La espectrometría de masa y enfoques basados ​​en luminogénico para caracterizar la fase I metabólico de Competencia In Vitro Cultivos Celulares

El objetivo de este procedimiento es determinar la actividad del citocromo P450s, o CYPs, en células cultivadas. Los CYP son enzimas clave implicadas en el metabolismo de medicamentos y tóxicos, y su expresión no suele retenerse in vitro. La expresión normal de las enzimas CYP a menudo se pierde cuando las células se cultivan in vitro.

Por lo tanto, muchos modelos in vitro son potencialmente limitantes de relevancia para comprender el metabolismo de los medicamentos y los tóxicos. La principal ventaja de este método es su simplicidad a la hora de evaluar la actividad del CYP en células cultivadas. Utilizando sustratos de sonda e inhibidores, se presentan diferentes plataformas de cuantificación, incluyendo espectrometría de masas.

Para comenzar, obtenga viales criogénicos con células como se describe en el protocolo de texto. El protocolo proporcionado utiliza una línea celular hepática como ejemplo. Mientras trabaja en condiciones estériles, abra con cuidado el vial criogénico para liberar cualquier exceso de presión, luego pipetee el contenido del vial criogénico en un tubo de 10 mililitros lleno de nueve mililitros de medio Williams'E precalentado a 37 grados Celsius.

Centrifugar la solución durante 10 minutos a 400 veces g a temperatura ambiente. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en cinco mililitros de medio de descongelación patentado, precalentado a 37 grados Celsius y suplementado con glutamina. Después de contar las células viables como se describe en el protocolo de texto, siembre las células en una placa recubierta de colágeno de 24 pocillos a una densidad de 60.000 células viables por pocillo y un volumen final de 0,5 mililitros de medio de descongelación.

Después de unos días en cultivo, las células forman una estructura trabecular subconfluente. La actividad metabólica óptima se observa típicamente entre los días siete y 10, y es más baja en el día cuatro. Para preparar los cultivos de epitelio diferenciado de las vías respiratorias, utilice epitelio primario de las vías respiratorias totalmente diferenciado disponible en el mercado que se haya cultivado en la interfaz aire-líquido en un inserto.

Con pinzas estériles, desaloje suavemente el inserto celular de la matriz de agarosa y transfiéralo a la nueva placa precargada con 700 microlitros de medio de cultivo patentado. Evaluar la integridad del tejido de las vías respiratorias utilizando métodos a los que se hace referencia en el protocolo de texto, como la resistencia transepitelial o la frecuencia de latidos de los cilios. Antes del experimento, prepare dos series de insertos celulares para las células de las vías respiratorias y pocillos para las células hepáticas con un mínimo de tres réplicas.

Utilice una serie para el experimento de inhibición y la otra solo para la sonda metabólica. Prepare una tercera serie de celdas como un control de papel en blanco. El día del experimento, reemplace el medio de cultivo celular con 450 microlitros de medio fresco.

Añadir 50 microlitros de medio que contenga el inhibidor de CYP 10x a la serie de células preparadas para el experimento de inhibición y preincubar durante 30 minutos. A continuación, reemplace el medio en la serie de inhibición con 450 microlitros de medio fresco y agregue 50 microlitros de medio que contenga tanto el inhibidor de CYP 10x como el sustrato de la sonda 10x. Agregue 50 microlitros de medio con el sustrato de sonda 10x a las otras celdas, luego agregue una cantidad equivalente de vehículo diluido en medio a los controles de celdas en blanco.

Después de incubar las células durante cero a cinco minutos para el punto de tiempo uno, control de fondo cero, recoja el medio en tubos etiquetados separados y congele el medio para el procesamiento futuro. A continuación, incube el punto de tiempo de dos células durante 16 horas en la incubadora de células. Al final del período de incubación, recoja el medio utilizando el mismo método para la cuantificación del producto metabólico.

Transfiera 250 microlitros de medio de incubación a un microtubo de 1,5 mililitros y agregue una solución madre estándar interna de 4-metilumbeliferona para alcanzar una concentración final de 100 nanomolares. Ajuste el pH del medio a entre 4.5 y 5.0 agregando un molar de HCl, un microlitro a la vez. Verifique el pH pipeteando de dos a 10 microlitros de medio en una tira de pH, luego agregue 150 unidades de betaglucuronidasa arilsulfatasa de Helix pamatia.

