Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

El objetivo general de este experimento de microscopía de fuerza atómica es resolver las interacciones de las proteínas de reparación del ADN con los sitios de daño en el ADN y distinguir entre diferentes interacciones de ADN por varios complejos de proteínas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, como la forma en que un sistema de reparación del ADN en particular logra el reconocimiento de sus lesiones objetivo en el ADN. La principal ventaja de esta técnica es que podemos ver y analizar directamente los diferentes tipos de complejos que intervienen en el proceso de reconocimiento de lesiones de ADN.

El demostrador del procedimiento estará a cargo de Nicolas Wirth, quien utilizó este enfoque durante su investigación de licenciatura. Para empezar, prepare un sustrato de ADN adecuado generando un espacio de ADN monocatenario en un plásmido. Rellene el vacío con oligonucleótidos de ADN monocatenario modificados y, por último, linealice el ADN plasmático utilizando las enzimas de restricción adecuadas.

Para estos experimentos, los sustratos de ADN de doble cadena tienen aproximadamente 1.000 pares de bases de largo y contienen una lesión de ADN, así como una región desapareada llamada burbuja de ADN para la carga de proteínas en el ADN. A continuación, prepare una muestra de ADN proteico para el análisis de AFM pipeteando primero 10x Reaction Buffer y agua en un tubo de microrreacción. Luego, agregue el ADN y las proteínas bajo investigación.

Por ejemplo, aquí, 100 nanomolares de la muestra de ADN y un micromolar o cada una de las proteínas de reparación de escisión de nucleótidos eucariotas XPD y p44. Luego, incuba la reacción durante 30 minutos a 37 grados centígrados en un bloque de calor. Después de la incubación, gire brevemente la muestra.

A continuación, prepare un sustrato de mica para colocar la muestra. Use un bisturí para cortar un trozo de mica de un centímetro por un centímetro de una tira más grande. Luego, use un trozo de cinta adhesiva para quitar las capas superiores de la mica y revelar una superficie de sustrato limpia, plana y anatómicamente lisa.

Dilate la muestra de ADN de la proteína de cincuenta a cien veces en tampón de deposición de AFM e inmediatamente deposita 20 microlitros de la muestra diluida en la superficie de la mica. El factor de dilución depende de la concentración de la muestra. Inmediatamente después de depositar la muestra en la superficie de mica, enjuague la muestra tres o cuatro veces con unos pocos mililitros de agua filtrada y desionizada y seque el exceso de líquido.

Utilice un chorro suave de nitrógeno para secar la muestra. Por último, utilice cinta adhesiva para fijar la muestra en sus bordes en un portaobjetos de microscopio. Coloque la muestra en el centro de la platina AFM y utilice almohadillas magnéticas para fijar el portaobjetos del microscopio en la platina.

A continuación, inserte la punta AFM en el soporte de la punta. Fije la punta en el soporte debajo de una abrazadera apretando el tornillo para que quede apretado con los dedos. Una vez asegurado, introduzca el soporte de la punta en el cabezal de medición AFM.

Utilice los tornillos de posicionamiento para mover la muestra en una posición central. Coloque el cabezal de medición AFM en la parte superior de la muestra, asegurándose de que el cabezal se mantenga estable con sus patas dentro de las hendiduras de la etapa. A continuación, alinee el láser AFM en la parte posterior del voladizo para obtener una intensidad de señal óptima.

Mire la señal de reflexión en la ventana de vídeo AFM para posicionar el láser de forma tosca. Para este modelo de AFM, gire las ruedas del lado derecho y de la parte posterior del cabezal de medición de AFM para ajustar las posiciones X e Y del láser AFM con el fin de dirigirlo centralmente hacia el extremo del voladizo. A continuación, optimice la señal de suma del detector ajustando la posición del láser con las dos ruedas.

Dirija la reflexión del láser AFM al centro del detector poniendo a cero las diferentes señales de los diodos superior e inferior del conjunto de detectores. Para este paso, gire el tornillo en el lado izquierdo del cabezal de medición para este modelo AFM. A continuación, determine la frecuencia de residencia en voladizo entrando en la ventana de ajuste del panel maestro en el software.

Elija una amplitud correspondiente a una entrada de un voltio para el piezoeléctrico que impulsa la oscilación en voladizo y luego ajuste la frecuencia de oscilación a menos 5%, ligeramente más baja que la frecuencia de residencia. Ahora realice un ajuste automático de frecuencia y ponga a cero la fase de la oscilación. Deje que el sistema alcance el equilibrio térmico durante aproximadamente una hora antes de comenzar a tomar imágenes, para evitar la deriva.

