La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia

El objetivo de este procedimiento es determinar la actividad de las citocromo P450, o CYPs, en células cultivadas. Las CYPs son enzimas clave implicadas en el metabolismo de medicamentos y tóxicos, y su expresión a menudo no se mantiene in vitro. La expresión normal de las enzimas CYP frecuentemente se pierde cuando las células se cultivan in vitro.

Por lo tanto, muchos modelos in vitro tienen una relevancia potencialmente limitada para comprender el metabolismo de medicamentos y tóxicos. La principal ventaja de este método es su simplicidad al evaluar la actividad de CYP en células cultivadas. Mediante el uso de sustratos indicadores e inhibidores, se presentan diferentes plataformas de cuantificación, incluida la espectrometría de masas.

Para comenzar, obtenga los viales criogénicos con células según se describe en el protocolo escrito. El protocolo proporcionado utiliza una línea celular hepática como ejemplo. Mientras trabaja en condiciones estériles, abra cuidadosamente el vial criogénico para liberar cualquier presión excesiva, luego pipetee el contenido del vial criogénico en un tubo de 10 mililitros que contenga nueve mililitros de medio Williams'E precalentado a 37 grados Celsius.

Centrifugar la solución durante 10 minutos a 400 veces g a temperatura ambiente. Después de descartar el sobrenadante, volver a suspender las células en cinco mililitros de medio de descongelación comercial, previamente calentado a 37 grados Celsius y suplementado con glutamina. Después de contar las células viables según se describe en el protocolo escrito, sembrar las células en una placa de 24 pocillos recubierta con colágeno a una densidad de 60.000 células viables por pocillo y un volumen final de 0,5 mililitros de medio de descongelación.

Después de unos días en cultivo, las células forman una estructura trabecular subconfluente. La actividad metabólica óptima se observa generalmente entre los días siete y diez, y es más baja en el día cuatro. Para preparar los cultivos de epitelio respiratorio diferenciado, utilice epitelio respiratorio primario completamente diferenciado disponible comercialmente, que haya sido cultivado en la interfase aire-líquido sobre un inserto.

Utilizando pinzas estériles, despegue suavemente el inserto celular de la matriz de agarosa y transfiéralo a la nueva placa previamente cargada con 700 microlitros de medio de cultivo especial. Evalúe la integridad del tejido de la vía aérea mediante métodos mencionados en el protocolo del texto, como la resistencia transepitelial o la frecuencia de batido de los cilios. Antes del experimento, prepare dos series de insertos celulares para las células de la vía aérea y pozos para las células hepáticas, con un mínimo de tres réplicas.

Utilice una serie para el experimento de inhibición y la otra para la sonda metabólica únicamente. Prepare una tercera serie de células como control en blanco de medio. El día del experimento, reemplace el medio de cultivo celular con 450 microlitros de medio fresco.

Añada 50 microlitros de medio que contenga el inhibidor de CYP 10x a la serie de células preparadas para el experimento de inhibición y precultive durante 30 minutos. A continuación, reemplace el medio en la serie de inhibición con 450 microlitros de medio fresco y añada 50 microlitros de medio que contenga tanto el inhibidor de CYP 10x como el sustrato sonda 10x. Añada 50 microlitros de medio con el sustrato sonda 10x a las otras células, luego añada una cantidad equivalente de vehículo diluido en medio a los controles celulares en blanco.

Después de incubar las células durante cero a cinco minutos para el punto de tiempo uno, control cero de fondo, recolecte el medio en tubos etiquetados separados y congele el medio para su posterior procesamiento. Luego, incube las células del punto de tiempo dos durante 16 horas en el incubador celular. Al final del período de incubación, recolecte el medio utilizando el mismo método para la cuantificación del producto metabólico.

Transfiera 250 microlitros de medio de incubación a un microtubo de 1,5 mililitros y agregue la solución stock del estándar interno 4-metilumbeliferona para alcanzar una concentración final de 100 nanomoles. Ajuste el pH del medio entre 4,5 y 5,0 añadiendo HCl uno molar, un microlitro a la vez. Verifique el pH pipeteando de dos a 10 microlitros de medio sobre una tira de pH, luego agregue 150 unidades de beta-glucuronidasa arilsulfatasa de Helix pomatia.

