Grabación de EEG en Ratas Neonatales que se mueven libremente usando un método nuevo
29 de mayo de 2017
Aquí, introducimos una técnica novedosa diseñada para registrar la electroencefalografía (EEG) en cachorros epilépticos neonatales de movimiento libre y describir sus procedimientos, características y aplicaciones. Este método permite registrar el EEG durante más de una semana.
El objetivo general de este método es registrar EEGs de crías de rata neonatales que se mueven libremente, utilizando una configuración novedosa de electrodos que es estable durante una semana o más. Este método habrá respondido preguntas clave en el campo de la neurociencia y será beneficioso para el estudio de una epilepsia neonatal. Al utilizar esta técnica, se pueden registrar señales de EEG de alta calidad y estables durante períodos de tiempo más largos.
Lo que ayudará en el diagnóstico de diversos trastornos neuropatológicos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque las ratas neonatales entre los días p8 y p15 son muy difíciles de manipular y requieren mucho cuidado. El electrodo requiere un contacto con horquillas para funcionar como interfaz de señal con los dispositivos de comunicación.
Un pin de ordenador lo sai cumple esta función. Separe cuidadosamente los pines macho y hembra de un pin de ordenador lo sai utilizando alicates. Luego, conecte los pines macho y hembra para formar un electrodo, y asegure la conexión con cianoacrilato.
Prepare varios electrodos de este tipo. Una vez que las uniones se hayan endurecido, coloque los electrodos en un vaso de precipitados lleno con agua destilada durante diez minutos. Luego, colóquelos en un limpiador ultrasónico para limpiar los electrodos.
Luego, transfiera el vaso de precipitados a un horno ajustado a 45 grados Celsius y caliente durante media hora. Por último, esterilice los electrodos con una exposición de 30 minutos a luz UV. En una cabina de seguridad biológica, primero prepare las herramientas quirúrgicas esterilizadas y un aparato estereotáxico esterilizado para la cirugía.
A continuación, anestesie la cría de rata neonatal con isoflurano al dos punto cinco por ciento. Cuando la cría esté profundamente anestesiada, reduzca el isoflurano al uno por ciento. Antes de continuar, utilice una compresión en el dedo del pie para asegurarse de que el animal esté suficientemente anestesiado.
A continuación, fije la cabeza de la cría en el aparato estereotáxico. Coloque las barras auriculares en los conductos auditivos y apriete suavemente las barras. Tenga cuidado: el cráneo neonatal es muy blando.
Ahora, realice una incisión media de quince milímetros en el cráneo. Luego, con fórceps, separe suavemente el cuero cabelludo para ampliar la incisión. Para mantener la incisión abierta, utilice un trozo de algodón humedecido con solución salina.
Ahora, localice la bregma y el lambda, y márquelos con un lápiz. Los siguientes pasos de implante del electrodo son críticos y deben ejecutarse con precisión. Primero, utilizando una aguja de calibre 26, haga un orificio de trepanación en la corteza prefrontal, dos milímetros por delante de la bregma y a menos de cero punto cinco milímetros de la línea media.
A continuación, realice un orificio de trepanación en el hipocampo en un punto situado a uno con ocho milímetros posterior al bregma y a cero con cinco milímetros lateral a la línea media. La aguja no debe penetrar más de dos milímetros por debajo de la superficie cortical para minimizar el daño cerebral. Ahora, utilizando fórceps, inserte el electrodo de referencia en el orificio cortical e inserte los electrodos de registro en el orificio del hipocampo.
Luego, aplique pomada de eritromicina alrededor de los electrodos y fije los electrodos en su lugar con cianoacrilato. Mientras el pegamento se adhiere, prepare el cemento dental con una consistencia pegajosa y viscosa. La viscosidad del cemento dental es crítica.
Si el cemento dental es demasiado delgado, podría resultar en la formación de una capa aislante no deseada debajo del electrodo. Si el cemento es demasiado denso, los electrodos se desprenderán más fácilmente debido al exceso de masa. Antes de aplicar el cemento, seque completamente el cráneo y los electrodos.
