Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

El objetivo general de este método es aislar la proteína G-quadruplex helicasa G4 Resolvasa1 de un sistema de expresión bacteriana utilizando un paso de purificación único dependiente de ATP para aislar una enzima casi pura y catalíticamente activa. Este método puede ayudar a los investigadores a obtener la proteína recombinante G4 Resolvasa1 casi pura y catalíticamente activa para nosotros en una amplia gama de ensayos bioquímicos in vitro. La principal ventaja de esta técnica es que excluye la enzima mal plegada o catalíticamente inactiva de la preparación de proteínas.

La idea de usar ATP para eluir la helicasa G-cuádruple se originó después de no poder eluir la enzima catalíticamente activa de las perlas G4, incluso a concentraciones de sal excepcionalmente altas. Preparar y cultivar grandes cultivos bacterianos que expresen G-quadruplex Resolvase1 o G4R1 como se describe en el protocolo de texto. Descongele el gránulo bacteriano en tres mililitros de tampón TN a temperatura ambiente.

Sostenga las botellas en la mano y gírelas para descongelar y volver a suspender la pelletza bacteriana. Una vez descongelado y suspendido de manera relativamente uniforme, aumente el volumen hasta cinco mililitros con tampón TN. A continuación, disuelva 20 miligramos de lisozima en 250 microlitros de agua por cultivo y agregue a las bacterias resuspendidas.

Deje que la lisozima digiera las bacterias durante aproximadamente cinco a 10 minutos mientras agita las botellas en la mano. El color de la suspensión comenzará a aclararse ligeramente a medida que avanza la digestión, y la suspensión será relativamente no viscosa. Añadir 250 microlitros de cóctel de inhibidores de la proteasa abreviado PIC.

A continuación, añade una alícuota de 10 microlitros de leupeptina y mezcla bien. Coloque la suspensión sobre hielo y agregue 10 mililitros de tampón TN frío y 22 microlitros de beta mercaptoetanol o BME. Transfiera la suspensión a un tubo de 50 mililitros.

Sonica las bacterias en hielo con un sonicador digital ajustado al 30% de amplitud. Pulso a dos segundos de encendido y dos segundos de apagado durante un minuto. Repita la sonicación tres veces, permitiendo que las muestras se enfríen en hielo durante al menos dos minutos entre los pasos de sonicación.

A continuación, agregue un volumen igual de citrato de sodio frío cuatro X salinos o SSC más BME, PIC y leupeptina y mezcle la suspensión. En una centrífuga de mesa preenfriada a cuatro grados centígrados, centrifugar los lisados a 2.300 veces G durante 20 minutos. A continuación, transfiera el sobrenadante a tubos frescos y preenfriados de 50 mililitros.

Tome un mililitro de perlas paramagnéticas de estreptavidina, o suspensión SPB por cultivo, y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Granule el SPB con un imán. A continuación, lave el SPB dos veces con dos X SSC más cinco milimolares EDTA PH8.

A continuación, vuelva a suspender el SPB lavado en 200 microlitros de la misma solución. Agregue una alícuota de tres OD de ADN G4 a la suspensión de SPB. Mezcle rápidamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Luego, coloque los tubos en un rotador y gírelos a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. Después de este período de rotación, bloquee el SPB unido a G4 agregando un mililitro de 0.4% de lactoalbúmina y manténgalo en hielo hasta que lo necesite. Para unir la histidina G4R1 recombinante marcada con perlas de cobalto, agregue un mililitro de suspensión de perlas de cobalto a cada tubo de 50 mililitros que contenga el lisado bacteriano clarificado.

Incubar la mezcla durante 20 minutos a temperatura ambiente en un rotador. Después de la incubación, centrifugar las perlas de cobalto a 110 veces G durante cinco minutos en una centrífuga de mesa de cuatro grados centígrados. Aspire el líquido con cuidado y deje un par de mililitros de líquido para no perturbar las perlas de cobalto granuladas.

A continuación, lavar las cuentas con 10 a 15 mililitros de cuatro X SSC más BME fríos, y pellets las cuentas como antes. Vierta el siguiente lisado clarificado sobre las perlas de cobalto granuladas. Incubar durante 20 minutos más a temperatura ambiente en el rotor y lavar las perlas con 10 a 15 mililitros de cuatro X SSC plus BME.

Luego, granule las cuentas a 100 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Después de un segundo lavado, aspire el líquido y deje unos dos mililitros de perlas y líquido en el fondo del tubo. Transfiera las perlas de cobalto unidas a proteínas a un tubo preenfriado de dos mililitros utilizando una punta de pipeta de diámetro ancho de un mililitro.