Después de incubar durante una hora a 37 grados Celsius, detenga la reacción añadiendo 250 microlitros de metanol frío. Evapore el disolvente utilizando un centrifugador al vacío a 45 grados Celsius. Reconstituya las muestras con 500 microlitros de una solución de acetonitrilo al 30% en agua.

Para realizar la cuantificación basada en espectrometría de masas, agregue 250 microlitros de cada estándar de dilución seriada a un vial de vidrio ámbar para cromatografía líquida de ultra alto rendimiento para su inyección en el muestreador automático de UPLC-MS. También agregue las muestras de prueba a viales ámbar de UPLC y colóquelas en el muestreador automático de UPLC. Después de aleatorizar todos los viales, ejecute el UPLC-MS utilizando los ajustes detallados en el protocolo del texto, según la sonda específica que se vaya a cuantificar.

Utilice la herramienta Cuantificar, Crear método de cuantificación en las herramientas de cuantificación del espectrómetro de masas para generar la curva de calibración a partir del estándar sintético y el estándar interno adquiridos, luego utilice el Asistente de cuantificación para seleccionar el lote de muestras y las muestras a cuantificar y ejecutar el método de cuantificación. Para inducir CYP1A1, CYP1B1, use la distribución de la placa que se encuentra en el protocolo escrito. Incube las células designadas para la inducción con una concentración final de 10 nanomolar de TCDD en medio durante un período de 72 horas.

Después de este período, retire el medio, lave los pocillos con PBS tres veces y agregue medio fresco. Antes de incubar las células con la sonda luminogénica, preincube el subconjunto designado de células inducidas durante 30 minutos con el inhibidor de CYP1A1, CYP1B1 en medio. Agregue la sonda luminogénica, éter 6'cloroetílico de luciferina, a una concentración final de 50 micromolar a las células no inducidas, inducidas y a las inducidas con inhibidor.

Incubar durante cuatro horas y luego transferir 25 microlitros de medio de cultivo a una placa opaca blanca de 96 pocillos, y agregar 25 microlitros del reactivo de detección de luciferina proporcionado por el fabricante. Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, leer la placa inmediatamente utilizando un luminómetro. Aquí se presentan la luminiscencia relativa producida por la dealquilación del éter 6'cloroetílico de luciferina, que es catalizada por CYP1A1, CYP1B1.

El ejemplo muestra ausencia de actividad enzimática en ausencia de inducción con TCDD. Tras la inducción con TCDD, se observa la actividad de CYP1A1 y CYP1B1 en ambos tipos celulares, hepático y respiratorio. Finalmente, la adición del inhibidor de CYP1A1 y CYP1B1, alfa-naftoflavona, reduce o elimina la actividad de CYP.

Para evaluar la actividad de CYP2A6 y 2A13 en tipos celulares hepáticos y de las vías respiratorias, se midió la cantidad de 7-hidroxycumarina producida mediante la hidroxilación de cumarina por la enzima, utilizando UPLC LC-MS. En el tiempo cero de incubación con cumarina, solo se detecta la señal de fondo. Después de 16 horas, se observa la hidroxilación de la cumarina con la formación de 7-hidroxycumarina en los dos tipos celulares.

Por último, la adición del inhibidor de CYP2A, 2A13 impide la formación de 7-hidroxicumarina. Una vez dominadas, las partes de incubación con la sonda y cuantificación de esta técnica pueden realizarse en unas pocas horas hasta un día en la mayoría de los casos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar diversos ensayos de metabolismo de fase uno utilizando diferentes tipos celulares, y de cómo confirmar la especificidad de la enzima mediante inhibición y/o inducción según sea necesario.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que diferentes tipos de células podrían requerir tiempos de incubación más largos, y es esencial incluir un tipo de célula que pueda utilizarse como control positivo. No olvide que trabajar con TCDD puede ser extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones, como el uso completo de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el uso de modelos in vitro adecuados para la evaluación preclínica de nuevos medicamentos y la evaluación de riesgos de productos químicos e ingredientes utilizados en productos de consumo.