Luego, fije los electrodos al cráneo con cemento dental. A continuación, aplique algo de ácido pícrico sobre los electrodos para añadir una capa adicional de protección. Ahora, retire el animal del marco estereotáxico e inyecte 300 microlitros de una solución de glucosa al diez por ciento por vía subcutánea.
Luego, transfiera el animal a una manta térmica para mantenerlo a 37 grados Celsius hasta que pueda caminar. Una vez que pueda caminar, administre buprenorfina para aliviar el dolor postoperatorio y transfiera al cachorro a su jaula de origen junto con su madre. Antes de utilizar el implante, espere al menos dos días para que el cachorro se recupere.
Después del período de recuperación, aloje a la cría individualmente para realizar grabaciones durante aproximadamente diez minutos, de modo que la cría se familiarice con el entorno. Conecte los electrodos a un amplificador y conecte el amplificador a un convertidor AD conectado a una computadora. Tenga cuidado de no enredar estas conexiones.
A continuación, en la unidad de adquisición de datos, seleccione una frecuencia de muestreo de al menos 10 000 hertzios para la grabación y verifique la correcta transmisión de los datos. Realice una grabación de referencia. Tras obtener la grabación de referencia, inyecte al cachorro por vía intraperitoneal ácido caínico para inducir convulsiones epilépticas.
Quince minutos después de la inyección, observe y registre las descargas epilépticas. Guarde los datos digitalizados y analícelos utilizando software de procesamiento de señales. Revele el nivel de potencia de los diferentes componentes de frecuencia en los EEG neonatales mediante análisis del espectro de potencia.
Calcule la potencia a partir de intervalos de un minuto hallando la amplitud cuadrática media en el rango de uno a cien hercios, que corresponde a la banda de EEG. Diez minutos después de la inyección de ácido caínico, se registraron patrones recurrentes de descargas interictales y ictales en el EEG. Las convulsiones más comunes registradas fueron del tipo tónico-clónicas.
La duración tónica ictal duró aproximadamente quince segundos. También se observó que las descargas tónicas fueron seguidas por ráfagas clónicas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo implantar electrodos y obtener grabaciones de EEG de alta calidad desde ratas neonatas de p8 a p15.
Una vez preparado, el implante cervical se puede realizar en menos de diez minutos, dependiendo de la complejidad de la cirugía.
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Descripción general
Este artículo presenta una técnica novedosa para registrar electroencefalografía (EEG) en cachorros epilépticos neonatos que se mueven libremente. El método permite grabaciones estables de EEG que duran más de una semana, facilitando el estudio de la epilepsia neonatal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Electrofisiología
- Epilepsia neonatal
Antecedentes
- Registrar EEGs de crías de ratas neonatales es difícil debido a su naturaleza delicada.
- Configuraciones estables de electrodos son cruciales para obtener datos de calidad.
- Este método aborda preguntas clave en neurociencia.
- Facilita el diagnóstico de trastornos neuropatológicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método confiable para la grabación de EEG en ratas neonatas.
- Mejorar la comprensión de la epilepsia neonatal.
- Proporcionar una herramienta para el monitoreo a largo plazo de la actividad cerebral.
Métodos Utilizados
- Configuración novedosa de electrodos para grabaciones estables de EEG.
- Grabación en crías de rata neonatales de 8 a 15 días de edad que se mueven libremente.
- Asegurar un manejo cuidadoso de los sujetos durante el procedimiento.
- Uso de contactos con puntas para la interfaz de señal con dispositivos de comunicación.
Resultados principales
- Se registraron señales de EEG de alta calidad y estables durante más de una semana.
- El método resultó efectivo para el estudio de la epilepsia neonatal.
- Facilitó el diagnóstico de diversos trastornos neuropatológicos.
- Se demostró la viabilidad del monitoreo prolongado de EEG en sujetos neonatales.
Conclusiones
- La técnica novedosa representa un avance significativo en la grabación de EEG.
