Name: La espectrometría de masa y enfoques basados en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia In Vitro Cultivos Celulares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a evaluar la actividad de citocromo P450 en cultivos celulares mediante espectrometría de masas y sondas luminogénicas. Este método mejora la relevancia de los modelos in vitro para estudios de metabolismo de fármacos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores agradecen a Epithelix Sarl y Biopredic International por proporcionar las micrografías de las células de las vías respiratorias y las células hepáticas y a Neil Smith por la figura que ilustra el procedimiento experimental.

<ol><li>Garcia-Canton, C., Minet, E. Metabolic Characterization of Cell Systems Used in In Vitro Toxicology Testing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGarcia-Canton%2C+C+%22Encyclopedia+of+Drug+Metabolism+and+Interactions%22">Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions</a>. , 1-31 (2016).</li>
<li>Croom, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolism+of+xenobiotics+of+human+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Mol.+Biol.+Transl.+Sci%22%5BJournal%5D)">Metabolism of xenobiotics of human environments.</a> Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).</li>
<li>Lewis, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((57+varieties%3A+the+human+cytochromes+P450%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacogenomics%22%5BJournal%5D)">57 varieties: the human cytochromes P450.</a> Pharmacogenomics. 5, 305-318 (2004).</li>
<li>Jancova, P., Anzenbacher, P., Anzenbacherova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+II+drug+metabolizing+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Pap.+Med.+Fac.+Univ+Palacky%22%5BJournal%5D)">Phase II drug metabolizing enzymes.</a> Biomed. Pap. Med. Fac. Univ Palacky. 154, Olomouc. Czech. Repub. 103-116 (2010).</li>
<li>Dekant, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+biotransformation+and+bioactivation+in+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22EXS%22%5BJournal%5D)">The role of biotransformation and bioactivation in toxicity.</a> EXS. 99, 57-86 (2009).</li>
<li>Donato, M. T., Lahoz, A., Castell, J. V., Gomez-Lechon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+a+tool+for+in+vitro+drug+metabolism+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">Cell lines: a tool for in vitro drug metabolism studies.</a> Curr. Drug Metab. 9, 1-11 (2008).</li>
<li>Guillouzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+hepatoma+HepaRG+cells%3A+a+highly+differentiated+model+for+studies+of+liver+metabolism+and+toxicity+of+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol.+Interact%22%5BJournal%5D)">The human hepatoma HepaRG cells: a highly differentiated model for studies of liver metabolism and toxicity of xenobiotics.</a> Chem. Biol. Interact. 168, 66-73 (2007).</li>
<li>Huang, S., Wiszniewski, L., Constant, S., Roggen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+in+vitro+reconstituted+3D+human+airway+epithelia+%28MucilAir%29+to+assess+respiratory+sensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Potential of in vitro reconstituted 3D human airway epithelia (MucilAir) to assess respiratory sensitizers.</a> Toxicol. In Vitro. 27, 1151-1156 (2013).</li>
<li>Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-digital+image+capture+and+whole-field+analysis+of+ciliary+beat+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency.</a> J. Microsc. 211, 103-111 (2003).</li>
<li>Kuehn, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+assessment+of+repeated+exposure+of+organotypic+3D+bronchial+and+nasal+tissue+culture+models+to+whole+cigarette+smoke%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Impact assessment of repeated exposure of organotypic 3D bronchial and nasal tissue culture models to whole cigarette smoke.</a> J. Vis. Exp. , (2015).</li>
<li>Draper, A. J., Madan, A., Parkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+coumarin+7-hydroxylase+activity+in+human+liver+microsomes%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Inhibition of coumarin 7-hydroxylase activity in human liver microsomes.</a> Arch. Biochem. Biophys. 341, 47-61 (1997).</li>
<li>Jensen, K. G., Poulsen, H. E., Doehmer, J., Loft, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+inhibition+by+fluvoxamine+of+phenacetin+O-deethylation+in+V79+cells+expressing+human+CYP1A2%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Kinetics and inhibition by fluvoxamine of phenacetin O-deethylation in V79 cells expressing human CYP1A2.</a> Pharmacol. Toxicol. 76, 286-288 (1995).</li>