Después de incubar durante una hora a 37 grados centígrados, detenga la reacción agregando 250 microlitros de metanol frío. Evapore el disolvente utilizando una centrífuga de vacío a 45 grados centígrados. Reconstituya las muestras con 500 microlitros de una solución de acetonitrilo a agua al 30%.

Para realizar la cuantificación basada en espectrometría de masas, agregue 250 microlitros de cada patrón de dilución en serie a un vial de vidrio de cromatografía líquida de ultra rendimiento ámbar para inyección en el muestreador automático UPLC-MS. También agregue las muestras de prueba a los viales de color ámbar UPLC y colóquelos en el muestreador automático de UPLC. Después de aleatorizar todos los viales, ejecute el UPLC-MS utilizando la configuración detallada en el protocolo de texto en función de la sonda específica a cuantificar.

Utilice la herramienta Cuantificar, crear método de cuantificación de las herramientas de cuantificación del espectrómetro de masas para generar la curva de calibración a partir del estándar sintético y el estándar interno adquiridos y, a continuación, utilice el Asistente de cuantificación para seleccionar el lote de muestras y las muestras que se van a cuantificar y ejecutar el método de cuantificación. Para inducir CYP1A1, CYP1B1, use el diseño de placa que se encuentra en el protocolo de texto. Incubar las células designadas para la inducción con una concentración final de TCDD de 10 nanomolares en medio durante un período de 72 horas.

Después de este período, retire el medio, enjuague los pocillos con PBS tres veces y agregue un poco de medio fresco. Antes de incubar las células con la sonda reportera luminogénica, preincube el subconjunto designado de células inducidas durante 30 minutos con el inhibidor de CYP1A1, CYP1B1 en medio. Agregue el propbe luminogénico, luciferina 6'cloroetilo éter a una concentración final de 50 micromolares a las células inhibidoras no inducidas, inducidas e inducidas plus.

Incubar durante cuatro horas y luego transferir 25 microlitros de medio de cultivo a una placa blanca opaca de 96 pocillos y agregar 25 microlitros de reactivo de detección de luciferina suministrado por el fabricante. Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, lea la placa inmediatamente con un luminómetro. Aquí se presenta la luminiscencia relativa producida por la desalquilación del éter de luciferina 6'cloroetilo, que es catalizado por CYP1A1, CYP1B1.

El ejemplo muestra que no hay actividad enzimática en ausencia de inducción de TCDD. Después de la inducción de TCDD, se observa actividad de CYP1A1, CYP1B1 tanto en el tipo de células hepáticas como en las respiratorias. Por último, la adición del inhibidor del CYP1A1, CYP1B1, alfa-naftoflavona, reduce o elimina la actividad del CYP.

Para evaluar la actividad de CYP2A6, 2A13 en los tipos de células hepáticas y de las vías respiratorias, se midió la cantidad de 7-hidroxicumarina producida a través de la hidroxilación de la cumarina por la enzima utilizando UPLC LC-MS. A los cero minutos de incubación con cumarina, solo se detecta el fondo. Después de 16 horas, se observa la hidroxilación de la cumarina con la formación de 7-hidroxicumarina en los dos tipos de células.

Por último, la adición del inhibidor del CYP2A, 2A13 previene la formación de 7-hidroxicumarina. Una vez dominadas, las partes de incubación y cuantificación de la sonda de esta técnica se pueden realizar en unas pocas horas hasta un día en la mayoría de los casos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar varios ensayos de metabolismo de fase uno utilizando diferentes tipos de células, confirmando la especificidad de la enzima mediante inhibición y/o inducción según sea necesario.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los diferentes tipos de células pueden requerir tiempos de incubación más largos, y es esencial incluir un tipo de célula que se pueda utilizar como control positivo. No olvide que trabajar con TCDD puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como equipo de protección personal completo, mientras se realiza este procedimiento. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el uso de modelos in vitro adecuados para la evaluación preclínica de nuevos medicamentos y las evaluaciones de riesgos de productos químicos e ingredientes utilizados en productos de consumo.