Name: Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprende a purificar la helicasa G4 Resolvase1 mediante un método de afinidad con ADN G-cuádruplex y elución dependiente de ATP. Esta técnica proporciona enzima catalíticamente activo para ensayos bioquímicos in vitro.

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Nos gustaría dar las gracias a nuestras fuentes de financiación, incluyendo una generosa donación de la Fundación Ware (a JPV), los Institutos Nacionales de HealthGrant T32-CA079448 (para PJS), y los fondos de inicio de la Ball State University (a PJS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

<ol><li>Qin, Y., Hurley, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures%2C+folding+patterns%2C+and+functions+of+intramolecular+DNA+G-quadruplexes+found+in+eukaryotic+promoter+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Structures, folding patterns, and functions of intramolecular DNA G-quadruplexes found in eukaryotic promoter regions.</a> Biochimie. 90 (8), 1149-1171 (2008).</li>
<li>Stegle, O., Payet, L., Mergny, J. L., MacKay, D. J., Leon, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+and+understanding+the+stability+of+G-quadruplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Predicting and understanding the stability of G-quadruplexes.</a> Bioinformatics. 25 (12), i374-i382 (2009).</li>
<li>Todd, A. K., Johnston, M., Neidle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+prevalent+putative+quadruplex+sequence+motifs+in+human+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Highly prevalent putative quadruplex sequence motifs in human DNA.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2901-2907 (2005).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+quadruplexes+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence of quadruplexes in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 33 (9), 2908-2916 (2005).</li>
<li>Bedrat, A., Lacroix, L., Mergny, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Re-evaluation+of+G-quadruplex+propensity+with+G4Hunter%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Re-evaluation of G-quadruplex propensity with G4Hunter.</a> Nucleic Acids Res. 44 (4), 1746-1759 (2016).</li>
<li>Mendoza, O., Bourdoncle, A., Boule, J. B., Brosh, R. M. Jr, Mergny, J. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26883636">G-quadruplexes and helicases.</a> Nucleic Acids Res. 44 (5), 1989-2006 (2016).</li>
<li>Huppert, J. L., Balasubramanian, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplexes+in+promoters+throughout+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplexes in promoters throughout the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 35 (2), 406-413 (2007).</li>
<li>Eddy, J., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+function+correlates+with+potential+for+G4+DNA+formation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene function correlates with potential for G4 DNA formation in the human genome.</a> Nucleic Acids Res. 34 (14), 3887-3896 (2006).</li>
<li>Eddy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+motifs+correlate+with+promoter-proximal+transcriptional+pausing+in+human+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 motifs correlate with promoter-proximal transcriptional pausing in human genes.</a> Nucleic Acids Res. 39 (12), 4975-4983 (2011).</li>
<li>Vaughn, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEXH+protein+product+of+the+DHX36+gene+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The DEXH protein product of the DHX36 gene is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 280 (46), 38117-38120 (2005).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+unwinds+a+G4-quadruplex+in+human+telomerase+RNA+and+promotes+the+formation+of+the+P1+helix+template+boundary%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) unwinds a G4-quadruplex in human telomerase RNA and promotes the formation of the P1 helix template boundary.</a> Nucleic Acids Res. 40 (9), 4110-4124 (2012).</li>
<li>Creacy, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+binds+both+DNA+and+RNA+tetramolecular+quadruplex+with+high+affinity+and+is+the+major+source+of+tetramolecular+quadruplex+G4-DNA+and+G4-RNA+resolving+activity+in+HeLa+cell+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 binds both DNA and RNA tetramolecular quadruplex with high affinity and is the major source of tetramolecular quadruplex G4-DNA and G4-RNA resolving activity in HeLa cell lysates.</a> J Biol Chem. 283 (50), 34626-34634 (2008).</li>
<li>Giri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4+resolvase+1+tightly+binds+and+unwinds+unimolecular+G4-DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G4 resolvase 1 tightly binds and unwinds unimolecular G4-DNA.</a> Nucleic Acids Res. 39 (16), 7161-7178 (2011).</li>
<li>Lattmann, S., Stadler, M. B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU+binds+an+intramolecular+RNA+G-quadruplex+in+TERC+and+associates+with+telomerase+holoenzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box RNA helicase RHAU binds an intramolecular RNA G-quadruplex in TERC and associates with telomerase holoenzyme.</a> Nucleic Acids Res. 39 (21), 9390-9404 (2011).</li>
