodological+and+Chemical+Factors+Affecting+Amyloid+%CE%B2+Peptide+Amyloidogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity.</a> Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).</li>
<li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2346586/">Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer's Aβ Peptide.</a> J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).</li>
<li>Fezoui, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+preparing+the+amyloid+beta-protein+for+fibrillogenesis+and+neurotoxicity+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments.</a> Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).</li>
<li>Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+reversed-phase+high-performance+liquid+chromatography+on+polystyrene-divinylbenzene+columns+for+the+rapid+separation+and+purification+of+acid-soluble+nuclear+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins.</a> J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).</li>
<li>Thess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-engineered+mRNA+Without+Chemical+Nucleoside+Modifications+Enables+an+Effective+Protein+Therapy+in+Large+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals.</a> Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).</li>
<li>Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+D-glutamate+at+a+critical+residue+of+A%CE%B242+stabilizes+a+pre-fibrillary+aggregate+with+enhanced+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Eur+J%22%5BJournal%5D)">Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity.</a> Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).</li>
<li>Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+High-performance+Liquid+Chromatography%2FMass+Spectrometric+Investigation+of+Amyloid-%CE%B2+Peptide+Variants+Found+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Rapid+Commun.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer's Disease.</a> Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).</li>
<li>Layne, E. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279960568_Spectrophotometric_and_Turbidimetric_Methods_for_Measuring_Proteins">Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins.</a> Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).</li>
<li>Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268005X1400469X">Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer.</a> Food Hydro. 46, 216-225 (2015).</li>
<li>Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-Induced+Cross-Linking+of+Unmodified+Proteins+%28PICUP%29+Applied+to+Amyloidogenic+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides.</a> J. Vis. Exp. (23), e1071(2009).</li>
<li>Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12506200">Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La purificación por HPLC del péptido Aß es altamente dependiente de la elección tanto de la fase estacionaria empleada en la purificación y la fase móvil elegido para eluir el péptido. El punto isoeléctrico bajo del péptido y la alta propensión a la agregación render condiciones cromatográficas tradicionales para la separación de proteínas hidrófobas (C4 o fase estacionaria C8 junto con un eluyente móvil ácida) un reto, con el péptido Aß eluyendo como un prolongado amplio, no resuelta pico (Figura 2A). ...

La enfermedad de Alzheimer es un trastorno neurodegenerativo que los efectos más de 35 millones de personas en todo el mundo. 1 Implicado fuertemente en la aparición y desarrollo de la enfermedad, es la agregación altamente propensa, péptido amiloide beta hidrófobo (Aß). 2 Aß se extiende de 36 a 43 aminoácidos de longitud, sin embargo, se cree que la variante de ácido 42-amino, amiloide beta 42 (Aß42), es la forma más tóxica de la proteína. 3 Esto se debe en su mayor parte a la capacidad de Aß42 para formar fácilmente difusibles, especies oligoméricas que se cree que son entidades particularmente neurotóxicos. 4 Con el fin de mejorar nuestra comprensión del péptido Aß, es esencial para obtener de forma rutinaria material de alta pureza. La presencia de trazas de impurezas se ha demostrado que alterar dramáticamente las propiedades de agregación de propensión del péptido. 5 Tradicionalmente, la cromatografía (HPLC) de separación de líquidos de alto rendimiento de péptidos hidrófobos tales como Aß se ha realizado mediante el uso de una combinación de C 4 o C 8 fases estacionarias a base de sílice y una fase móvil ácida. 6 Sin embargo, tales condiciones pueden presentar un reto a la purificación del péptido. El punto isoeléctrico bajo del péptido Aß (pI de aproximadamente 5,5) 7 significa que bajo condiciones ácidas, la agregación de péptido se aumenta y como resultado picos anchos de HPLC, no resueltos que a menudo son difíciles de aislar se producen (Figura 2A). Además, tales picos anchos a menudo contienen impurezas que pueden afectar el perfil de agregación del péptido, y comúnmente requieren las siguientes rondas de purificación que pueden afectar dramáticamente la cantidad de péptido producido. El poli (estireno / divinilbenceno) fase estacionaria, PLRP-S, representa un medio alternativo de tratamientpéptidos hidrofóbicos ying. La fase estacionaria se ha empleado en la purificación de un número de diferentes proteínas y ácidos ribonucleico mensajero (ARNm). 8, 9 La fase estacionaria PLRP-S no requiere ligando alquilo adicional para la separación de fase inversa, y más importante es químicamente estable a pH alto que conduce a la desagregación del péptido. 7 Aquí, se presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40).