<li>Yamazaki, H., Tanaka, M., Shimada, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+high-performance+liquid+chromatographic+assay+for+coumarin+7-hydroxylation+and+7-ethoxycoumarin+O-deethylation+by+human+liver+cytochrome+P450+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B.+Biomed.+Sci.+Appl%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive high-performance liquid chromatographic assay for coumarin 7-hydroxylation and 7-ethoxycoumarin O-deethylation by human liver cytochrome P450 enzymes.</a> J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 721, 13-19 (1999).</li>
<li>Turpeinen, M., Raunio, H., Pelkonen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+role+of+CYP2B6+in+human+drug+metabolism%3A+substrates+and+inhibitors+in+vitro%2C+in+vivo+and+in+silico%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Drug+Metab%22%5BJournal%5D)">The functional role of CYP2B6 in human drug metabolism: substrates and inhibitors in vitro, in vivo and in silico.</a> Curr. Drug Metab. 7, 705-714 (2006).</li>
<li>Kartha, J. S., Yost, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism-based+inactivation+of+lung-selective+cytochrome+P450+CYP2F+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Dispos%22%5BJournal%5D)">Mechanism-based inactivation of lung-selective cytochrome P450 CYP2F enzymes.</a> Drug Metab. Dispos. 36, 155-162 (2008).</li>
<li>Sheets, P. L., Yost, G. S., Carlson, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzene+metabolism+in+human+lung+cell+lines+BEAS-2B+and+A549+and+cells+overexpressing+CYP2F1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Benzene metabolism in human lung cell lines BEAS-2B and A549 and cells overexpressing CYP2F1.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 92-99 (2004).</li>
<li>Kharasch, E. D., Thummel, K. E., Mhyre, J., Lillibridge, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-dose+disulfiram+inhibition+of+chlorzoxazone+metabolism%3A+a+clinical+probe+for+P450+2E1%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Single-dose disulfiram inhibition of chlorzoxazone metabolism: a clinical probe for P450 2E1.</a> Clin. Pharmacol. Ther. 53, 643-650 (1993).</li>
<li>Graef, V., Furuya, E., Nishikaze, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrolysis+of+steroid+glucuronides+with+beta-glucuronidase+preparations+from+bovine+liver%2C+Helix+pomatia%2C+and+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydrolysis of steroid glucuronides with beta-glucuronidase preparations from bovine liver, Helix pomatia, and E. coli.</a> Clin. Chem. 23, 532-535 (1977).</li>
<li>Guide to achieving reliable quantitative LC-MS measurements. RSC Analytical Methods Committee. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf">http://www.lgcgroup.com/LGCGroup/media/PDFs/Our%20science/NMI%20landing%20page/Publications%20and%20resources/Guides/AMC_LCMS_Guide.pdf</a> (2013).</li>
<li>Baxter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+omics+analyses%2C+and+metabolic+enzyme+activity+assays+demonstrate+maintenance+of+key+mucociliary+characteristics+in+long+term+cultures+of+reconstituted+human+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Targeted omics analyses, and metabolic enzyme activity assays demonstrate maintenance of key mucociliary characteristics in long term cultures of reconstituted human airway epithelia.</a> Toxicol. In Vitro. 29, 864-875 (2015).</li>
<li>Gomez-Lechon, M. J., Tolosa, L., Conde, I., Donato, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Competency+of+different+cell+models+to+predict+human+hepatotoxic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Expert.+Opin.+Drug+Metab.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Competency of different cell models to predict human hepatotoxic drugs.</a> Expert. Opin. Drug Metab. Toxicol. 10, 1553-1568 (2014).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+metabolism-dependent+drug+efficacy+and+toxicity+on+a+multilayer+organs-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Assessment of metabolism-dependent drug efficacy and toxicity on a multilayer organs-on-a-chip.</a> Integr. Biol. 8, Camb. 1022-1029 (2016).</li>
<li>Takahashi, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25947886">Three-dimensional (3D) spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells.</a> Biosci. Rep. , (2015).</li>
</ol>