<li>Sexton, A. N., Collins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+5%27+guanosine+tracts+of+human+telomerase+RNA+are+recognized+by+the+G-quadruplex+binding+domain+of+the+RNA+helicase+DHX36+and+function+to+increase+RNA+accumulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The 5' guanosine tracts of human telomerase RNA are recognized by the G-quadruplex binding domain of the RNA helicase DHX36 and function to increase RNA accumulation.</a> Mol Cell Biol. 31 (4), 736-743 (2011).</li>
<li>Smaldino, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+Dissection+of+Telomeric+DNA+Binding+Requirements+of+G4+Resolvase+1+Shows+that+G4-Structure+and+Certain+3%27-Tail+Sequences+Are+Sufficient+for+Tight+and+Complete+Binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mutational Dissection of Telomeric DNA Binding Requirements of G4 Resolvase 1 Shows that G4-Structure and Certain 3'-Tail Sequences Are Sufficient for Tight and Complete Binding.</a> PLoS One. 10 (7), e0132668(2015).</li>
<li>Booy, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+helicase+RHAU+%28DHX36%29+suppresses+expression+of+the+transcription+factor+PITX1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The RNA helicase RHAU (DHX36) suppresses expression of the transcription factor PITX1.</a> Nucleic Acids Res. 42 (5), 3346-3361 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yin+Yang+1+contains+G-quadruplex+structures+in+its+promoter+and+5%27-UTR+and+its+expression+is+modulated+by+G4+resolvase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Yin Yang 1 contains G-quadruplex structures in its promoter and 5'-UTR and its expression is modulated by G4 resolvase 1.</a> Nucleic Acids Res. 40 (3), 1033-1049 (2012).</li>
<li>Tran, H., Schilling, M., Wirbelauer, C., Hess, D., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+mRNA+deadenylation+and+decay+by+the+exosome-bound%2C+DExH+protein+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Facilitation of mRNA deadenylation and decay by the exosome-bound, DExH protein RHAU.</a> Mol Cell. 13 (1), 101-111 (2004).</li>
<li>Yoo, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHX36+enhances+RIG-I+signaling+by+facilitating+PKR-mediated+antiviral+stress+granule+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">DHX36 enhances RIG-I signaling by facilitating PKR-mediated antiviral stress granule formation.</a> PLoS Pathog. 10 (3), e1004012(2014).</li>
<li>Lai, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEAH-box+helicase+RHAU+is+an+essential+gene+and+critical+for+mouse+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">The DEAH-box helicase RHAU is an essential gene and critical for mouse hematopoiesis.</a> Blood. 119 (18), 4291-4300 (2012).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DDX1%2C+DDX21%2C+and+DHX36+helicases+form+a+complex+with+the+adaptor+molecule+TRIF+to+sense+dsRNA+in+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">DDX1, DDX21, and DHX36 helicases form a complex with the adaptor molecule TRIF to sense dsRNA in dendritic cells.</a> Immunity. 34 (6), 866-878 (2011).</li>
<li>Kim, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aspartate-glutamate-alanine-histidine+box+motif+%28DEAH%29%2FRNA+helicase+A+helicases+sense+microbial+DNA+in+human+plasmacytoid+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aspartate-glutamate-alanine-histidine box motif (DEAH)/RNA helicase A helicases sense microbial DNA in human plasmacytoid dendritic cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (34), 15181-15186 (2010).</li>
<li>BD Biosciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf">http://www.bd.com/ds/technicalCenter/misc/difcobblmanual_2nded_lowres.pdf</a> (2016).</li>
<li>Booy, E. P., McRae, E. K., McKenna, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+characterization+of+G4+quadruplex+telomerase+RNA+unwinding+by+the+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Biochemical characterization of G4 quadruplex telomerase RNA unwinding by the RNA helicase RHAU.</a> Methods Mol Biol. 1259, 125-135 (2015).</li>
<li>Lattmann, S., Giri, B., Vaughn, J. P., Akman, S. A., Nagamine, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+amino+terminal+RHAU-specific+motif+in+the+recognition+and+resolution+of+guanine+quadruplex-RNA+by+the+DEAH-box+RNA+helicase+RHAU%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Role of the amino terminal RHAU-specific motif in the recognition and resolution of guanine quadruplex-RNA by the DEAH-box RNA helicase RHAU.</a> Nucleic Acids Res. 38 (18), 6219-6233 (2010).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo representa una expresión, purificación, y el esquema de cuantificación altamente eficiente para el aislamiento del producto génico DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, también llamado Rhau y DHX36) (Figura 1). Este protocolo utiliza dos etapas de purificación: Su-etiqueta de purificación de afinidad en perlas de afinidad de cobalto y purificación enzimática sobre perlas G4-ADN-conjugado. El último paso es único, ya que se aprovecha de la afinidad apretado, alta especificidad, y anulación actividad...