<table><tbody><tr><td>Bomba cuatrimestral Agilent 1260 Infinity II</td><td>Agilent</td><td>G7111B</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II Detector de longitud de onda variable dual</td><td>Agilent</td><td>G7114A</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector</td></tr><tr><td>Inyector manual Agilent 1260 Infinity II equipado con un bucle de muestra de acero inoxidable de 10 mL</td><td>Agilent</td><td>0101-1232</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td></tr><tr><td>Agilent 1260 Infinity II Inyector manual equipado con 20 &micro; L bucle de muestra de acero inoxidable</td><td>Agilent</td><td>G1328C</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector</td></tr> soporte de <tr><td>montaje de soporte de anillo</td><td>Agilent</td><td>1400-3166</td><td></td></tr><tr><td>Agilent PLRP-S 300 &aring; 5&nbsp; y micro; m 4,6 x 250 mm (Analítico)</td><td>Agilent</td><td>PL1512-5501</td><td>http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features</td></tr><tr><td>A&beta; 42 o A&beta; 40 péptidos</td><td></td><td></td><td>Sintetizado internamente utilizando un sintetizador de péptidos automatizado CEM liberty.</td></tr><tr><td>Hidróxido de amonio (NH4OH, solución al 28%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A669-500</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A998-4</td><td></td></tr><tr><td>Agua de grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL tubo de centrífuga cónico</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-954-49A</td><td></td></tr><tr><td>Supelco PEEK Ajuste de una sola pieza, paquete de 5 unidades</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z227250</td><td></td></tr><tr><td>Normject 5&nbsp; cc jeringa estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>1481729</td><td></td></tr><tr><td>16 Gauge SS</td><td>Needle Rheodyne</td><td>3725-086</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo de purificación hplc tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de formación de oligómeros

A Tailored HPLC Purification Protocol That Yields High-purity Amyloid Beta 42 and Amyloid Beta 40 Peptides, Capable of Oligomer Formation

Los péptidos amiloidogénicos, como la beta amiloide (Aβ) implicada en la enfermedad de Alzheimer, pueden presentar un desafío significativo cuando se trata de obtener material de alta pureza. Aquí presentamos un protocolo de purificación de HPLC personalizado para producir péptidos beta amiloide 42 (Aβ42) y beta amiloide 40 (Aβ40) de alta pureza. Hemos descubierto que la combinación de la fase estacionaria hidrofóbica poli(estireno/divinilbenceno) disponible comercialmente, la fase inversa de laboratorio de polímeros - estirenidilbenceno (PLRP-S) en condiciones de pH alto, permite el logro de Aβ42 de alta pureza (>95%) en una sola corrida cromatográfica. La purificación es altamente reproducible y puede modificarse tanto a condiciones semi-preparativas como analíticas, dependiendo de la cantidad de material que se desee purificar. El protocolo también se puede aplicar al péptido Aβ40 con idéntico éxito y sin necesidad de alterar el método.

La purificación del péptido Aß42 usando una combinación de la fase estacionaria PLRP-S y un pH alto resultados de fase móvil en la formación de un pico agudo, resuelto para el péptido Aß en un tiempo de retención entre 72 y 74 min (Figura 2C). La confirmación de la identidad del pico se realiza a través de inyección directa de espectrometría de masas del eluyente recogido. El eluyente se puede almacenar a -20 ° C en solución para un máximo de 12 h. Períodos más largos de...

Aquí nos presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40), apto para la formación de oligómeros. El amiloide beta es un péptido altamente propensos agregación, hidrófoba implicada en la enfermedad de Alzheimer. La naturaleza del péptido amiloidogénico hace su purificación un desafío.

