Grabaciones con abrazadera de parche de células enteras para la determinación electrofisiológica de la selectividad iónica en canalrhodopsins

El objetivo general de este experimento es determinar la selectividad del cloruro de nuevos canales iónicos activados por luz. Este método puede responder a preguntas clave en la biofísica de las canalrodopsinas, como las amplitudes de la fotocorriente, la cinética y la selectividad iónica. La principal ventaja de esta técnica es la lectura directa de la actividad del canal biofísico que es rápida y fácil de replicar.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque cada paso del procedimiento experimental, desde la preparación de las células HEK hasta el registro de las fotocorrientes, tiene que ser optimizado. La siembra y transección de las células HEK será demostrada por Altina Klein. Para comenzar este procedimiento, pese los componentes sólidos para 100 mililitros de las soluciones tamponadas intracelulares y 500 mililitros de las soluciones tamponadas extracelulares en vasos de precipitados separados.

Y luego agregue la cantidad respectiva de las soluciones madre preparadas. A continuación, agregue agua ultrapura y ajuste cuidadosamente el pH usando ácidos y bases. A continuación, ajuste la osmolaridad con glucosa a 290 miliosmoles y 320 miliosmoles para las soluciones intracelular y extracelular, respectivamente.

En este procedimiento, coloque hasta tres cubreobjetos de vidrio recubiertos de lisina uno al lado del otro en una placa de Petri de 35 milímetros. A continuación, siembre 1,5 veces 10 a la quinta célula HEK en dos mililitros de DMEM estándar suplementado con 10% de FBS y un micromolar de retinol en cada plato. Para transfectar las células de cada plato, prepare una solución de dos microgramos de ADN plasmídico en 250 microlitros de DMEM sin FBS y seis microlitros de reactivo de transfección.

Después de 15 minutos de incubación, agregue suavemente la solución a las células. Antes de medir, extraiga algunas pipetas de parche de baja resistencia con un extractor de micropipetas y pula al fuego. Guarde las pipetas en un recipiente libre de polvo para el día de la medición.

30 minutos antes de las grabaciones, encienda todos los componentes de configuración para calentar hasta la temperatura de trabajo. Asegúrese de que los tampones estén a temperatura ambiente. Para empezar, selle la cámara de medición con silicona para evitar fugas del tampón externo.

A continuación, coloque un cubreobjetos en la cámara y ciérrelo. Llene la cámara cuidadosamente con tampón extracelular para evitar que las células se desprendan. Guarde la placa de Petri con otros cubreobjetos en una incubadora para el próximo conjunto de experimentos.

A continuación, coloque la cámara de medición bajo el microscopio utilizando el objetivo 40X para la visualización de células. A continuación, coloque un puente de barrena sobre el electrodo del baño y colóquelo en la cámara junto con el sensor de nivel de líquido y la salida de perfusión del manipulador del baño. Intercambie la solución extracelular dos veces con un mililitro de solución externa fresca para eliminar el medio de cultivo residual y las células desprendidas.

Enfoca las células y busca una célula transfectada que necesite ser aislada de otras células. A continuación, utiliza un conjunto de filtros de triple banda y luz naranja para excitar y visualizar mCherry. A continuación, llene una de las pipetas extraídas con la solución intracelular.

Y elimine las burbujas de aire volteando la pipeta varias veces. A continuación, monte la pipeta en el soporte de la pipeta y aplique un poco de presión positiva para evitar la obstrucción de la punta. Localice la punta de la pipeta de parche bajo el microscopio y desplácela cerca de la célula con el micromanipulador.

Dentro del software de adquisición de datos, inicie la prueba de membrana en modo Baño y aplique un paso de voltaje. Compruebe si la resistencia de la pipeta está en el rango deseado de 1,3 a 3,0 megaohmios. A continuación, ponga a cero las corrientes de compensación y ajuste el potencial de la pipeta girando la perilla de compensación de la pipeta en el amplificador.

Para establecer un parche en la configuración de celda completa, acérquese lentamente a la celda con la pipeta de parche desde la parte superior y libere la presión positiva justo antes de tocar la celda. A veces, la configuración adjunta a la celda se forma después de eso. Después de acercarse a la celda, cambie la prueba de membrana del modo de baño al modo de parche.

Compense la capacitancia de la pipeta girando la perilla de compensación de capacitancia de la pipeta para obtener una respuesta plana del pulso de prueba. Cambie la prueba de membrana al modo de celda. A continuación, rompa el parche sin destruir el sello aplicando pulsos cortos de presión negativa o presión negativa con fuerza creciente para obtener la confirmación de toda la célula.

Inicie la compensación de resistencia en serie configurando los dos parámetros de celda completa, capacitancia de celda y resistencia en serie. En el panel de compensación de resistencia en serie, active la predicción y la corrección hasta el 90%A continuación, encienda el interruptor de compensación de toda la célula y ajuste los parámetros de toda la célula de forma iterativa para obtener una respuesta de sellado de prueba idealmente plana. Después de establecer la configuración de la célula completa, espere al menos dos minutos antes de registrar para garantizar un reemplazo suficiente de la solución intracelular a través de la pipeta de parche.

Registre las corrientes inducidas por la luz a diferentes potenciales de retención. A continuación, cambie el tampón extracelular a cloruro bajo en la cámara al menos cinco veces sin destruir el parche y registre otra relación de voltaje de corriente a la nueva concentración de cloruro. Esta figura muestra que durante la iluminación con luz verde, PsACR1 presenta una corriente transitoria rápida que decae rápidamente a un nivel de corriente estacionaria.

Una vez que se apaga la luz, las fotocorrientes decaen a cero en milisegundos. La reducción de la concentración de cloruro extracelular suprime por completo las fotocorrientes dirigidas hacia el exterior. El intercambio de la concentración de cloruro extracelular provoca un cambio del potencial de inversión que se puede deducir de un gráfico de voltaje de corriente.

La evaluación de los potenciales de inversión de múltiples mediciones cuantifica el cambio dramático del potencial de inversión causado por la variación de la concentración externa de cloruro. Sorprendentemente, los potenciales de inversión medidos corresponden directamente a los potenciales de Nernst calculados para el cloruro, lo que confirma la alta selectividad del cloruro de PsACR1. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar registros electrofisiológicos de fotocorrientes inducidas por luz en células HEK que expresan canalrodopsina.

Una vez dominado, todo el procedimiento se puede realizar en cuatro días, mientras que el registro de las fotocorrientes lleva varias horas. Como complemento a este procedimiento, se pueden realizar métodos espectroscópicos y de mutagénesis dirigida al sitio para dilucidar aún más las características estructurales y los mecanismos celulares de las canalrodopsinas. La caracterización y la ingeniería molecular de la canalrodopsina allanaron el camino para que los investigadores en neurociencia manipularan la excitabilidad de neuronas seleccionadas mediante la luz.