estructuras G4 son estructuras secundarias de ácidos nucleicos altamente estables que se forman dentro de las regiones ricas en guanina del ADN y ARN. Estructuras G4 se estabilizan a través de interacciones Hoogsteen enlazantes y coordinan unión dentro de la cavidad central con cationes monovalentes (es decir. K + y Na +) que contribuyen significativamente a la notable estabilidad térmica de las estructuras G4 1, 2. Los primeros estudios sugirieron que la bioinformática el genoma humano contiene&gt; 375.000 &quot;potenciales formar G4-motivos&quot; 3, 4. Estimaciones del estudio más recientes sugieren que el número de motivos G4 es mayor en un factor de 2 a 5 mayo, mientras que otro estudio predice 716,310 potenciales secuencias de formación de G4-distintas en el genoma humano 6. G4 formador de secuencias están evolutivamente conservada y no dispersa aleatoriamente enel genoma. Motivos G4 se enriquecen en regiones codificantes de genes, y más del 40% de todos los promotores de genes contienen motivos G4 7. Curiosamente, el grado de enriquecimiento de motivos G4 en un gen se ha demostrado para sugerir la función del gen. Por ejemplo, los proto-oncogenes y genes implicados en el desarrollo tienen significativamente mayor enriquecimiento de las estructuras G4 que los genes supresores de tumores 8, 9. Con altas estabilidades térmicas, una presencia casi omnipresente en todo el genoma, y ​​el potencial de afectar significativamente los procesos celulares, no es sorprendente encontrar que la célula ha evolucionado enzimas para gestionar estas estructuras. Una de estas enzimas es G4 Resolvase1 (G4R1; también llamado Rhau y DHX36), que se caracterizó como la fuente de la mayoría de tetramolecular G4-ADN actividad resolver en las células humanas (HeLa) 10. Desde entonces, se ha demostrado that G4R1 fuertemente se une y catalíticamente desenrolla tetramolecular y unimolecular G4-DNA y RNA-G4 con los KDs reportados más ajustados para una proteína de unión G4-11, 12, 13. Además, la actividad G4-resolución de G4R1 se ha implicado en una amplia gama de procesos bioquímicos y celulares, incluyendo la biología de los telómeros / telomerasa 11, 14, 15, 16, transcripción y corte y empalme 17, 18, 19, 20, el desarrollo 21, la hematopoyesis 21, y la regulación inmune 22, 23. Con una preponderancia de las secuencias G4 específicamente situado a lo largo del genoma y la diversa p celularrocesos que G4R1 recientemente se ha implicado de estar involucrado con, la capacidad de expresar y purificar eficientemente altamente activa rG4R1 será de suma importancia para dilucidar los mecanismos bioquímicos y comportamientos de esta proteína. Aquí, demostramos una novela expresión y esquema de purificación (Figura 1) que se aprovecha de la dependiente de ATP, la actividad G4-resolución de rG4R1 para aislar eficientemente enzima activa. Este sistema podría ser adaptado para purificar otras enzimas de ácido nucleico dependientes de ATP para el cual el producto de la reacción enzimática ya no es un sustrato para la unión, como es el caso de G4R1.