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer's disease-implicated Amyloid beta (A&#946;), can present a significant challenge when trying to obtain high ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar la purificación por HPLC para producir péptidos de beta amiloide 42 y beta amiloide 40 de alta pureza, capaces de formar oligómeros. Las propiedades bioquímicas del péptido beta amiloide a menudo pueden dificultar su purificación. Por lo tanto, la obtención de un péptido de alta pureza que sea capaz de formar oligómeros puede ser un desafío. Este procedimiento ayuda a mitigar dicho desafío. Para este protocolo de HPLC, prepare previamente soluciones stock de los tampones A y B, así como el tampón para la disolución de la muestra. Para configurar el HPLC, primero coloque las botellas de tampón A y B en las entradas de la bomba. Utilice tubos de polímero y conectores de una pieza, y no confunda las válvulas. Conecte el tubo de polímero desde la salida de la bomba hasta la entrada de la columna preparativa. Ajuste el conector de una pieza a mano hasta que quede firme, y asegúrese de que la columna esté en la orientación correcta. Luego, conecte otro tubo de polímero desde la salida de la columna hasta el detector de doble longitud de onda. Use conectores de una pieza ajustados a mano, y a continuación, en el software de configuraci

a-tailored-hplc-purification-protocol-that-yields-high-purity-amyloid

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Foto-inducido de entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) permite la caracterización de la distribución del tamaño de oligómero de mezclas de proteínas metaestable. Se demuestra la aplicación de picup a tres péptidos representante amiloidogénica los 40 - y 42-residuo forma de amiloide β-proteína, y la calcitonina, y un péptido de control de la hormona del crecimiento factor de liberación.

Foto-inducido el entrecruzamiento de las proteínas sin modificar (picup) aplicada a los péptidos amiloidogénicas

Una de las características de la enfermedad de Alzheimer es la elevación de...

Preparación de oligómeros β-amiloide 1-42 Y la inducción del deterioro de plasticidad sináptica en rodajas de hipocampo

Los aptámeros son ribo-/deoxyribo-oligonucleotides corto seleccionado...

Selección de los aptámeros de amiloide β-proteínas, el agente causante de la enfermedad de Alzheimer

Este video demuestra el protocolo para aislar fibrillas de amiloide del extracto de tejido cerebral de ratón utilizando centrifugación en gradiente de densidad y digestión de proteínas no amiloides.

Aislamiento de fibrillas de amiloide a partir de extracto de tejido cerebral

Este video muestra el procedimiento de inyectar péptidos amiloides monoméricos en el prosencéfalo de un pez cebra adulto para generar toxicidad amiloide, imitando el daño neuronal observado en la enfermedad de...

Establecimiento de un modelo de enfermedad de Alzheimer en el cerebro de pez cebra mediante la inyección de péptido amiloide

Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Se presenta un procedimiento para el refolding el dCACHE periplasmic dominio obligatorio del ligand del jejuni del Campylobacter quimioreceptor Tlp3 de cuerpos de inclusión y de la purificación para producir cantidades de miligramos de proteína.

Método para Refolding eficiente y la purificación del quimioreceptor ligando vinculante dominio

Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

La síntesis del péptido base poliamina Anfífilos (PPA) es un reto importante debido a la presencia de múltiples nitrógenos de Amina, que requiere un uso juicioso de la protección de los grupos para enmascarar estas funcionalidades reactivas. En este papel, describimos un método fácil para la preparación de estas nueva clase de moléculas de uno mismo-montaje.

Protocolo fácil para la síntesis de uno mismo-montaje base poliamina péptido Anfífilos (PPAs) y relacionados con biomateriales

Péptidos ricos en cisteína doblan en estructuras tridimensionales distintas dependiendo de la conectividad de disulfuro. Específicas síntesis de isómeros individuales disulfuro es necesario oxidación de búfer no conduce a la conectividad deseada disulfuro. El protocolo aborda la síntesis selectiva de péptidos 3-disulfuro-consolidado y su análisis estructural mediante estudios NMR y MS/MS.

Síntesis y determinación estructural de μ-Conotoxina PIIIA isómeros con disulfuro diferentes conectividades

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro

Aprende un protocolo HPLC personalizado para purificar péptidos beta amiloide 42 y 40 con alta pureza, capaces de formar oligómeros. Este método facilita investigaciones sobre la enfermedad de Alzheimer.

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros (Video) | JoVE Journal

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

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