Cuando esté listo para comenzar a tomar imágenes, en el panel principal del software, establezca un punto de ajuste de protección y prepárese para acercar la punta a la superficie de la muestra seleccionando activar. Baje la rueda delantera del cabezal AFM manualmente hasta alcanzar el ajuste de protección, o punto de ajuste. A continuación, baje con cuidado la rueda delantera hasta que la señal del sensor Z se extienda completamente hacia la izquierda.

Activar la mesa de oscilación de vibraciones y cerrar el recinto de aislamiento acústico. A continuación, baje el punto de ajuste en el software AFM utilizando la rueda de hámster para acoplar con precisión la punta del AFM a la muestra. Para realizar imágenes en modo de golpeteo en el régimen repulsivo, baje el punto de ajuste hasta que la señal de fase sea ligeramente más baja que la fase de nivel libre.

Luego, comience a escanear la muestra. Utilice la velocidad de escaneo de 2,5 micrómetros por segundo en áreas de superficie de imagen de cuatro micrómetros por cuatro micrómetros u ocho micrómetros por ocho micrómetros cuadrados con resoluciones de píxeles de 2, 048 o 4, 096, respectivamente; y presione el botón Hacer escaneo. Preseleccione los complejos de ADN de proteínas relevantes mediante la inspección visual directa de las imágenes en el software AFM.

Para las muestras de XPD, los posibles complejos incluyen el ADN XPD p44, así como el ADN XPD y el ADN p44 con tamaños claramente diferentes debido a las diferentes masas moleculares de XPD y p44. Mida los volúmenes de los picos de proteínas individuales en el ADN utilizando la herramienta de sección en la ventana de análisis para medir la altura y el diámetro de las secciones de los picos de proteínas con los cursores de la ventana de sección. Utilice estos valores para determinar el volumen de los picos utilizando modelos matemáticos simples para verificar el tipo complejo.

Por último, calibre su sistema AFM con una gama de proteínas con pesos moleculares conocidos para traducir estos volúmenes en pesos moleculares aproximados de proteínas y complejos de proteínas. Para determinar características adicionales, como las longitudes de los fragmentos de ADN, las posiciones de los complejos de proteínas en el ADN y sus especificidades del sitio objetivo o los ángulos de las bandas de ADN, consulte el protocolo de texto adjunto. Aquí se muestra una imagen AFM con tres tipos diferentes de complejos unidos al ADN que se pueden distinguir en función de sus diferentes tamaños.

Los complejos de clase uno son consistentes solo con el cofactor activador de helicasa p44, los complejos de clase dos consisten solo en la proteína XPD y los complejos de clase tres consisten tanto en XPD como en p44, ya que el reconocimiento de legión por XPD requiere la activación de su actividad helicasa por p44, y solo los complejos de clase tres muestran reconocimiento de lesiones. Con el fin de identificar diferentes estrategias de reconocimiento de lesiones, se midieron las ubicaciones de las proteínas en los sustratos de ADN para la carga de proteínas en una burbuja de ADN en las cinco direcciones principales o tres principales de una lesión de ADN que se muestra en rojo para helicasas NER procariotas y eucariotas. En las distribuciones de posición de las proteínas, el reconocimiento de las lesiones de ADN puede verse como un pico debido a una mayor unión en la posición de la lesión de ADN.

La helicasa procariota NER UVRB y su contraparte eucariota, XPD, muestran diferentes estrategias de reconocimiento de lesiones CPD que indican diferentes preferencias de hebras de ADN. En concreto, las lesiones de CPD se reconocen en la hebra translocada por UVRB, pero preferentemente en la hebra opuesta, no translocada, por XPD. Una vez dominado, este método se puede realizar en unas pocas horas o días, incluido el análisis.

Es importante trabajar con muestras de proteínas y ADN de alta pureza para poder interpretar las características de las imágenes de AFM y diseñar cuidadosamente el sustrato de ADN en función del sistema biológico y de la pregunta que se quiera abordar. Además, los métodos de conjunto, como el espacio de electroforesis en gel, el desplazamiento de electromovilidad o los ensayos de incisión de ADN son, por supuesto, muy complementarios a estos experimentos de AFM; y estos métodos pueden ayudar a abordar preguntas adicionales, como las afinidades de unión al ADN o las actividades de escisión de lesiones de ADN. Esta técnica es un enfoque relativamente rápido y sencillo para visualizar directamente los complejos de ADN de proteínas, y estos complejos nos dan una buena imagen de los procesos que ocurren en un sistema biológico.

Por supuesto, esto no solo es útil para comprender los procesos de reparación del ADN, sino que también se puede aplicar a otros sistemas de ADN de proteínas. Después de ver este video, debería tener una idea bastante clara de cómo preparar una muestra en su sistema de ADN de proteínas favorito, cómo obtener imágenes por AFM y cómo extraer parámetros útiles para una interpretación de sus datos.