Centrifugar brevemente las perlas en el tubo de dos mililitros a alta velocidad en una microcentrífuga a cuatro grados centígrados. Retire y deseche suavemente el sobrenadante mediante pipeteo, teniendo cuidado de no perder las perlas de cobalto unidas a proteínas. Pipetear 0,5 mililitros de tampón de elución de histidina, o HEB, en las perlas y volver a suspenderlas invirtiendo el tubo.

A continuación, incubar las perlas de cobalto en HEB en un rotador durante cinco minutos en una cámara frigorífica. A continuación, centrifugar la suspensión a 18.000 veces G en una microcentrífuga de cuatro grados centígrados durante un minuto. Retire suavemente la proteína que contiene el sobrenadante mediante un pipeteo cuidadoso, dejando una pequeña cantidad de líquido encima de las perlas de cobalto.

Transfiera el sobrenadante a un tubo preenfriado de 15 mililitros. Repita estos pasos para un total de tres eluciones de HEB. A continuación, eluir una vez con EDTA 0,2 molar a PH 6,0.

El color de las perlas de cobalto cambiará de rosa a blanco a medida que el EDTA quela el cobalto. Una vez que esta cuarta y última elución se haya transferido al tubo de 15 mililitros, pipetee el tampón de elución residual de las perlas de cobalto utilizando una punta de carga de gel en el extremo de una punta de pipeta de un mililitro. Al sumergir la punta en el fondo del tubo, se puede recolectar la proteína residual que contiene tampón de elución.

Pilotee el G4 SPB preparado hacia el lado del tubo con un imán y deseche el sobrenadante. A continuación, añada un mililitro de tres tampones de X res al G4 SPB y pipetee para mezclar. Pipetee el G4 SPB suspendido en tres tampones de resolución X en el tubo de 15 mililitros que contiene aproximadamente dos mililitros de proteína que contiene HEB EDTA.

Incubar durante 15 minutos en un baño de agua a 37 grados centígrados con agitación ocasional para que las perlas no se asienten. Después de lavar el G4 SPB unido a proteínas como se describe en el protocolo de texto, granule el G4 SPB con un imán en hielo y vuelva a suspender las perlas en 100 microlitros de tampón de elución precalentado. Transfiera inmediatamente las perlas a un tubo de PCR precalentado e incube durante 30 segundos a 37 grados centígrados.

Agregue rápidamente 12 microlitros de cloruro de sodio de cinco molares y pipetee hacia arriba y hacia abajo vigorosamente de 20 a 30 veces. La combinación del alto contenido de sal y ATP contenido en el tampón de elución sirve para eluir el G4R1 recombinante de las perlas G4. Granule inmediatamente el G4 SPB con un imán y transfiera la proteína que contiene eluto a un tubo de PCR nuevo en hielo.

Después de repetir la elución y la transferencia, el producto final es de aproximadamente 200 microlitros de tampón de elución que contiene G4R1 recombinante purificado. Finalmente, realice el ensayo de actividad enzimática de control de calidad para probar si el recombinante altamente activo G4R1 se ha purificado como se describe en el protocolo de texto. El ensayo G4 proporciona una medida de la actividad enzimática recombinante G4R1.

Dentro del rango de 0,2 a 0,013 microlitros en la enzima, se observa típicamente que el 50% de los 0,2 picomoles de ADN tetramolecular G4 marcado con tetrametilrodamina se convierten en monómeros. La posición de Coomassie del recombinante purificado G4R1 indica una sola banda con el tamaño esperado de 120 kilodaltons, con una banda contaminante menor de aproximadamente 75 kilodaltons. Esta banda puede representar G4R1 recombinante truncado que ha mantenido su capacidad para unirse a las perlas de ADN G4 en eluido de una manera dependiente de ATP.

La banda de interés se cuantifica contra una curva estándar de proteínas. Este protocolo normalmente obtiene 200 microlitros de enzima purificada de 20 a 100 nanomolares por un litro de cultivo de bacterias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo purificar la proteína G4 Resolvase1 de un sistema de expresión bacteriana utilizando un paso de purificación dependiente de ATP único para aislar una enzima casi pura y catalíticamente activa.

Una vez dominado, y con la preparación previa de los pellets de bacterias congeladas, la purificación del G4R1 recombinante se puede realizar en aproximadamente seis horas. Para mantener la actividad catalítica óptima de la enzima, es importante mantener la preparación en hielo, a menos que se indique lo contrario. Utilice siempre inhibidores de la proteasa.

Evite la formación de burbujas en los tubos. Congele la enzima purificada rápidamente y evite ciclos de congelación y descongelación innecesarios. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo definieran con precisión las afinidades de unión y las actividades helicasa de esta proteína a una amplia gama de sustratos de ADN y ARN.

Este método también se puede adaptar para la purificación de otras enzimas de ácidos nucleicos dependientes de ATP para las que el producto de la reacción enzimática ya no es un sustrato de unión para la enzima.