AB y EM eran empleados de British American Tobacco en el momento en este manuscrito fue escrito. El trabajo descrito en este manuscrito fue financiada por la British American Tobacco, y las tasas de publicación de este video-artículo fueron pagados por British American Tobacco.

Actualmente, muchos sistemas de prueba toxicológicos normalizados utilizan bacterias modificadas, líneas celulares, o células embrionarias que no son representativos del metabolismo humano normal 1. Esto puede conducir a predicciones inexactas de la potencial actividad tóxica de un producto químico o la medicina. Innovative en modelos in vitro, tales como cultivos de células en 3D y de órganos en un chip, están siendo desarrollados en un intento de replicar mejor la morfología normal y la actividad metabólica de los tejidos humanos 21, 22, 23. competencia metabólica es un criterio que se puede utilizar para descifrar qué modelos son los más adecuados para los estudios de evaluación y de biotransformación de fármacos toxicológicos. El protocolo que hemos descrito en este documento está diseñado para medir la actividad de las enzimas CYP utilizando células vivas. Es flexible y se puede utilizar para diferentes sistemas de células en 2D o 3D culturES y ofrece la opción de utilizar un probe- luminogénico o un enfoque basado en la espectrometría de masas. Ambos métodos son lo suficientemente sensibles para detectar cantidades de nanogramos de materiales y sólo requiere un pequeño número de células cultivadas en un formato de múltiples pocillos. También se pueden aplicar a esferoide o células cultivadas en matrices complejas. La selección del sustrato sonda es, obviamente, un elemento crítico del protocolo. La especificidad del ensayo se basa en la sonda de ser selectivos de la enzima CYP y otra capa de aseguramiento puede ser obtenido por el uso de un inhibidor CYP selectiva. Los sustratos e inhibidores mencionados en este documento son sólo algunos ejemplos, pero otros se pueden encontrar en la literatura. Es importante tener en cuenta varios tiempos de incubación cuando se trabaja con un nuevo tipo de célula como resultado actividad de CYP negativo podría ser debido a la enzima que se expresa en un nivel bajo. La adición de un tipo de célula que se puede utilizar como un control positivo es aconsejable para garantizar que unaresultado negativo no está vinculado a un problema técnico y para ayudar con cualquier solución de problemas. células hepáticas primarias son metabólicamente competente y se pueden usar como control, para los hepatocitos primarios ejemplo en suspensión son muy fáciles de usar, pero su viabilidad es limitada en el tiempo. Líneas de células hepáticas son posibles alternativas que son relativamente fáciles de usar como se describe en este protocolo, pero algunos son mejores que otros en términos de actividad metabólica 6, 21. Dado que el ensayo es no destructivo, a menos que la proteína total se cuantifica, es posible seguir la actividad de CYP en el tiempo en los estudios longitudinales 20. Este es un punto importante porque algunas células tendrán una actividad CYP variable en el tiempo en cultivo. Un resultado negativo podría estar asociado con la falta de confluencia, el progreso con la diferenciación o desdiferenciación in vitro. En ese caso, el enfoque es semi-quantitative ya que los datos no se normaliza por la cantidad total de proteína en cada cultivo celular. No siempre es posible o recomendado para reutilizar el tejido después de la medición de la actividad de CYP como la exposición a sondas, inhibidores o inductores puede tener un efecto tóxico en el tejido como es el caso para la TCDD. fracciones de células tales como microsomas también podrían usarse para caracterizar la actividad de CYP de un tipo celular dado. De microsomas preparados, sin embargo, requieren una gran cantidad de material celular, la adición de cofactores adecuados y tampón para asegurar que las enzimas se mantienen activas. El uso de células vivas elimina la etapa de preparación de microsomas complicado y la elaboración de los cuales tampones y cofactores que mejor funcionan. Como recomendación general, es una buena práctica para caracterizar mejor el perfil de expresión de APP en cultivos de células para verificar que coincida con la actividad enzimática. Este nivel adicional de verificación se recomienda dado que las sondas metabólicas no se entidependen específicos de un solo CYP y le da una mayor confianza de que la actividad metabólica medida se corresponde con la expresión de la enzima correspondiente. Desde APP son proteínas de membrana que son relativamente difíciles de preparar para transferencias de Western, por lo tanto, RT-PCR cuantitativa ha sido el enfoque preferido para perfilar estas enzimas 20. Es importante señalar que este protocolo describe un método para la actividad enzimática CYP ensayo que sólo representa una familia de enzimas metabólicas, aunque importante. La flexibilidad de un enfoque de espectrometría de masas permite el desarrollo de métodos de adquisición de otras transformaciones metabólicas de los sustratos de investigación. Sin embargo, aquellos que se han desarrollado uno a la vez y actualmente hay un menor número de sondas específicas conocidas e inhibidores selectivos para otras familias de enzimas metabólicas. Esta brecha debe ser dirigida a permitir una evaluación completa de la capacidad metabólica de las células in vitro en systeSra.

