Name: En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Aprende a realizar seguimiento en vivo de progenitores retinianos en embriones de pez cebra para estudiar señalización celular no autónoma durante la neurogénesis. Este método permite observar el desarrollo celular en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por un arco DECRA a PRJ (DE120101311) y por una beca de investigación Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) a LP (PO 1440 / 1-1). El australiano Instituto de Medicina Regenerativa es apoyado por fondos del Gobierno del Estado de Victoria y el Gobierno Federal de Australia. Reconocemos el Dr. Jeremy Ng Chi Kei, que llevó a cabo los experimentos descritos aquí como se publicó en Kei et al. , 2016. Agradecemos disposiciones de peces transgénicos desde el Prof. Higashijima y gracias a los profesores. Turner y Rupp para la prestación del pCS2 + plásmido y el Dr. Wilkinson para generar H2B-RFP y H2A-GFP construcciones. Agradecemos a personal de la institución FishCore (Universidad de Monash) para el cuidado de nuestros animales.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La comprensión de la medida en que las células vecinas influencia de sincronización de la expresión de factores que determinan el destino celular crucial es esencial cuando el objetivo de instruir eficazmente células madre multipotentes embrionarias o inducidas a diferenciarse en un tipo de célula post-mitótico específico o incluso tejido patrón. Además, el examen de estos eventos moleculares en las células en desarrollo del animal vivo, además, proporciona dinámica relevante información (temporal y espacial) en los con...