<table><tbody><tr><td>Plásmido TriEx4-DHX36</td><td>Addgene</td><td>68368</td><td></td></tr><tr><td>Rosetta2(DE3)células competentes de plysS</td><td>Novagen</td><td>71403-4</td><td></td></tr><tr><td>S.O.C</td><td>medio Thermo Fisher Scientific</td><td>15544034&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Difco Caldo Excelente</td><td>Becton Dickinson</td><td>243820</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>35 &micro; g/mL en placas bacterianas/cultivos grandes</td></tr><tr><td>Carbenicillina (cultivo de células vegetales probado)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3416</td><td>50 &micro; g/mL en placas bacterianas/cultivos grandes</td></tr><tr><td>Isopropil &beta;-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima (de clara de huevo de gallina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1963-B</td><td>o de fuente estándar</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 7</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1966</td><td>o de fuente estándar</td></tr><tr><td>1,5 M Tris-HCl, pH 8,8</td><td></td><td></td><td>Para fundición de gel resolutivo (para gel de cuantificación de proteínas); De fuente estándar</td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl, pH 6.8</td><td></td><td></td><td>Para fundición de gel de apilamiento (para gel de cuantificación de proteínas); De fuente estándar</td></tr><tr><td>1 M Tris-Acetate, pH 7.8</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1981</td><td>o de fuente estándar</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (1&nbsp; Solución M)</td><td>Life Technologies</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1665</td><td>o de fuente estándar</td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanol (2-BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8849</td><td></td></tr><tr><td>Hemisulfato de leupeptina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Perlas paramagnéticas de estreptavidina</td><td>Promega</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8&nbsp;</td><td>Suministro Científico Universal Co.&nbsp;</td><td>0718</td><td>o de fuente estándar</td></tr><tr><td>0.2 M EDTA, pH 6</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td></td><td>De la fuente estándar; inicialmente ajuste el pH con NaOH, luego ajuste el pH nuevamente con HCl. &nbsp;</td></tr><tr><td>A-lactoalbúmina (Tipo 1 de la leche bovina)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5385</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de afinidad metálica de cobalto</td><td>Clonetech 635502</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético, glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5'-Trifosfato (de origen bacteriano)</td><td>Sigma</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Solución de acrilamida al 40%/Bis (37,5:1)</td><td>Biorad</td><td>161-0148</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td>para fabricar tampón de funcionamiento en gel de proteínas (192 mM de glicina, 25 mM de Tris Base, 0,1% SDS)</td></tr><tr><td>10% de dodecil sulfato de sodio (SDS)</td><td>Universal Scientific Supply Co.&nbsp;</td><td>1667</td><td>para hacer tampón de funcionamiento en gel de proteínas (192 mM de glicina, 25 mM de Tris Base, 0,1% SDS); o de fuente estándar</td></tr><tr><td>10x TBE&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11666703001</td><td>o de la fuente estándar</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>para hacer tampón de funcionamiento en gel de proteínas (192 mM de glicina, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); De fuente estándar</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>411019</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr> Marcadores MW de <tr><td>proteína de amplio rango</td><td>Promega</td><td>V8491</td><td></td></tr><tr><td>Oligón Z33 biotinilado ("Z33-Bio")</td><td>Oligonucleótidos Etc</td><td></td><td>5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'</td></tr><tr><td>TAMRA-Z33 oligonucleótidos ("Z33-TAM")</td><td>oligonucleótidos