Metabolismo de xenobióticos es el proceso a través del cual las sustancias químicas extrañas al organismo son modificados por la adición de grupos hidrófilos y conjugados para facilitar su excreción 1. Típicamente, el metabolismo de xenobióticos es un proceso de dos pasos con la Fase I consiste principalmente de una oxidación con la adición de uno o múltiples grupos hidroxilo 1, 2. En la Fase II, los grupos hidroxilo se utilizan como aceptores para un conjugado hidrófilo tal como glucurónido o un resto sulfato de 1, 2. Si un grupo aceptor ya está presente en las moléculas, la etapa de conjugación puede ocurrir independientemente del metabolismo de fase I. Cada reacción se lleva a cabo por un grupo específico de enzimas, por ejemplo, APP (citocromos P450), que catalizan la hidroxilación (Figura 1) y desalquilación de sustratos químicos 3. Conjugation es catalizada por sulfotransferasas, UDP-glucuronosiltransferasas (Figura 1), glutatión-S-transferasas y N-acetiltransferasas 4. Cada tejido y órgano tendrán un perfil específico expresión de la enzima metabólica, con el hígado que expresan la mayoría de esas proteínas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplo de Fase I y Fase II Metabolismo de cumarina. CYP2A6 / CYP2A13 catalizar la 7-hidroxilación de cumarina. 7-hidroxicumarina se conjuga con un resto glucurónido por enzimas de fase II UGTs, con UGT1A6 y UGT1A9 que muestra la actividad más alta. La comprensión del metabolismo de xenobióticos es fundamental en la evaluación de seguridad de los medicamentos y para la evaluación de riesgo químico por dos razones: la cinética de reacción se determinará cuánto tiempo un fármaco o producto químico permanecerán en el cuerpo en una forma activa o inactiva bexcreción ntes; y el compuesto de origen se puede modificar para una especie más reactiva, inestable y tóxico por las enzimas metabólicas. Tales reacciones también conocidos como &quot;bioactivación&quot; son impulsados en su mayoría por la fase I CYP enzimas, sino también en ocasiones más raras de fase II conjugación 5. Basado en esto, la capacidad de un modelo in vitro para predecir con precisión el riesgo asociado con un fármaco o una sustancia química depende de la competencia metabólica del sistema celular altamente. Las líneas celulares derivadas de tejidos enfermos o de transformación de células normales a menudo pierden parte si no la totalidad del perfil de enzima metabólica representante de su tejido de origen 6. El mantenimiento del perfil de la enzima metabólica normal aparece mejor en cultivos celulares primarios (al menos en cultivos de corto plazo) y se mejora aún más si el tejido se cultiva en una matriz que le permite conservar su estructura 3D 1. Por lo tanto, el carbón de leñaacterization de la competencia metabólica de un sistema de células in vitro es un paso preliminar importante en la orientación de la decisión sobre qué modelo de células es apropiado para llevar a cabo evaluaciones de seguridad química. En este documento se presenta un protocolo para el perfil de la actividad y expresión de enzimas de fase I CYP in vitro con ejemplos de su aplicación con una línea celular hepática 7 y cultivos celulares primarios de pulmón 3D 8. sustratos específicos de CYP, sus productos metabólicos y el inhibidor de controles se describen junto con spectrometry- de masas y métodos de cuantificación basados ​​en luminógeno. Dado que algunos APP son inducibles y otros son constitutivos, también se dan ejemplos para los dos escenarios.

<table><tbody><tr><td><fuerte>reactivo & Células</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 &mu; m filtro de jeringa</td><td>Whatman</td><td>UN203NPEORG</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>4-metilumbeliferona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1381</td><td></td></tr><tr><td>5-fenil pentyne</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CD5001437</td><td></td></tr><tr><td>6-hidroxibupropión</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3167</td><td></td></tr><tr><td>6-hidroxicloroxazona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>UC148</td><td></td></tr><tr><td>7-etoxicumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>195642</td><td></td></tr><tr><td>7-hidroxicumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H24003</td><td></td></tr><tr><td>8-metoxipsoraleno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3501</td><td></td></tr><tr><td>ácido acético</td><td>Sigma Aldrich 695092</td><td></td><td></td></tr><tr><td>acetonitrilo</td><td>Fisher</td><td>A/0626/17</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-naftoflavona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N5757</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>b-glucuronidasa/arilsulfatasa</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G0876</td><td></td></tr><tr><td>Bupropión</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B102</td><td></td></tr><tr><td>Carbamazepina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4024</td><td></td></tr><tr><td>clorzoxasona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4397</td><td></td></tr><tr><td>colágeno</td><td>Sistemas celulares</td><td>5005-B</td><td></td></tr><tr><td>cumarina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4261</td><td></td></tr><tr><td>disulfiram</td><td>Sigma Aldrich</td><td>86720</td><td></td></tr><tr><td>fluvoxamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2802</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax (Suplemento de glutamina)</td><td>Fisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG suplemento de metabolismo</td><td>Merck</td><td>MMAD621</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG descongelación suplemento de medios</td><td>Merck</td><td>MMADD671</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG</td><td>Merck</td><td>MMHPR116</td><td></td></tr><tr><td>Luciferin-CEE</td><td>Promega</td><td>V8751</td><td></td></tr><tr><td>metanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/17</td><td></td></tr><tr><td>Células de vía aérea MucilAir</td><td>Epithelix</td><td>EP01</td><td></td></tr><tr><td>Células de vía aérea MucilAir medios de mantenimiento</td><td>Epithelix</td><td>EP04MM</td><td></td></tr><tr><td>Phenomenex Kinetex 2.6 &mu; m, PFP 100A</td><td>Phenomenex</td><td>00B-4477-AN</td><td></td></tr><tr><td>TCDD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>48599</td><td></td></tr><tr><td>thioTEPA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6069</td><td></td></tr><tr><td>Waters Acquity UPLC HSS T3 1.8 &micro; m 2,1 x 50 mm</td><td>Waters</td><td>86003538</td><td></td></tr><tr><td>Williams' E media</td><td>Fisher</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLC</td><td>Acquity</td><td></td><td>Waters</td></tr><tr><td>QTRAP MS</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>ABI Sciex 4000</td><td></td></tr><tr><td>QTRAP MS software</td><td>Sciex&nbsp;</td><td>Luminómetro Analyst 1.4.2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>espectrofotómetro</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax M3</td><td></td></tr><tr><td>contador de células</td><td>Beckman Coulter</td><td>Vi-Cell XR</td><td></td></tr><tr><td>evaporador rotativo</td><td>Eppendorf</td><td>Eppendorf-5301</td><td></td></tr></tbody></table>

la espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase i metabólico de competencia<em&gt; in vitro</em&gt; cultivos celulares