<html> La capacidad de visualizar los procesos de desarrollo importantes en un vertebrado in vivo ha contribuido a que el pez cebra un modelo clave para el estudio de las condiciones normales y de enfermedad (revisado en 1, 2). En particular, la retina neural es una parte accesible del sistema nervioso central. La retina se presta a realizar fácilmente estudios de la neurogénesis debido a su muy organizado, sin embargo, la estructura relativamente simple, y sus tipos de neuronas altamente conservadas a través de especies de vertebrados 3. Dinámica de comportamientos celulares tales como la proliferación, la salida del ciclo celular, la división celular asimétrica, la especificación del destino, la diferenciación y la formación de los circuitos neuronales se pueden seguir a lo largo de todo el proceso de retinogenesis, que se completa en la retina central del pez cebra por 3 d después de la fecundación ( dpf) 4, 5,ref &quot;&gt; 6, 7. Por otra parte, los requisitos funcionales de genes diferentes en cada una de las etapas mencionadas anteriormente se pueden evaluar de forma concomitante en la retina del pez cebra, proporcionando una ventaja sobre otros modelos de vertebrados en el que los fenotipos resultantes de la aplicación de técnicas gen knockout sólo puede ser evaluado en el examen post-mortem de fijo tejidos. En particular, el uso de líneas transgénicas en las que podemos visualizar y controlar la expresión de proteínas fluorescentes como transgenes reportero en la retina, nos permite obtener la resolución temporal de la expresión génica que subyace en la génesis de un tipo celular neuronal particular. Debido al rápido desarrollo de pez cebra, estos eventos pueden ser visualizados durante todo el periodo de desarrollo, proporcionando así una visión más profunda en la importancia temporal de la expresión génica en relación con la adquisición de identidad de la célula neuronal y el comportamiento celular. Por último, estos enfoques pueden ser combinados de manera eficiente en el pez cebra con la generación de la quimera a través de trasplantes, lo que resulta en puntos de vista en dos aspectos clave de la función de genes. En primer lugar, las células trasplantadas de un embrión donante, en el que un gen particular fue derribado antes de que se desarrollan en un entorno de tipo salvaje no marcada en el examen, nos permite obtener información relevante acerca de la función de genes en una celda de manera autónoma. Esto conduce a importantes conocimientos sobre la función de los factores de destino determinantes de la retina dentro de las células progenitoras que normalmente se expresan en. Esto se ejemplifica por el examen de los resultados destino de desarrollo de progenitores que ya no pueden generar proteína funcional a partir de estos genes 4, 6, 8, 9. Utilizando este enfoque, hemos demostrado que los factores determinantes muchos de destino (por ejemplo, Vsx1, atoh7, Ptf1a, Barhl2) actúan célula-autonomously para conducir destinos neuronales retinianas específicas; la falta de expresión de genes conduce principalmente a un conmutador de destino, de modo que las células con el gen desmontables permanecen viables mediante la adopción de un destino alternativo celular 4, 6, 7, 10. En segundo lugar, tales experimentos quiméricos se pueden utilizar para evaluar la forma de tipo salvaje progenitores comportan cuando se desarrollan dentro de diferentes entornos genéticos. Por ejemplo, comparando el desarrollo de las células WT que normalmente expresan un gen de interés (y transgén reportero) en un WT frente a entorno de acogida manipulada (por ejemplo, eliminación de genes / caída), los efectos resultantes sobre la expresión génica y destino de las células se pueden evaluar . La falta de ciertos tipos de neuronas en el entorno de acogida, por ejemplo, se ha demostrado que influyen en el comportamiento progenitor de tipo salvaje de una manera no autónoma de células, al sesgo de ellos hacia la diferenciación en el o subrepresentadosr falta tipos de neuronas 4, 7, 11, 12. Dado que las neuronas de la retina nacen en un orden histogenic conservada por la expresión secuencial temporizada de genes específicos destino determinantes neuronales (la expresión génica destino) (revisado en 13), hemos utilizado estos métodos para demostrar cómo el momento de la expresión génica destino en progenitores de tipo salvaje se ve afectada cuando estos progenitores se desarrollan en entornos host de la retina con composiciones celulares aberrantes inducidos. A continuación, describimos estos enfoques como evidencia de cómo la combinación de técnicas relativamente estándar y ampliamente utilizado permite que el examen de las fechas de la expresión génica destino en el desarrollo de la retina progenitores 8, 9. Este protocolo describe un método experimental que combina imágenes de lapso de tiempo con la facilidad de performando el trasplante en el ex vivo el desarrollo de embrión de pez cebra a seguir mosaically individuo células marcadas a lo largo de todo el período de retinogenesis desarrollo. Mediante la realización de las manipulaciones de genes funcionales ya sea en el embrión de acogida, embrión donante, ambos o ninguno, uno puede evaluar la autonomía de células de la función génica. Este enfoque se puede adaptar ampliamente a las preguntas de investigación similares en cualquier otro sistema para el cual los componentes individuales descritos aquí son adecuados.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td>Los platos recubiertos de agarosa se pueden preparar unos días antes, sellar con parafilm para evitar el secado y almacenar a 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Agarosa de bajo punto fundido</td><td>Sigma</td><td>A9414-100G</td><td>Se puede preparar en un volumen más grande, calentar en el microondas para licuar y luego mantener fundido en un 40 &#176; C Baño de agua. Se pueden preparar alícuotas de 1 mL (una por cada grupo de embriones montados).</td></tr><tr><td>tubo capilar de vidrio de borosilicato sin filamento</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0035</td><td>se pueden utilizar alternativas con diámetro similar&nbsp;</td></tr><tr><td>tubo capilar de vidrio de borosilicato con filamento</td><td>SDR Scientfic</td><td>30-0038</td><td>se pueden utilizar alternativas con diámetro similar&nbsp;</td></tr><tr><td>placas de Petri de vidrio (60 mm de diámetro)</td><td>Science Supply</td><td>1070506</td><td>cualquier alternativa de vidrio de cualquier tamaño</td></tr><tr><td>Tubo de inyección (2 m)</td><td>Eppendorf</td><td>524616004</td><td>Esto conecta el soporte de la aguja a la jeringa durante el trasplante</td></tr><tr><td>Molde de microinyección (molde de plástico con protuberancias en forma de cuña)</td><td>Herramientas de ciencia adaptativa</td> Se pueden usar alternativas <td>PT-1</td><td>con forma similar</td></tr><tr><td> soporte</td><td>Narishige</td><td>M-152</td><td>cualquier alternativa que se ajuste al diámetro exterior de las agujas de inyección se puede utilizar</td></tr><tr><td>microinyector</td><td>Narishige o Eppendorf Femtojet</td><td></td><td>Inyector neumático mediante</td></tr><tr><td>micromanipulador</td> de presión de gas <td>Coherent Scientific</td><td>M330IR</td><td>alternativas similares se pueden utilizar</td></tr><tr><td>punta de microcargador</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Extractor</td> de aguja de aceite mineral <td>Sigma</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instruments</td><td>Modelo P-2000</td><td>Los ajustes utilizados para este extractor son: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Se puede utilizar cualquier extractor de agujas si resulta en una dimensión de punta adecuada</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Interpath</td><td>PM996</td><td>cualquier película de parafina</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur de plástico</td><td>Samco</td><td>Scientific 202</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipeta de vidrio</td><td>Hirschmann Laborgeraete</td><td>9260101</td><td></td></tr><tr><td>Pronase</td><td>Sigma</td><td>P5942-25MG</td><td>&nbsp; La proteasa tipo XIV</td></tr><tr><td>N-feniltiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629-25G</td><td>PTU es tóxica y se puede preparar como una solución madre para evitar la exposición frecuente al polvo, consulte la MSDS antes de comprar / usar.</td></tr><tr><td>Extracción de gel Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>se pueden usar cualquier alternativa para purificar el ADN</td></tr><tr><td>Rneasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>se pueden usar cualquier alternativa para purificar el ARN</td></tr><tr><td>SP6 mMessage kit</td><td>Qiagen</td><td>AM1340</td><td>cualquier alternativa para transcribir el ADN usando SP6</td></tr></tbody></table>