etc</td><td></td><td>5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GGG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'</td></tr><tr><td>Placa TLC con recubrimiento de flúor</td><td>Life Technologies AM10110</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2637</td><td>30% en H2O</td></tr><tr><td>Coomassie R-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>27816</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td>Lámpara</td><td></td><td></td> UV multibanda <td>Capaz de emitir luz UV a 365 nm</td></tr><tr><td>Centrífuga de mesa (con rotor de cubeta oscilante)</td><td></td><td></td><td>Capaz de enfriarse a 4 & grados; </td></tr><tr><td>C Microcentrífuga</td><td></td><td></td><td>Capaz de ser enfriada a 4 &° C</td></tr><tr><td>Digital Sonfier</td><td>Branson</td><td></td><td>O equivalente capaz de emitir impulsos de sonicación (30% de amplitud, 2 s ON/2 s OFF)</td></tr><tr><td>50 &deg; C baño</td><td></td><td></td><td>de agua Para la formación de Z33 en cuádruple</td></tr><tr><td>37 &deg; C incubadora de bacterias</td><td></td><td></td><td>Para transformaciones bacterianas y crecimiento inicial durante la noche de grandes cultivos de Rosetta2 E. coli transformados con TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>37 &deg; C/14&nbsp; &deg; Incubadora de agitación C para bacterias</td><td></td><td></td><td>Para el crecimiento y la inducción de proteínas de grandes cultivos de Rosetta2 E. coli transformado con TriEx4-DHX36</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro</td><td></td><td></td><td>capaz de leer OD600; capaz de leer concentraciones de oligómeros basadas en la secuencia de bases (como Biorad SmartSpec 3000)</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr>Tubos <td></td> de<td>tiras de PCR</td><td></td><td>De fuente estándar Tubos de</td></tr><tr><td>centrífuga de 15 y 50 mL (polipropileno)</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (2,0 mL)</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Frascos de centrífuga de 500 mL (polipropileno)</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0500</td><td></td></tr><tr><td>Matriz estándar de puntas de pipeta y pipetas serológicas</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr>Puntas <td></td><td></td><td>de carga de gel</td><td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Pipeta</td><td></td><td></td> de repetición automática <td>Para la alícuota rápida de rG4R1; De fuente estándar</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido <td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Hielo</td><td></td><td></td> seco <td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Tampón de muestras Laemlli&nbsp;</td><td>Biorad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>Aparato para el funcionamiento de geles de gran tamaño</td><td>Biorad</td><td></td><td>Hemos utilizado el aparato celular Protean II xi de Biorad</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Life Technologies</td><td>12301D</td><td>Utilizamos un imán de One Lambda (ahora una marca de Thermo Fisher Scientific); y Life también es una subsidiaria de Thermo, por lo que el imán enumerado aquí debería ser un reemplazo adecuado</td></tr><tr><td>Hojas</td><td></td><td></td> <td>de afeitarDe fuente estándar Papel de</td></tr><tr><td>filtro y embudo</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Cazuela</td><td></td><td></td><td>de vidrio De fuente estándar</td></tr><tr><td>Agitador</td><td></td><td></td> orbital <td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>De fuente estándar</td>Protectores <td></td><td></td> de</tr><tr><td>hojas transparentes</td><td></td><td></td><td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Escáner y asociados Software</td><td></td><td></td> TWAIN <td>De fuente estándar</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td> de análisis de imágenes <td>Como Fuji Multiguage, o</td></tr><tr><td>equivalente Microsoft Excel</td><td></td><td></td><td>O equivalente&nbsp;</td></tr></tbody></table>