Mass Spectrometry and Luminogenic-based Approaches to Characterize Phase I Metabolic Competency of In Vitro Cell Cultures

enzimas que metabolizan xenobióticos desempeñan una función clave en la biotransformación de los medicamentos y sustancias tóxicas mediante la adición de grupos funcionales que aumentan la solubilidad y facilitan la excreción. En algunas ocasiones, estas modificaciones estructurales conducen a la formación de nuevos productos tóxicos. A fin de reducir los ensayos con animales, riesgo químico puede evaluarse utilizando células metabólicamente competentes. La expresión de enzimas metabólicas, sin embargo, no es estable con el tiempo en muchos en sistemas de cultivo primario in vitro y es a menudo parcial o ausente en líneas celulares. Por lo tanto, el estudio de medicamentos, aditivos, y el metabolismo de los contaminantes ambientales en vitro idealmente debe llevarse a cabo en sistemas de células en donde la actividad metabólica se ha caracterizado. A continuación explicamos un método para medir la actividad de una clase de enzimas metabólicas (fase I en humanos) en líneas celulares en 2D y 3D culturas primarias usando sondas químicas y sus productos metabólicos cuantificables mediante espectrometría de masas y UPLCluminometrıa. El método puede ser implementado para probar la actividad metabólica en líneas celulares y células primarias derivadas de una variedad de tejidos.

Ejemplos de actividad metabólica medidos para dos pares de CYP (CYP1A1 / 1B1 y CYP2A6 / 2A13) en los cultivos de células de las vías respiratorias de tres donantes diferentes (las vías respiratorias M360, M370, M417) y la línea celular hepática (línea Hep) se muestran en la Figura 6 20. Actividad CYP medida por luminometría La Figura 6A muestra la luminiscencia relativa producida por la actividad de CYP1A1 / 1B1 O-desalquilación de Luc-CEE (luciferina 6&#39;-cloroetil éter) en las células de las vías respiratorias (3 donantes) y las células hepáticas con y sin inducción de TCDD. CYP1A1 / 1B1 son enzimas altamente inducible y normalmente no se expresa a un nivel constitutiva en la mayoría de tejidos. Como puede verse en la Figura 6A, no se detecta señal luminógeno cuando no se inducen las células. Cuando ambos tipos de células se pre-incubaron con TCDD, un fuerte CYP1A1 / 1B1 inductor, una marcase detecta la señal ed luminógeno comparación con el control (Figura 6A). Esto indica que la sonda Luc-CEE ha sido metabolizado conduce a la liberación de la fracción de la luciferina que se cuantifica posteriormente. En general, la actividad de la línea celular hepática TCDD tratada es inferior a la de las células de las vías respiratorias, incluso después de la normalización de proteína total. Esto no es inusual puesto que las líneas de células tienden a ser menos activa metabólicamente que las células primarias. La adición de α-naftoflavona tiene un claro efecto inhibidor sobre la actividad de CYP1A1 / 1B1 en todos los tipos celulares que confirma aún más la CYP-dependencia del metabolismo Luc-CEE. La cuantificación de los metabolitos del CYP450 usando UPLC-MS La Figura 6B ilustra la cuantificación de CYP2A6 actividad / 2A13 en las células de las vías respiratorias a partir de 3 donantes (Airway M343, M345, M347) y las células hepáticas (línea Hep) después de la incubación con cumarina en presencia y ausencia del INHIbitor 8-metoxipsoraleno. Los datos se normalizaron para la proteína total. En el control de cumarina de incubación 0 min, no 7-hidroxicumarina se detecta (Figura 6B). CYP2A6 / 2A13 se expresan constitutivamente en ciertos tejidos y, por tanto, después de 16 h de incubación con la formación de cumarina de 7-hidroxicumarina se detecta en los diferentes tipos de células ensayadas, incluso sin inducción. Cuando 8-metoxipsoraleno, se añade un inhibidor CYP2A (Figura 6B), la formación de 7-hidroxicumarina se reduce considerablemente. Cabe señalar que, en presencia del inhibidor de CYP, es normal que todavía detectar alguna actividad residual como la inhibición rara vez es completa y ya que otros APP también puede ser capaz de reconocer el sustrato pero procesarlo mucho menos eficiente. También se puede observar que la actividad metabólica grabado puede ser diferente entre los donantes utilizando las células primarias, ya que es visible para el CYP2A6 en células de las vías respiratorias(Figura 6B). Se espera que la actividad del CYP es susceptible de genotipo y polimorfismos de cada donante. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55502/55502fig6.jpg" /> Figura 6: Ensayo de actividad de Resultado para CYP1A1 / 1B1 Actividad (A) y CYP2A6 / 2A13 actividad (B) en la línea celular hepática y en tres Airway Cell donantes (M360, M370, M417). (A) Luc-CEE actividad desalquilación se muestra con y sin inducción de CYP1A1 / 1B1 por TCDD. α-naftoflavona fue utilizado como inhibidor de CYP1A1 / 1B1. La actividad se expresa como unidades relativas de luminiscencia (RLU) normalizados por el tiempo de incubación en minutos (min) y proteína total (mg). (B) CYP2A6 / 2A13 no requieren inducción, ya que se expresan de forma constitutiva. La cumarina actividad 7-hidroxilación en las proteínas pmol / min / mg se muestra en diferentes puntos de tiempo con y sin el inhibidor de 8-methoxypsoralen. Todos los resultados se presentan como un valor medio de tres mediciones independientes con desviaciones estándar de la media. Esta cifra se modificó a partir Baxter 20. Suplementario Tabla 1: UPLC y ajustes del espectrómetro de masas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55502/Supplemental_Table_1.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Competencia metabólica de los sistemas in vitro es un requisito clave para la biotransformación y la disposición de fármacos y sustancias tóxicas. En este protocolo, se describe la aplicación de sondas metabólicos de referencia para evaluar la fase I metabolismo en cultivos celulares.