en vivo de imágenes de transgénicos de la expresión génica en el estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares influencias no autónomos

In Vivo Imaging of Transgenic Gene Expression in Individual Retinal Progenitors in Chimeric Zebrafish Embryos to Study Cell Nonautonomous Influences

Los puntos fuertes genéticos y técnicos han hecho los vertebrados pez cebra un organismo modelo clave en el que las consecuencias de las manipulaciones genéticas pueden ser rastreados en vivo durante todo el periodo de desarrollo rápido. Múltiples procesos pueden ser estudiados incluyendo la proliferación celular, la expresión génica, la migración celular y morfogénesis. Es importante destacar que la generación de quimeras a través de trasplantes puede realizarse fácilmente, lo que permite el etiquetado de mosaico y el seguimiento de las células individuales bajo la influencia del medio ambiente host. Por ejemplo, mediante la combinación de manipulaciones de genes funcionales del embrión de acogida (por ejemplo, mediante microinyección morfolino) y las imágenes en vivo, los efectos de la extrínseca, señales celulares no autónomas (proporcionados por el entorno modificado genéticamente) en las células del donante trasplantadas individuales pueden evaluarse. Aquí se demuestra cómo se utiliza este método para comparar la aparición de la expresión transgénica fluorescente como un proxy para la sincronización de deter destino de la célulaación en diferentes entornos host genética. En este artículo, proporcionamos el protocolo para la microinyección de embriones de pez cebra para marcar las células del donante y para provocar la precipitación de genes en embriones de acogida, una descripción de la técnica de trasplante usado para generar embriones quiméricos, y el protocolo para la preparación y administración in vivo confocal de lapso de tiempo obtención de imágenes de múltiples embriones. En particular, la realización de imágenes de varias posiciones es crucial cuando la comparación de tiempo de los eventos tales como la aparición de la expresión génica. Esto requiere la recopilación de datos de control múltiple y embriones experimentales procesados ​​simultáneamente. Este enfoque se puede ampliar fácilmente para los estudios de las influencias extrínsecas en cualquier órgano o tejido de elección accesible a imágenes en directo, siempre que los trasplantes pueden ser dirigidos fácilmente de acuerdo con los mapas de destino embrionarias establecidas.

Este trabajo presenta un protocolo experimental para evaluar los cambios en el gen de expresión cuando la sincronización de tipo salvaje retina progenitores desarrollan dentro de un embrión de acogida morphant. Los embriones de acogida experimentales son morphants Ptf1a, que carecen de las interneuronas horizontales y amacrinas nacidos intermedios de la retina 7, 26. Éstos se han comparado con el control de los embriones de acogi...

el seguimiento en directo de la retina progenitores WT individuales en los antecedentes genéticos distintos permite la evaluación de la contribución de la señalización no autónomo celular durante la neurogénesis. Aquí, una combinación de gen desmontables, la generación de quimera a través de la transferencia de embriones y la imagen de lapso de tiempo confocal in vivo se utilizó para este propósito.