- Abre nuevas vías de investigación en epilepsia neonatal.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para obtener mayores conocimientos sobre la actividad cerebral.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La grabación de EEG en crías de ratas neonatales libres de movimiento permite el monitoreo longitudinal de la actividad cerebral en modelos de enfermedad, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en la investigación de la epilepsia. Este método proporciona lecturas electrofisiológicas cuantitativas que aumentan la confianza predictiva en estudios preclínicos de trastornos neurológicos. Al estabilizar las interfaces de los electrodos durante más de una semana, reduce la variabilidad técnica y mejora la reproducibilidad en los flujos de trabajo de descubrimiento.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la captura de descargas epilépticas espontáneas e inducidas in vivo.
- Valor operativo: Apoya la validación funcional de dianas a través de señales de EEG estables y de alta fidelidad en sistemas relevantes para la enfermedad.
- Valor predictivo: Facilita el análisis de la relación dosis-respuesta y la identificación de biomarcadores para tomar decisiones de avance o interrupción en el descubrimiento de fármacos contra la epilepsia.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Prepara sistemas biológicos validados para la selección de compuestos con salidas cuantificables de EEG.
- Reproducibilidad: Estandariza la implantación de electrodos y la adquisición de señales para minimizar la variabilidad entre animales.
- Escalabilidad: Permite la reutilización de la plataforma en modelos de roedores neonatos y adultos para estudios de epilepsia y trastornos neurológicos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Pertinencia para la enfermedad: Modela la epilepsia neonatal mediante inducción con ácido kainico, lo que permite el estudio de patrones EEG ictales e interictales.
- Continuidad traslacional: Conecta el descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar puntos finales electrofisiológicos consistentes.
- Avance ajustado al riesgo: Facilita la reducción de riesgos mecanicistas mediante el seguimiento longitudinal de la progresión y recuperación de las convulsiones.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento, desde la prueba de hipótesis en las primeras etapas del descubrimiento hasta la optimización del fármaco líder y la validación preclínica, particularmente para objetivos relacionados con la epilepsia y trastornos neurológicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la aclaración de vías y la reducción del riesgo biológico mediante la cuantificación de la carga convulsiva electrográfica y la actividad cortico-hipocampal.
- Tamizaje: Ofrece sistemas listos para ensayos con grabaciones estables y de largo plazo de EEG, adecuadas para la evaluación de efectos de compuestos.
- Análisis: Permite el análisis del espectro de potencia y cálculos de la amplitud cuadrática media para comparar la actividad cerebral específica por frecuencia entre diferentes condiciones.
- Investigación Translacional: Conecta los fenotipos de EEG con biomarcadores clínicos de la epilepsia, apoyando la alineación y validación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece una capacidad de electrofisiología reutilizable para modelos de roedores neonatales y adultos en diversos programas de descubrimiento en neurociencia.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en los modelos de epilepsia mediante un monitoreo estable y de larga duración del EEG.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante un montaje de electrodos fiable y de bajo costo que utiliza puntos de anclaje de computadora y fijación con cianoacrilato.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir grabaciones de hasta una semana en animales con movimiento libre, reduciendo la necesidad de cirugías repetidas.
- Impacto en el portafolio: Orienta la priorización ajustada al riesgo al proporcionar puntos finales electrofisiológicos objetivos para decisiones de avance o interrupción en el desarrollo de fármacos contra la epilepsia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo de roedores neonatos, cirugía estereotáxica y adquisición de señales electrofisiológicas.
- Depende de instrumentación que incluye aparato estereotáxico, amplificadores, convertidores analógico-digitales y software de procesamiento de señales.
- Necesita una estandarización entre equipos en la preparación de electrodos, profundidad de implantación y viscosidad del cemento dental para garantizar la estabilidad de la señal.
- Implica consideraciones de adaptación para distintas cepas y edades de roedores, así como para regiones cerebrales distintas al hipocampo y la corteza prefrontal.
- Está limitado por la habilidad técnica necesaria para mantener la integridad de la interfaz electrodo-tejido durante períodos prolongados de grabación.