un enfoque adn afinidad g-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa g4 resolvase1

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

estructuras de ácidos nucleicos de orden superior llamado G-quadruplex (G4s, estructuras G4) se pueden formar en las regiones ricas en guanina del ADN y ARN y de alta estabilidad térmica. Hay&gt; 375.000 secuencias de formación de G4-putativo en el genoma humano, y que se enriquecen en regiones promotoras, regiones no traducidas (UTRs), y dentro de la repetición telomérica. Debido a la posibilidad de que estas estructuras afectan a los procesos celulares, tales como la replicación y transcripción, la célula ha evolucionado enzimas para su gestión. Una de estas enzimas es G4 resolvasa 1 (G4R1), que bioquímicamente fue co-caracteriza por nuestro laboratorio y Nagamine et al. y encontrado que se unen muy fuertemente a ambos G4-DNA y RNA-G4 (K d en el intervalo de bajo pM). G4R1 es la fuente de la mayoría de la actividad G4-resolver en lisados ​​de células HeLa y desde entonces ha sido implicado a desempeñar un papel en el metabolismo de los telómeros, el desarrollo de la linfa, la transcripción de genes, la hematopoyesis, y la vigilancia inmune. La capacidad a EFcientemente expresar y purificar catalíticamente activa G4R1 es de importancia para los laboratorios interesados ​​en adquirir una mayor comprensión de la interacción cinética de las estructuras y las enzimas G4 G4-resolver. A continuación, describimos un método detallado para la purificación de G4R1 recombinante (rG4R1). El procedimiento descrito incorpora la tradicional de purificación basados ​​en la afinidad de una enzima marcada con histidina C-terminal expresada en bacterias con codones optimizados humanos con la utilización de la capacidad de rG4R1 de unirse y descansar G4-ADN para purificar la enzima altamente activo en un ATP- etapa de elución dependiente. El protocolo también incluye una etapa de control de calidad, donde la actividad enzimática de rG4R1 se mide mediante el examen de la capacidad de la enzima purificada para relajarse G4-ADN. Un método se describe también que permite la cuantificación de rG4R1 purificado. Se discuten las adaptaciones alternativas de este protocolo.

Este protocolo (Figura 1) se obtiene rutinariamente casi puro, rG4R1 catalíticamente activo. Como medida de la actividad enzimática, se observa típicamente que el 50% de 0,2 pmol de G4-ADN tetramolecular marcado con TAMRA se convierte en monómeros dentro de la 0,2 - gama l 0.013 de rG4R1, como se ensayó mediante el ensayo de actividad G4 descrito anteriormente (Figura 2). Tinción de Coomassie de rG4R1 purificado indica una única banda en el 120 tamaño esperado kDa, con una banda contami...

G4 Resolvase1 se une a estructuras de G-quadruplex (G4) con la afinidad reportado más apretado para una proteína de unión-G4 y representa la mayoría de la G4-ADN anulación actividad en las células HeLa. Se describe un nuevo protocolo que aprovecha la afinidad y anulación actividad dependiente de ATP de G4-Resolvase1 para purificar específicamente G4R1 recombinante catalíticamente activo.

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

El objetivo general de este método es aislar la proteína helicasa G4 Resolvase1 de cuadruplex-G a partir de un sistema de expresión bacteriana, utilizando un paso único de purificación dependiente de ATP para obtener una enzima casi pura y catalíticamente activa. Este método puede ayudar a los investigadores a obtener la proteína recombinante G4 Resolvase1 casi pura y catalíticamente activa para su uso en una amplia variedad de ensayos bioquímicos in vitro. La principal ventaja de esta técnica es que excluye de la preparación proteica aquellas enzimas mal plegadas o que de otro modo sean catalíticamente inactivas.La idea de utilizar ATP para eluir la helicasa de cuádruplex G surgió tras no poder eluir la enzima catalíticamente activa de las perlas G4, incluso a concentraciones de sal excepcionalmente altas. Prepare y cultive grandes cultivos bacterianos que expresen la resolvasa 1 de cuádruplex G o G4R1 según se describe en el protocolo escrito. Derrita el pellet bacteriano en tres mililitros de tampón TN a temperatura ambiente.Sostenga los tubos en la mano y agite suavemente para descongelar y resuspender el pellet bacteriano. Una vez descongelado y resuspendido de manera relativa

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Investigación

JoVE Journal

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Bioquímica

Estructura cristalina de los complejos de proteínas de ADN puede proporcionar información sobre la función de proteínas, el mecanismo, así como, la naturaleza de la interacción específica. Aquí reportamos cómo optimizar la longitud, la secuencia y los extremos del ADN dúplex en co-cristalización...