En vivo de imágenes de transgénicos de la Expresión Génica en el Estimado de retina progenitores en embriones de pez cebra quiméricos para estudiar celulares Influencias no autónomos

The genetic and technical strengths have made the zebrafish vertebrate a key model organism in which the consequences of gene manipulations can be traced ...

El objetivo general de estos procedimientos es estudiar cómo los cambios en la expresión génica, ya sea dentro de las células en desarrollo o en su entorno circundante, influyen en los procesos temporales durante el desarrollo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave, como si el momento de la especificación del destino celular está controlado por genes expresados de manera autónoma dentro de una célula o de manera no autónoma en células vecinas. La principal ventaja de esta técnica radica en la capacidad de seguir células progenitoras individuales en un vertebrado in vivo mientras las células se desarrollan en entornos genéticamente distintos.La procedura será demostrada por Stefanie Dudczig, una asistente de investigación de mi laboratorio. Después de preparar embriones de pez cebra, así como agujas de microinyección con Morpholinos o ARNm, según el protocolo descrito en el texto, sumerja la punta de la aguja en una gota de aceite mineral en un recipiente. Mida el volumen de inyección presionando el pedal del pie y ajuste la presión del gas y/o el tiempo de duración hasta que el volumen de inyección equivalga a un nanolitro, medido con una regla micrométrica, o alternativamente, con la retícula del ocular.Coloque un portaobjetos en una placa de Petri y, con una pipeta de transferencia, deposite embriones en estadio de célula única a lo largo del borde del portaobjetos. A continuación, con una pipeta de transferencia fina, retire tanto líquido como sea posible para evitar movimientos durante las inyecciones. Luego, utilizando una punta de pipeta Microloader con la mitad de la punta delgada cortada, alinee los embriones en una sola columna.Luego, baje la aguja hacia un embrión en estadio de una sola célula y atraviese la coriona y el vitelo en un solo movimiento suave. Una vez que la punta de la aguja esté centrada en el vitelo, presione una vez el pedal del pie e inyecte mediante microinyección un nanolitro de ARNm de H2AGFP o H2BRFP en el vitelo del embrión en estadio de una sola célula. Retire la aguja de inyección, mueva el recipiente que contiene los embriones para colocar el siguiente embrión en posición y continúe inyectando hasta que toda la columna de embriones haya sido inyectada.Después de inyectar todos los embriones, incline el recipiente a un ángulo de 30 a 45 grados y utilice un flujo suave de medio E3 en una botella de presión para transferir los embriones inyectados a un nuevo plato de Petri limpio. A las tres horas post-fecundación, bajo un microscopio fluorescente con un aumento de 2X a 5X, use un filtro RFP para verificar la señal de marcado en los embriones donantes. Seleccione embriones bien desarrollados que presenten una señal fluorescente intensa.Después de preparar las placas de inyección y las placas de Petri según el protocolo descrito, corte la punta de una pipeta Pasteur de vidrio larga y finamente estirada a una longitud que permita un manejo cómodo, utilizando un cuchillo de diamante para rayar la aguja mientras la gira hasta que la punta se desprenda. Asegúrese de que el corte sea recto. Luego, para no dañar los embriones descorionados, suavice la pipeta de transferencia de vidrio pasando la superficie cortada por la llama de un mechero Bunsen mientras la gira, a fin de obtener extremos lisos.Para descorionar embriones, coloque embriones huésped y donantes bien desarrollados en dos matraces Erlenmeyer de vidrio de 10 mililitros separados, y retire tanto líquido como sea posible. Añada 5 mililitros de la solución de proteasa 0,5 miligramos por mililitro previamente preparada a cada matraz, y agite suavemente los embriones mientras los observa bajo un microscopio estereoscópico. Mientras continúa agitando, tan pronto como el primer embrión salga del corion, utilice medio E3 para realizar tres enjuagues rápidos con el fin de eliminar la solución de proteasa, vertiendo la mayor parte del líquido y rellenando nuevamente el matraz vertiendo suavemente E3 por la pared del recipiente.Detenga la descorionación enzimática mediante un lavado rápido pero suave tan pronto como se puedan observar los primeros embriones descorionados. Para los trasplantes, seleccione únicamente embriones descorionados que presenten una masa celular simétrica y sin deformaciones evidentes ni