La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia<em&gt; In Vitro</em&gt; Cultivos Celulares

Xenobiotic metabolizing enzymes play a key function in the biotransformation of medicines and toxicants by adding functional groups that increase ...

El objetivo de este procedimiento es determinar la actividad de las citocromo P450, o CYPs, en células cultivadas. Las CYPs son enzimas clave implicadas en el metabolismo de medicamentos y tóxicos, y su expresión a menudo no se mantiene in vitro. La expresión normal de las enzimas CYP frecuentemente se pierde cuando las células se cultivan in vitro.Por lo tanto, muchos modelos in vitro tienen una relevancia potencialmente limitada para comprender el metabolismo de medicamentos y tóxicos. La principal ventaja de este método es su simplicidad al evaluar la actividad de CYP en células cultivadas. Mediante el uso de sustratos indicadores e inhibidores, se presentan diferentes plataformas de cuantificación, incluida la espectrometría de masas.Para comenzar, obtenga los viales criogénicos con células según se describe en el protocolo escrito. El protocolo proporcionado utiliza una línea celular hepática como ejemplo. Mientras trabaja en condiciones estériles, abra cuidadosamente el vial criogénico para liberar cualquier presión excesiva, luego pipetee el contenido del vial criogénico en un tubo de 10 mililitros que contenga nueve mililitros de medio Williams'E precalentado a 37 grados Celsius.Centrifugar la solución durante 10 minutos a 400 veces g a temperatura ambiente. Después de descartar el sobrenadante, volver a suspender las células en cinco mililitros de medio de descongelación comercial, previamente calentado a 37 grados Celsius y suplementado con glutamina. Después de contar las células viables según se describe en el protocolo escrito, sembrar las células en una placa de 24 pocillos recubierta con colágeno a una densidad de 60.000 células viables por pocillo y un volumen final de 0,5 mililitros de medio de descongelación.Después de unos días en cultivo, las células forman una estructura trabecular subconfluente. La actividad metabólica óptima se observa generalmente entre los días siete y diez, y es más baja en el día cuatro. Para preparar los cultivos de epitelio respiratorio diferenciado, utilice epitelio respiratorio primario completamente diferenciado disponible comercialmente, que haya sido cultivado en la interfase aire-líquido sobre un inserto.Utilizando pinzas estériles, despegue suavemente el inserto celular de la matriz de agarosa y transfiéralo a la nueva placa previamente cargada con 700 microlitros de medio de cultivo especial. Evalúe la integridad del tejido de la vía aérea mediante métodos mencionados en el protocolo del texto, como la resistencia transepitelial o la frecuencia de batido de los cilios. Antes del experimento, prepare dos series de insertos celulares para las células de la vía aérea y pozos para las células hepáticas, con un mínimo de tres réplicas.Utilice una serie para el experimento de inhibición y la otra para la sonda metabólica únicamente. Prepare una tercera serie de células como control en blanco de medio. El día del experimento, reemplace el medio de cultivo celular con 450 microlitros de medio fresco.Añada 50 microlitros de medio que contenga el inhibidor de CYP 10x a la serie de células preparadas para el experimento de inhibición y precultive durante 30 minutos. A continuación, reemplace el medio en la serie de inhibición con 450 microlitros de medio fresco y añada 50 microlitros de medio que contenga tanto el inhibidor de CYP 10x como el sustrato sonda 10x. Añada 50 microlitros de medio con el sustrato sonda 10x a las otras células, luego añada una cantidad equivalente de vehículo diluido en medio a los controles celulares en blanco.Después de incubar las células durante cero a cinco minutos para el punto de tiempo uno, control cero de fondo, recolecte el medio en tubos etiquetados separados y congele el medio para su posterior procesamiento. Luego, incube las células del punto de tiempo dos durante 16 horas en el incubador celular. Al final del período de incubación, recolecte el medio utilizando el mismo método para la cuantificación del producto metabólico.Transfiera 250 microlitros de medio de incubación a un microtubo de 1,5 mililitros y agregue la solución stock del estándar interno 4-metilumbeliferona para alcanzar una concentración final de 100 nanomoles. Ajuste el pH del medio entre 4,5 y 5,0 