Iterativo de optimización de dúplex de ADN para la cristalización de SEQA-ADN complejos

Describimos ensayos discontinuos sensibles basados en gel para examinar la cinética de la iniciación de la hebra rezagada utilizando las proteínas de replicación del bacteriófago T7.

Cinética de la síntesis de ADN de hebra Quedando<em&gt; In Vitro</em&gt; Por el bacteriófago T7 proteínas de replicación

Una plataforma de una sola molécula magnética Pinzas para manipular G-quadruplexes se divulga, que permite el estudio de estabilidad de G4 y regulación por diversas proteínas.

Manipulación de una sola molécula de G-quadruplexes por pinzas magnéticas

El protocolo actual demuestra el uso de un ensayo de amplificación exponencial rápido, de 3 etapas, basado en aptámeros para detectar objetivos. La preparación de la muestra, la amplificación de la señal y el desarrollo del color están cubiertos para implementar este sistema para reconocer la presencia de teofilina sobre la de cafeína.

Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

Las bis-3-cloroperiperidinas (B-CeP) son sondas químicas útiles para identificar y caracterizar estructuras G-cuádruples en plantillas de ADN in vitro. Este protocolo detalla el procedimiento para realizar reacciones de sondeo con B-CePs y para resolver los productos de reacción mediante electroforesis en gel de poliacrilamida de alta resolución.

In vitro Mapeo químico de estructuras de ADN G-cuádruple por bis-3-cloropiperidinas

Un obstáculo importante para tecnologías como CRISPR son los eventos fuera del objetivo que pueden alterar genes vitales. La «circularización para la notificación in vitro de los efectos de la escisión mediante secuenciación» (CIRCLE-seq) es una técnica diseñada para identificar los sitios de escisión no intencionados. Este método mapea la actividad de CRISPR-Cas9 en todo el genoma con alta sensibilidad y sin sesgos.

CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

Este protocolo demuestra la realización de un ensayo de una sola molécula para la visualización en vivo del desenrollado del ADN por helicasa CMG. Describe (1) la preparación de un sustrato de ADN, (2) la purificación de la helicasa CMG de Drosophila melanogaster marcada con fluorescencia, (3) la preparación de una celda de flujo microfluídica para la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) y (4) el ensayo de desenrollado de ADN de una sola molécula.

Visualización en tiempo real de una sola molécula del desenrollado del ADN mediante CMG Helicase

Este protocolo describe un ensayo de replicación de ADN de una sola molécula basado en microscopía de fluorescencia, que permite la visualización en tiempo real de las interacciones entre las ADN polimerasas y obstáculos como las estructuras G-cuádruples.

Visualización de fluorescencia de una sola molécula de la dinámica de la ADN polimerasa en G-Quadruplex

Se presenta un protocolo para la producción, purificación y uso de vesículas de membrana externa (OMV) empaquetadas en enzimas que proporcionan una mayor estabilidad enzimática para su implementación en diversas aplicaciones.

Dirigida Packaging de proteínas dentro de la membrana externa de vesículas de<em&gt; Escherichia coli</em&gt;: Diseño, Producción y Purificación

Aquí, se presenta un método para expresar y purificar S100A12 (calgranulina C). Se describe un protocolo para medir su actividad antimicrobiana contra el patógeno humano H. pylori .

Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12

Aprende a purificar la helicasa G4 Resolvase1 mediante un método de afinidad con ADN G-cuádruplex y elución dependiente de ATP. Esta técnica proporciona enzima catalíticamente activo para ensayos bioquímicos in vitro.

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

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