daños en la yema. Para realizar el trasplante de blástula, monte la aguja en el portaagujas y conéctela al tubo del dispositivo de trasplante.Compruebe el sellado operando manualmente la jeringa para succionar líquido dentro y fuera de la aguja. A continuación, con una pipeta de vidrio, transfiera los embriones donantes a la primera columna del molde de agarosa. Luego transfiera los embriones huésped a las columnas dos a seis del molde de agarosa.Coloque suavemente la aguja de trasplante sobre las células blastómeras de un embrión donante y aspire lentamente alrededor de 20 a 50 células dentro de la aguja de trasplante. Evite aspirar el vitelo. Utilizando el micromanipulador, levante la aguja de trasplante del embrión donante.Mueva el platillo de inyección hacia la izquierda e inserte la punta de la aguja de trasplante a través del costado de la masa celular, en el polo animal del primer embrión huésped. Deposite de cinco a 10 células cerca de la superficie según un mapa de destino que indica que esta zona da origen al campo del ojo del prosencéfalo. Para montar los embriones para la obtención de imágenes, aspire un máximo de cinco embriones en una pipeta plástica de transferencia y deje que los embriones se acumulen en la punta por gravedad.Toque la pipeta de transferencia sobre la superficie de un tubo de plástico previamente preparado que contenga agarosa de bajo punto de fusión al 1%, permitiendo que los embriones caigan dentro del tubo mientras se limita la cantidad de E3 transferida. A continuación, transfiera los cinco embriones desde el tubo de plástico con agarosa a una placa de Petri con 0,5 hasta un mililitro de agarosa, y utilizando la misma pipeta de transferencia, retire el exceso de agarosa para que solo quede una pequeña gota. Utilice una pipeta microcargadora con la punta rota para alinear los embriones lateralmente hasta que la agarosa se solidifique.Luego, continúe montando hasta cinco embriones a la vez, en gotas individuales de agarosa. Si va a realizar imágenes con un microscopio invertido, evite colocar los embriones dentro de un centímetro de la circunferencia de la placa de Petri. Utilice agarosa fundida al 1% adicional para unir las gotas de agarosa entre sí en el lateral de la placa, a fin de evitar cualquier desplazamiento o movimiento lateral durante la adquisición de imágenes.Seleccione embriones que tengan el ángulo de montaje correcto, un latido cardíaco fuerte y algunas células donantes trasplantadas principalmente en el cuadrante ventral anterior de la retina en desarrollo, donde comienza la ola de expresión génica. Realice la adquisición de imágenes según el protocolo descrito en el texto. Como se muestra en esta figura, la microinyección de un nanolitro de ARNm en la yema de embriones en estadio de una sola célula provoca la expresión de la proteína reportera fluorescente tres horas después de la fertilización, momento en el cual se seleccionan los donantes más brillantes.24 horas después de la fertilización, los embriones con células donantes trasplantadas en las ubicaciones retinianas relevantes se sometieron a imágenes de lapso de tiempo durante 16 a 24 horas. Esta imagen confocal de una única sección óptica en Z muestra la superposición del campo brillante en canales rojos en el ojo en desarrollo, con algunas células donantes marcadas en rojo dentro de un entorno huésped no marcado. Estas micrografías proceden de imágenes de lapso de tiempo de células donantes silvestres en desarrollo de embriones transgénicos atoh7:gapGFP trasplantados en un huésped silvestre no marcado.Se indica el inicio de la expresión del transgén en algunas pocas células, como se observa aquí. Una vez dominadas, las microinyecciones pueden realizarse en dos horas, y la selección, preparación y trasplante de embriones pueden completarse en tres horas el mismo día. Posteriormente o en paralelo a estos procedimientos, también podemos fijar embriones a edades específicas para análisis post mortem.Por ejemplo, podemos cuantificar qué proporciones de células donadoras están expresando un gen o proteína determinados, tienen una morfología específica o han migrado a una ubicación determinada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular genéticamente embriones de pez cebra y generar quimeras entre donantes y huéspedes genéticamente distintos. También debería ser capaz de montar los embriones para realizar imágenes de lapso de tiempo in vivo y responder preguntas que no pueden responderse en tejido fijado.

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Investigación

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