añadiendo HCl uno molar, un microlitro a la vez. Verifique el pH pipeteando de dos a 10 microlitros de medio sobre una tira de pH, luego agregue 150 unidades de beta-glucuronidasa arilsulfatasa de Helix pomatia.Después de incubar durante una hora a 37 grados Celsius, detenga la reacción añadiendo 250 microlitros de metanol frío. Evapore el disolvente utilizando un centrifugador al vacío a 45 grados Celsius. Reconstituya las muestras con 500 microlitros de una solución de acetonitrilo al 30% en agua.Para realizar la cuantificación basada en espectrometría de masas, agregue 250 microlitros de cada estándar de dilución seriada a un vial de vidrio ámbar para cromatografía líquida de ultra alto rendimiento para su inyección en el muestreador automático de UPLC-MS. También agregue las muestras de prueba a viales ámbar de UPLC y colóquelas en el muestreador automático de UPLC. Después de aleatorizar todos los viales, ejecute el UPLC-MS utilizando los ajustes detallados en el protocolo del texto, según la sonda específica que se vaya a cuantificar.Utilice la herramienta Cuantificar, Crear método de cuantificación en las herramientas de cuantificación del espectrómetro de masas para generar la curva de calibración a partir del estándar sintético y el estándar interno adquiridos, luego utilice el Asistente de cuantificación para seleccionar el lote de muestras y las muestras a cuantificar y ejecutar el método de cuantificación. Para inducir CYP1A1, CYP1B1, use la distribución de la placa que se encuentra en el protocolo escrito. Incube las células designadas para la inducción con una concentración final de 10 nanomolar de TCDD en medio durante un período de 72 horas.Después de este período, retire el medio, lave los pocillos con PBS tres veces y agregue medio fresco. Antes de incubar las células con la sonda luminogénica, preincube el subconjunto designado de células inducidas durante 30 minutos con el inhibidor de CYP1A1, CYP1B1 en medio. Agregue la sonda luminogénica, éter 6'cloroetílico de luciferina, a una concentración final de 50 micromolar a las células no inducidas, inducidas y a las inducidas con inhibidor.Incubar durante cuatro horas y luego transferir 25 microlitros de medio de cultivo a una placa opaca blanca de 96 pocillos, y agregar 25 microlitros del reactivo de detección de luciferina proporcionado por el fabricante. Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, leer la placa inmediatamente utilizando un luminómetro. Aquí se presentan la luminiscencia relativa producida por la dealquilación del éter 6'cloroetílico de luciferina, que es catalizada por CYP1A1, CYP1B1.El ejemplo muestra ausencia de actividad enzimática en ausencia de inducción con TCDD. Tras la inducción con TCDD, se observa la actividad de CYP1A1 y CYP1B1 en ambos tipos celulares, hepático y respiratorio. Finalmente, la adición del inhibidor de CYP1A1 y CYP1B1, alfa-naftoflavona, reduce o elimina la actividad de CYP.Para evaluar la actividad de CYP2A6 y 2A13 en tipos celulares hepáticos y de las vías respiratorias, se midió la cantidad de 7-hidroxycumarina producida mediante la hidroxilación de cumarina por la enzima, utilizando UPLC LC-MS. En el tiempo cero de incubación con cumarina, solo se detecta la señal de fondo. Después de 16 horas, se observa la hidroxilación de la cumarina con la formación de 7-hidroxycumarina en los dos tipos celulares.Por último, la adición del inhibidor de CYP2A, 2A13 impide la formación de 7-hidroxicumarina. Una vez dominadas, las partes de incubación con la sonda y cuantificación de esta técnica pueden realizarse en unas pocas horas hasta un día en la mayoría de los casos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar diversos ensayos de metabolismo de fase uno utilizando diferentes tipos celulares, y de cómo confirmar la especificidad de la enzima mediante inhibición y/o inducción según sea necesario.Al intentar este procedimiento, es importante recordar que diferentes tipos de células podrían requerir tiempos de incubación más largos, y es esencial incluir un tipo de célula que pueda utilizarse como control positivo. No olvide que trabajar con TCDD puede ser extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones, como el uso completo de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el uso de modelos in vitro adecuados para la evaluación preclínica de nuevos medicamentos y la evaluación de riesgos de productos químicos e ingredientes utilizados en productos de consumo.

