Aplicación de la codificados genéticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Probes, los geNOps, para imágenes en tiempo real de NO • Las señales en las células individuales

El objetivo general de este enfoque de imagen es monitorear las señales de óxido nítrico en tiempo real a nivel de células individuales utilizando una nueva clase de sondas fluorescentes de óxido nítrico codificadas genéticamente, las geNOps. Teniendo en cuenta la importancia del óxido nítrico en biología y fisiología, desde su descubrimiento se ha deseado una visualización de esta molécula a nivel celular o incluso subcelular. Visualizamos las señales de óxido nítrico con sondas novedosas, bastante simples, basadas en proteínas fluorescentes, las geNOps.

Los geNOps responden directa e inmediatamente al óxido nítrico mediante extinción por fluorescencia. Esto significa que puede monitorear la cinética en tiempo real de la generación, difusión y degradación de óxido nítrico en celdas individuales. La principal ventaja de geNOps es que se pueden observar señales de óxido nítrico con una alta resolución espacial y temporal utilizando un microscopio de fluorescencia convencional.

Comience este procedimiento reemplazando el tampón de almacenamiento de la línea celular endotelial o las células HEK293 con un mililitro por pocillo de la solución de refuerzo de hierro (II) a temperatura ambiente. Incuba las células durante exactamente 20 minutos en la oscuridad. El procedimiento de carga de hierro es esencial para obtener una capacidad de respuesta completa de las sondas y puede adaptarse a diferentes tipos de celdas y aplicaciones.

Después, lave las células una vez con tampón de almacenamiento e incube cada pocillo con dos mililitros de tampón de almacenamiento durante al menos dos horas a temperatura ambiente para permitir que las celdas se equilibren. A continuación, sustituya el tampón de almacenamiento por Fura-2AM de 3,3 micromolares en un mililitro de tampón de almacenamiento. Proteja las células de la luz e incubelas durante 45 minutos.

Después de 45 minutos, lave las células dos veces con tampón de almacenamiento y vuelva a incubarlas durante al menos 30 minutos para permitir que las células se equilibren. Para comenzar el procedimiento, primero fije un cubreobjetos de 30 milímetros recubierto con la línea celular endotelial o las células HEK293 en una cámara de perfusión metálica. Encienda el sistema de imágenes y, a continuación, coloque la cámara de perfusión metálica en el microscopio.

Conecte el tubo de afluencia a los depósitos tampón y, a continuación, encienda el sistema de perfusión. Ahora conecte el flujo a una bomba de vacío, asegurando un flujo constante y evitando el drenaje del cubreobjetos. Inicie la perfusión impulsada por la gravedad con tampón de calcio fisiológico utilizando un sistema de perfusión semiautomático.

A continuación, defina los ajustes de imagen utilizando el software correspondiente. Seleccione las longitudes de onda de excitación: 340 nanómetros y 380 nanómetros para la obtención de imágenes Fura-2 y 480 nanómetros para la excitación de G-geNOp. A continuación, seleccione la región de imagen moviendo la mesa xyz del microscopio hasta que varias células fluorescentes estén enfocadas.

A continuación, defina las regiones de interés. Dibuje las regiones que cubren varias células fluorescentes individuales completas para cada campo de imagen. A continuación, defina una región de fondo de tamaño similar.

Comience a recopilar datos en un microscopio fluorescente invertido y avanzado con una platina de muestra motorizada y una fuente de luz monocromática. Alternativamente, excite las celdas a 340 nanómetros y 380 nanómetros para Fura-2AM y 480 nanómetros para G-geNOp, respectivamente. Ajuste los tiempos de exposición respectivos para que se pueda detectar una señal de fluorescencia clara a lo largo del tiempo para todos los canales.

Recoja la luz emitida a 510 nanómetros para Fura-2AM, 520 nanómetros para G-geNOp utilizando una cámara CCD con un conjunto de filtros adecuado que consta de un excitador de 500 nanómetros, un emisor dicroico de 495 nanómetros y un emisor de 510-520 nanómetros. A continuación, graba un fotograma total cada tres segundos. Registre los primeros tres minutos en un tampón de calcio fisiológico para obtener la línea de base de las señales de fluorescencia respectivas.

Una vez que se observa una fluorescencia basal estable, cambie a histamina de 100 micromolares o ATP que contenga tampón de calcio fisiológico para estimular las células durante tres minutos. Posteriormente, vuelva al tampón de calcio fisiológico sin histamina ni ATP y L-NNA durante cinco minutos para eliminar los compuestos de las células. A continuación, administrar NOC-7 de 10 micromolares en el tampón de calcio fisiológico durante dos minutos utilizando el sistema de perfusión.

El donante de óxido nítrico afecta fuertemente a la fluorescencia de G-geNOp y, por lo general, disminuye las células en más del 20% en respuesta a NOC-7 de 10 micromolares. En las células EA.hy926, el efecto NOC-7 es más fuerte en comparación con el enfriamiento por fluorescencia G-geNOp inducido por agonistas. A continuación, lave el compuesto liberador de óxido nítrico durante aproximadamente 10 minutos con el tampón de calcio fisiológico y deje de registrar una vez que se recupere la fluorescencia basal.

Aquí se muestran las imágenes representativas de fluorescencia de campo amplio de las células EA.hy926 que expresan G-geNOp y que están cargadas con Fura-2AM. Y aquí, está el curso temporal representativo de los registros simultáneos de las señales Fura-2 y G-geNOp en respuesta a histamina de 100 micromolares. Como se indicó, la histamina se retiró a los tres minutos mediante un sistema de perfusión.

Estas curvas representan los registros simultáneos de las señales citosólicas de calcio y óxido nítrico de una sola célula endotelial cargada de Fura-2AM que expresa transitoriamente G-geNOp. Las células se estimularon con histamina de 100 micromolares durante tres minutos en un tampón que contenía calcio. Y aquí se muestran las señales representativas de calcio y óxido nítrico registradas simultáneamente a lo largo del tiempo de una célula EA.hy926 que fue tratada previamente con L-NNA de 500 micromolares antes de la medición.

Las células se trataron con histamina de 100 micromolares en presencia de calcio de dos milimolares. Esta figura muestra las curvas promedio que representan las señales de óxido nítrico citosólico en respuesta a ATP de un micromolar seguido de una estimulación de una segunda célula con ATP de 100 micromolares. Una vez dominada, esta técnica le permite visualizar las señales de óxido nítrico en tiempo real con el mínimo esfuerzo.

Creo que esta técnica allanará el camino para que los investigadores exploren y vuelvan a investigar las señales de óxido nítrico en varios modelos celulares. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la tecnología geNOps para obtener imágenes en tiempo real del óxido nítrico en su sistema modelo.