mass-spectrometry-luminogenic-based-approaches-to-characterize-phase

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Untargeted metabolómica ofrece una hipótesis de generación instantánea de un perfil metabólico. Este protocolo se demostrará la extracción y el análisis de los metabolitos de las células, suero, o tejidos. Una gama de metabolitos se examinó utilizando extracción en fase líquido-líquido, microflujo UltraPerformance cromatografía líquida / de alta resolución de la espectrometría de masas (UPLC-HRMS) acoplado al software de análisis diferencial.

Metabolómica no focalizados de fuentes biológicas Uso UltraPerformance cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución (UPLC-HRMS)

Describimos los pasos que permiten muestreo rápido in situ de una pequeña porción de una célula individual de alta precisión y mínima invasión, mediante micro-muestras basadas en el tubo capilar, para facilitar la caracterización química de una instantánea de la actividad metabólica en embriones vivos utilizando una plataforma de espectrometría de masas y electroforesis capilar célula hecha a la medida.

Microsondeo electrónico capilar electroforesis de espectrometría de masas para unicelular metabolómica en embriones de Rana viva (Xenopus laevis)

Presentamos un protocolo para la medición de consumo de oxígeno y la acidificación extracelular en el cerebro de larvas y adultos de Drosophila melanogaster . Se utiliza un analizador metabólico con un protocolo adaptado y optimizado. Micro-tejido restricciones son un componente fundamental de este protocolo y fueron diseñadas y creadas específicamente para su uso en este análisis.

Análisis metabólico del cerebro adulto y Larval de Drosophila melanogaster

Una plataforma de manipulación de células integrada se desarrolla para su uso en conjunto con una configuración de espectrometría de masas de una sola sonda para el análisis en línea de células de suspensión individuales en condiciones ambientales.

Plataforma de manipulación celular integrada junto con la sonda única para el análisis de espectrometría de masas de fármacos y metabolitos en células de suspensión única

Aquí, presentamos un protocolo robusto para cuantificar 40 compuestos involucrados en el metabolismo central de carbono y energía en reacciones de síntesis de proteínas libres de células. La mezcla de síntesis sin células se deriva con anilina para una separación efectiva utilizando cromatografía líquida de fase inversa y luego se cuantifica mediante espectrometría de masas utilizando estándares internos etiquetados isotópicamente.

Cuantificación absoluta del metabolismo de síntesis de proteínas sin células por cromatografía líquida de fase inversa-espectrometría de masas

Los protocolos describen métodos de cromatografía líquida de alto rendimiento acoplados al índice de refracción o a la detección espectrométrica de masas para estudiar reacciones metabólicas en sistemas complejos libres de células basados en lisato.

Cromatografía líquida acoplada a la detección de índice de refracción o espectrometría de masas para perfiles de metabolitos en sistemas libres de células basados en lisato

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Aquí, presentamos un protocolo para medir de manera precisa y confiable los metabolitos en tipos de células raras. Las mejoras técnicas, incluido un fluido de vaina modificado para la clasificación de células y la generación de muestras en blanco relevantes, permiten una cuantificación completa de metabolitos con una entrada de solo 5000 células por muestra.

Metabolómica dirigida en células primarias raras

Este protocolo tiene como objetivo preservar los metabolitos celulares para la espectrometría de masas unicelular (SCMS) mediante la combinación de lavado con solución salina volátil, enfriamiento rápido de nitrógeno líquido, liofilización y almacenamiento a -8 °C. Demuestra que el enfriamiento con nitrógeno líquido es esencial para mantener los perfiles de metabolitos, mientras que el almacenamiento prolongado en frío debe minimizarse para evitar alteraciones metabólicas.

Preparación de muestras para espectrometría de masas unicelular Estudios metabolómicos: lavado, enfriamiento, secado y almacenamiento combinados de células

Se presenta un protocolo para perfiles metabólicos de muestras biológicas mediante electroforesis capilar de espectrometría de masas utilizando un diseño de interfaz de punta porosa sheathless.

Sheathless electroforesis capilar-espectrometría de masas de perfiles metabólicos de muestras biológicas

Aprende a evaluar la actividad de citocromo P450 en cultivos celulares mediante espectrometría de masas y sondas luminogénicas. Este método mejora la relevancia de los modelos in vitro para estudios de metabolismo de fármacos.

La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia In Vitro Cultivos Celulares (Video) | JoVE Journal

La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia

Explorar más videos

La espectrometría de masa y enfoques basados en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia