Name: Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprenda a medir la actividad enzimática de proteínas quinasas utilizando ATP radiomarcado en ensayos cuantitativos. Este protocolo versátil permite evaluar especificidad y respuesta a tratamientos en biología celular.

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Los autores agradecen a todos los miembros actuales y antiguos del laboratorio de Cobb por trabajos valiosos y discusiones, y Dionne Ware por asistencia administrativa. Estos estudios fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud Grant R37 DK34128 y Welch Foundation Grant I1243 a MHC

1. Recursos de purificación de quinasa y tubería general de inmunoprecipitación NOTA: Las quinasas para uso con este ensayo pueden obtenerse a partir de inmunoprecipitados de células cultivadas o por medios recombinantes tales como la purificación marcada por afinidad 6 . A continuación se muestra un protocolo general para la inmunoprecipitación marcada con bandera que puede tener que ser modificada dependiendo de la quinasa de interés. Todo debe mantenerse en hielo cuando sea posible. <ol><li> Añadir 2 μl de anticuerpo de 1 mg / ml a 200 μl de lisados ​​celulares (generalmente ~ 1 mg / ml de concentración de proteína total) e incubar a 4 ° C durante 1 h mientras se balancea. </li><li> Lavar las perlas de proteína Sepharose 2-3 veces con tampón de lisis (ver más abajo) girando brevemente a 4 ° C durante 30 s a 1 min a 5.000 xg (&quot;spin&quot;), retirando el sobrenadante con una pipeta y resuspendiendo las perlas en tampón . <ol><li> Preparar tampón de lisis: HEPES 50 mM pH 7,7, NaCl 150 mM, MgCl2 1,5 mM, EGTA 1 mM, glicerol al 10%, ortovanadato sódico 0,2 mM, fluoruro de sodio 100 mM, β-glicerofosfato 50 mM, Triton X 100 al 0,1% o NP-40 al 0,1%. </li></ol></li><li> Añadir 30 μL de suspensión al 50% de perlas de sepharosa de proteína A en tampón de lisis a lisados; Incubar a 4 ° C durante 1 h mientras se mecían. </li><li> Toque el centrifugado a 4 ° C para sedimentar las perlas y eliminar el sobrenadante. </li><li> Lavar 3 veces con 1 mL de tampón de lavado de perlas (NaCl 1 M, Tris 20 mM pH 7,4). </li><li> Lavar una vez con tampón de reacción 1x quinasa (HEPES 10 mM pH 8,0, MgCl2 10 mM). Retire la mayor cantidad posible de tampón sin retirar las perlas. </li></ol> 2. Inicialización de las reacciones quinasas NOTA: Para los ensayos de quinasa IP, ~ 15 μl de perlas no suspendidas es una muestra inicial típica. Para los ensayos de proteína quinasa recombinante, las cantidades iniciales típicas oscilan entre 0,1 - 1,0 μg en 1-10 para 25-50 μL de volúmenes de reacción finales. Ajustar los volúmenes de la muestra de proteína recombinanteS sean iguales con el tampón en el que se almacenan antes de inicializar el ensayo. Cuando se usan altas cantidades de quinasa, incluyen una proteína portadora tal como BSA para ayudar a mantener la estabilidad de la proteína durante la duración del ensayo. <ol><li> Preparar el tampón de reacción 5x quinasa dado a continuación: HEPES 50 mM pH 8,0 MgCl $ ₂ $ 50 mM Benzamidina 50 mM (inhibidor de proteasa) 50 mM DTT (agente de reducción) 250 mu M ATP (sin marcar, o &quot;frío&quot;) </li><li> Mantener las muestras de quinasa en hielo en tubos de 1,5 mL. Preparar la siguiente mezcla de reacción en tubos separados de 1,5 mL refrigerados: 21 mu l de H _ { 2 } O 6 mu l de tampón de reacción 5x quinasa 1 mu l de ATP radiomarcado (&quot;caliente&quot;) 2 μl de sustrato (~ 5 mg / ml) NOTA: Para ensayos de quinasa recombinante, el volumen puede ajustarse para acomodar la proteína purificada. Calcular de tal manera que el volumen de reacción final sea de 30 μl. Utilice esta receta para preparar un maestromezcla. Tras la recepción del ATP marcado, diluir el stock de H 2 O a una actividad específica de 0,01 mCi / μl antes de añadir a la mezcla de reacción. </li><li> Para inicializar el ensayo, añadir toda la mezcla de reacción a la muestra de quinasa e incubar la reacción a 30 ° C durante 5 min a 1 h dependiendo de la actividad de la quinasa que se está analizando. NOTA: Cuando se trabaja con una quinasa cuya actividad no se ha ensayado previamente, realizar un curso de tiempo de actividad quinasa con intervalos de 5 minutos entre los puntos de tiempo. </li></ol> 3. Terminación de reacción y SDS-PAGE <ol><li> Parar la reacción poniendo en hielo y añadiendo 7,5 μL de tampón de muestras Laemmli 5x 6 . </li><li> Calentar a 100 ° C durante 30 s a 2 min en bloque de calor. </li><li> Toque el centrifugado y cargue 20 μL por pocillo en gel SDS-PAGE al 10-15%. Haga funcionar el gel lo suficiente como para separar la quinasa y el sustrato (típicamente 1 h a una potencia constante de 5 W) Asegúrese de mantener el aparato de gel protegido para limitar la exposición a 32 </suP&gt; P. <ol><li> Aquí, utilice aparatos de gel hechos en casa, pero los mini-geles estándar disponibles en el mercado son perfectamente adecuados. Utilice las dimensiones como sigue: Geles: 8 cm de ancho, 5,5 cm de longitud (resolución), 1,5 mm de espesor. Peines: 15 pozos, 1,5 mm de espesor, 2,9 mm de ancho, 16 mm de profundidad </li></ol></li></ol> 4. Gel de tinción y secado Precaución: Para todos los pasos, asegúrese de reducir la exposición personal a 32 P mediante el uso de blindaje radiactivo y el uso de equipo de protección personal. Para obtener más información sobre pasos específicos se incluyen algunas referencias útiles. <ol><li> Se retira el gel de las placas de vidrio / alúmina y se coloca en 50 ml de tinción Coomassie (ácido acético glacial al 10%, metanol al 50%, colorante R-250 al 0,25%) durante 1 h en un agitador orbital ajustado a 50 rpm. Para este paso utilizar un recipiente que es ligeramente más grande que el propio gel. 8 </li><li> Mueva el gel de la mancha a la solución de fijación (10% de acD, 20% de metanol) con el fin de des-manchar. Roca el gel en 600-700 mL de solución de fijación durante la noche en un agitador orbital a 50 rpm. Colocar trozos de espuma o toallitas de laboratorio anudadas en el recipiente con el gel para absorber el colorante Coomassie 8 , 9 . </li><li> Quitar el gel de la solución de fijación y remojar en 200 ml de metanol durante 1-2 minutos con agitación suave hasta que el gel se vuelve blanco lechoso. Esto ayudará a evitar el agrietamiento durante la etapa de secado. </li><li> Humedezca una pieza de 14 cm x 14 cm de papel de filtro cualitativo con metanol y colóquela en un secador de vacío de gel de placas. Coloque el gel en el lado del papel de filtro hacia arriba. </li><li> Cubra el gel con envoltura de plástico con cuidado para evitar las arrugas y burbujas de aire. Hacer funcionar la secadora durante 1,5 ha 80 ° C. Una vez que se ha alcanzado el vacío, abra la tapa y despliegue cualquier burbuja de aire si es necesario con un rodillo de goma blanda. </li></ol> 5. Autoradiograma y Cuentas de Centelleo <ol><li> EliminarEd y unir un marcador autorad, regla fosforescente o puntos al papel de filtro en el lado del gel. Si utiliza puntos asegúrese de que están en un patrón asimétrico. Esto alineará el gel con la película después de la exposición y el desarrollo. </li><li> Utilice un contador Geiger para comprobar la intensidad de la señal. Para señales más débiles, la exposición a -70 ° C a -80 ° C con una pantalla intensificadora aumentará la densidad de la banda de película. </li><li> En un cuarto oscuro, poner gel seco en un casete de película con película y una pantalla de intensificación en el siguiente orden de arriba a abajo: gel, película, pantalla intensificadora. </li><li> Conecte la pantalla intensificadora a la tapa del cassette y tape el gel en su lugar para facilitar este paso. La pantalla intensificadora emite luz cuando es irradiada por las partículas beta de los 32 P. Estas emisiones de luz penetran la película más eficientemente que las partículas beta. <ol><li> Asegúrese de que la longitud de onda emitida desde la pantalla intensificadora correspondaEstanques a una longitud de onda la película es la más sensible a. </li><li> Utilice un contador Geiger para determinar cuánto tiempo dejará la exposición para: si el recuento de cpm es ~ 100 o inferior, intente durante la noche a -70 ° C. Si la cuenta es de ~ 10.000, comenzar con una exposición de 1 hora y optimizar desde allí. </li></ol></li><li> Al final de la exposición quitar la película y se desarrollan en un médico / procesador de película de rayos X. Si la exposición se realizó entre -70 y -80 ° C, permita que el casete se caliente a temperatura ambiente para minimizar la condensación en la película o retirar la película inmediatamente antes de que las formas de condensación 10 . </li><li> Colocar la película sobre el gel / papel de filtro secado y alinear la imagen del marcador / puntos con los marcadores / puntos en el gel seco. Marque en la película las bandas correspondientes a las normas de proteínas. Etiquetar los estándares de proteínas y los carriles de las reacciones son para referencia futura. </li><li> Excise las bandas del gel que corresponden a las bandas de interés en la película y colocarlasEn 7 ml de viales de centelleo. Añadir 4 ml de líquido de centelleo y contar con contador de centelleo líquido. Confirme que el contador está configurado para supervisar la ventana de espectro de energía correcta para 32 P. NOTA: Asegúrese también de eliminar la banda correspondiente al sustrato del carril de control sin quinasa. Esto se usará para calcular la radiación de fondo que se restará de todos los recuentos de centelleo de la muestra. </li></ol> 6. Análisis de Resultados NOTA: El autorradiograma proporciona una visualización cualitativa de los resultados. Para la cuantificación exacta, la incorporación de 32P se puede medir con un contador de centelleo. Los datos se expresan generalmente en términos de actividad relativa, como se muestra en la Figura 1B . Mientras se mantengan condiciones uniformes para todas las muestras, las mediciones relativas de la actividad específica son suficientes para comparar los tratamientos. <ol><li> Al calcular los valores de actividad específicos absolutos, realice un rigorOptimización de todas las condiciones de reacción, incluyendo las concentraciones de quinasa, sustrato y ATP fría, con el fin de asegurar un rango lineal de actividad a lo largo del tiempo ( por ejemplo, 2 x [kinasa] = 2 x actividad específica). Para quinasas con alta actividad específica, realizar ensayos con una mayor concentración de sustrato en caso de que la actividad quinasa esté limitada por la cantidad de sustrato. </li><li> Calcular la actividad específica de la quinasa de interés en unidades de nanomoles de fosfato transferidos por minuto por mg de quinasa. <ol><li> Reste los espacios en blanco de las cpm en las bandas contadas. </li><li> (T / t 1/2 )] x 0,95 donde t es el número de días desde la fecha de referencia (debe ser proporcionada por el proveedor), t 1/2 es el número de días desde la fecha de referencia Vida media de 32 P, que es 14,3 días, y 0,95 refleja la eficacia del contador de centelleo. Ejemplo: si se utiliza ATP caliente con 28 días de antigüedad, el valor de decaimiento debe ser 0.245. </li><li> Calc(Pmol) de ATP total en el ensayo (usualmente esto es igual a la cantidad de ATP frío en la reacción): volumen de ensayo (μL) x [ATP frío] (μM) = ATP total (pmoles). Ejemplo: 30 μL x 50 μM = 1500 pmol </li><li> Calcular cpm / pmol ATP: [μl de ATP caliente x (2,2 x 10 7 ) x factor de desintegración] / pmol de ATP frío. NOTA: El valor de 2,2 x 10 7 convierte 0,01 mCi / μl de ATP en cpm. </li><li> Calcular la cantidad de quinasa en el ensayo en mg. Tanto para la quinasa recombinante como para las quinasas inmunoprecipitadas, los métodos estándar tales como los ensayos de BCA son adecuados para determinar las concentraciones de partida. Ejemplo: wtERK2 0.0002 μg / μL en una reacción de quinasa de 50 μl es 0,01 μg, o 1 x 10 -5 mg. </li><li> Calcular el total de cpm en el ensayo. Reúna 30 μL de reacciones y corra 20 μL de cada reacción en un gel. Multiplicar las cpm contadas (después de la sustracción en blanco) por un factor del volumen total del ensayo / volumen cargado. Continuando con lo anteriorEjemplo, multiplique todos los conteos por 1,5 o 30/20. </li><li> Calcular la actividad específica de la quinasa ensayada: Total cpm en el ensayo) / (cpm / pmol ATP) / (tiempo de ensayo en minutos) / (cantidad de quinasa en mg) NOTA: Dividiendo el valor anterior por 1.000 se obtiene la actividad específica en nanomoles / minuto / mg </li></ol></li><li> Calcular cuántos mols de fosfato se incorporan en un sustrato (siempre y cuando se conozca su peso molecular). Esto se usa para determinar el número de fosfositos en una proteína particular una vez que la reacción ha terminado. Total cpm en el ensayo) / (cpm / pmol ATP)] / (cantidad de sustrato en pmoles) </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las quinasas son una familia diversa de proteínas que han desarrollado una amplia funcionalidad en numerosos contextos, y los ensayos de quinasa han sido increíblemente útiles en el estudio de varias proteínas de señalización y han contribuido en gran medida a nuestra comprensión actual de la comunicación celular. En particular, se utilizó el mismo ensayo básico para caracterizar dos cinasas dispares a pesar de diferencias importantes en estructura y actividad. WNK1 contiene una bolsa catalítica atípica donde la lisina ...

Las proteínas quinasas son sofisticadas enzimas críticas para la transmisión de señales celulares en respuestas apropiadas 1 . Dado su papel en el mantenimiento de la homeostasis y la prevención o promoción de estados de enfermedad [ 2] , los métodos bioquímicos para evaluar la actividad quinasa siguen siendo herramientas poderosas para delinear los detalles de la señalización eucariótica [ 3] . Aunque las estrategias que utilizan anticuerpos fosfo-específicos han sido altamente informativas en términos de medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento en el estado de señalización celular 4 , un ensayo de quinasa permite medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento directamente en términos de la actividad enzimática de una quinasa de interesar. Si bien existen varias opciones para ensayos similares que no utilizan materiales radiactivos 5 , seguimos dependiendo de este método para una cuantificación robusta de los resultados. AhíSon dos aplicaciones típicas de este ensayo, ambas valiosas por diferentes razones: el ensayo de quinasa inmunoprecipitada (IP) ( Figura 1 ) y el ensayo de proteína quinasa recombinante ( Figura 2 ). El ensayo de IP quinasa es tremendamente útil para identificar factores capaces de activar proteínas quinasas específicas así como para calibrar condiciones de tratamiento inhibidor. Brevemente, se transfecta una cinasa marcada con epítopo de interés en células eucariotas cultivadas, se somete a una variedad de tratamientos, se inmunoprecipita y se determina la capacidad para incorporar fosfato radiomarcado en un sustrato modelo ( por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP)). IP kinasa también se puede realizar sin recurrir a la sobreexpresión, ya sea por inmunoprecipitación de proteínas endógenas o cualquier número de técnicas de edición del genoma. Debido a que los tratamientos se administran en cultivo, este método puede detectar estimulaciones transmitidas a través de múltiples factores ascendentesO vías paralelas por lectura in vitro . Una ventaja importante de este método es que no requiere conocimiento previo de factores directos de aguas arriba o aguas abajo o sitios de fosforilación en el mismo. Además, una vez que se han identificado sustratos específicos para una quinasa de interés, se puede usar el mismo protocolo de ensayo de quinasa con componentes recombinantes para medir actividad específica hacia sustratos naturales e identificar sitios específicos de fosforilación cuando se combinan con análisis de espectrometría de masas. Los sitios identificados de esta manera pueden validarse adicionalmente con ensayos de quinasa utilizando sustratos de sustrato. Por último, este método también puede usarse para detectar y medir la autofosforilación. El protocolo proporcionado aquí asume un esquema de purificación de proteínas optimizado o un método de transfección para expresar una quinasa marcada por afinidad de interés en células cultivadas. Para exposiciones más detalladas de transfección, lisis, inmunoprecipitación y protOcols, sugerimos referirse a Cold Spring Harbor Protocolos 6 . Para obtener más información sobre el desarrollo del ensayo y la modificación, consulte la Fosforilación de Proteínas: Selected Methods in Enzymology 7 .

<table><tbody><tr><td>Proteína A Sefarorosa CL-4B</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0963-03</td><td></td></tr><tr><td>Radiomarcado [&gamma;-32P] ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG035C010MC</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>#1610737</td><td></td></tr><tr><td>Blindaje radiactivo</td><td>Research Products International</td><td>BR-006</td><td></td></tr><tr><td>R-250 colorante (Coomassie)</td><td>Thermo Fisher</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Papel de filtro cualitativo de grado 3</td><td>Whatman</td><td>1003-917</td><td></td></tr><tr><td>Secador de vacío de gel</td><td>Slab Bio-Rad</td><td>Modelo 583 Secador de gel #1651745&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Marcador de radiofrecuencia</td><td>Agilent Technologies</td><td>420201</td><td></td></tr><tr><td>Regla fosforescente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8133</td><td></td></tr><tr><td>Puntos fosforescentes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5149</td><td></td></tr><tr><td>Contador Geiger</td><td>Ludlum</td><td>Model 3 con detector</td><td></td>44-9</tr><tr><td>BioMax Cassette 8 x 10"</td><td>Carestream Health</td><td>107 2263</td><td></td></tr><tr><td>BioMax Película MS 8" x 10"</td> <td>Carestream Health</td><td>829 4985</td><td></td></tr><tr><td>BioMax MS Pantalla intensificadora 8" x 10"</td> <td>Carestream Health</td><td>851 8706</td><td></td></tr><tr><td>Procesador de película médica/de rayos X</td><td>Konica Minolta</td><td>SRX-101A</td><td></td></tr><tr><td>Viales de centelleo</td><td>Research Products International</td><td>125500</td><td></td></tr><tr><td>Fluido de centelleo</td><td>MP Biomedicals</td><td>188245305</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LS 6500 Contador de centelleo</td><td>Beckman</td><td>LS 6500</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo de la actividad de proteína quinasa con atp radiomarcado

Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP

Las proteínas quinasas son capaces de gobernar a gran escala los cambios celulares en respuesta a complejas matrices de estímulos, y mucho esfuerzo se ha dirigido a descubrir los detalles alostéricos de su regulación. Las quinasas comprenden redes de señalización cuyos defectos son a menudo características de múltiples formas de cáncer y enfermedades relacionadas, haciendo que una plataforma de ensayo sea susceptible de manipulación de factores reguladores aguas arriba y validación de requerimientos de reacción críticos en la búsqueda de terapias mejoradas. Aquí, describimos un ensayo de quinasa básico que se puede adaptar fácilmente para adaptarse a preguntas experimentales específicas incluyendo, pero sin limitarse a, ensayar los efectos de agentes bioquímicos y farmacológicos, manipulaciones genéticas tales como mutación y deleción, así como condiciones de cultivo celular y tratamientos para investigar Mecanismos de señalización celular. Este ensayo utiliza [γ-32P] ATP radiomarcado, que permite comparaciones cuantitativas y visualización clara de los resultados, y puede ser modPara uso con quinasa inmunoprecipitada o recombinante, sustratos específicos o tipificados, en una amplia gama de condiciones de reacción.

WNK1 IP quinasa ensayos La WNK1 marcada con Myc se transfectó en células HEK293 y se inmunoprecipitó con un anticuerpo anti-Myc [ 11] . El inmunoprecipitado mostró actividad quinasa hacia el sustrato modelo MBP así como hacia sí mismo ( Figura 1A ). WNK1 mutantes fueron luego probados para la actividad quinasa hacia MBP por el mismo método, esta vez empleando GST marcado construcciones ( <...

Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.

Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

Protein kinases are able to govern large-scale cellular changes in response to complex arrays of stimuli, and much effort has been directed at uncovering ...

El objetivo general de este ensayo es medir la actividad enzimática de las proteínas quinasas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización por quinasas, como qué tan activa es una quinasa o un mutante de quinasa, su especificidad y si su actividad es sensible a diferentes tratamientos celulares. La ventaja principal de esta técnica es que es versátil y cuantitativa.El procedimiento será demostrado por Steve Stippec, científico investigador en el Laboratorio Cobb, quien tiene una amplia experiencia con este ensayo. Para comenzar, agregue dos microlitros de anticuerpo de un miligramo por mililitro a 200 microlitros de lisados celulares e incube a cuatro grados Celsius durante una hora, agitando suavemente. Lave las perlas de proteína A-Sepharose dos o tres veces agregando tampón de lisis y luego centrifugando brevemente a cuatro grados Celsius durante 30 segundos a un minuto a 5000 ×g; a continuación, retire el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las perlas en tampón.A continuación, agregue 30 microlitros de una suspensión al 50 % de perlas de proteína A-Sepharosa en tampón de lisis a los lisados. Incube los lisados a cuatro grados Celsius durante una hora con agitación suave. Centrifugue brevemente a cuatro grados Celsius para sedimentar las perlas y retire el sobrenadante.Lave las perlas tres veces con un mililitro de tampón de lavado de perlas, seguido de centrifugación breve, luego lave las perlas una vez con un tampón de reacción de quinasa X. Después de la centrifugación breve, retire tanto tampón como sea posible sin eliminar las perlas. Para iniciar el ensayo, agregue toda la mezcla de reacción a la muestra de quinasa.Incube la reacción a 30 grados Celsius durante cinco minutos hasta una hora, dependiendo de la actividad de la quinasa que se esté ensayando. Detenga la reacción colocándola en hielo y agregando 7,5 microlitros de tampón de muestra Laemmli al 5 X, luego caliente la reacción a 100 grados Celsius durante tres a cinco minutos en el bloque térmico. Después de centrifugar brevemente la muestra, cargue 20 microlitros por pozo en un gel de SDS-PAGE al 10-15%.Asegúrese de mantener el aparato de electroforesis protegido para limitar la exposición al fósforo-32, ya que es un emisor beta de alta energía. Corra el gel el tiempo suficiente para separar la quinasa y el sustrato. Después de la corrida, retire el gel de las placas de vidrio y aluminio, y luego coloque el gel en 50 mililitros de tinción de Coomassie durante una hora en un agitador orbital ajustado a 50 RPM.Para este paso, utilice un recipiente ligeramente más grande que el gel mismo. Para desmanchar el gel, traslade el gel desde el colorante hasta la solución fijadora. Coloque trozos de espuma o toallitas de laboratorio anudadas en el recipiente junto con el gel para absorber el colorante de Coomassie.Agite el gel en 600 a 700 mililitros de solución fijadora durante la noche en un agitador orbital a 50 RPM. Al día siguiente, retire el gel de la solución fijadora y sumérjalo en 200 mililitros de metanol durante uno a dos minutos con agitación suave hasta que el gel adquiera un color blanco lechoso. Esto ayudará a prevenir grietas durante el paso de secado.A continuación, humedezca un trozo de papel filtro cualitativo de aproximadamente 14 centímetros por 14 centímetros con metanol y colóquelo sobre un secador de geles en placa con vacío. Coloque el gel sobre el papel filtro, con el lado frontal hacia arriba. Cubra cuidadosamente el gel con una envoltura de plástico, luego encienda el secador, póngalo en funcionamiento y aplique vacío.Una vez que se haya alcanzado el vacío después de solo unos segundos, elimine las burbujas de aire con un rodillo de goma blanda. Continúe el proceso durante 90 minutos. Retire el gel seco y coloque un marcador de autorradiografía, como una regla fosforescente o un punto, en el papel filtro del lado del gel, y colóquelo en una caja conteniendo una pantalla intensificadora.Utilice un contador Geiger para verificar la intensidad de la señal. Para señales más débiles, la exposición a temperaturas de menos 70 grados Celsius a menos 80 grados Celsius con una pantalla intensificadora aumentará la densidad de la banda en la película. En una sala oscura, coloque un trozo de película encima del gel seco dentro de la caja de película que contiene una pantalla intensificadora.Si el recuento de CPM es 100 o inferior, intente una exposición nocturna a entre -70 y -80 grados Celsius. Alternativamente, si el recuento es cercano a 10.000, comience con una exposición de una hora y optimice a partir de ahí. Al finalizar la exposición, retire la película antes de revelarla en un procesador médico o de película de rayos X.Marque las bandas correspondientes a los patrones de proteína en la película. Además, etiquete los patrones de proteína y las carriles de reacción para referencia futura. Recorte las bandas del gel que corresponden a las bandas de interés en la película.Coloque las bandas en viales de centelleo de siete mililitros y agregue cuatro mililitros de líquido de centelleo. Cuente las bandas con un contador de centelleo líquido. Confirme que el contador esté configurado para monitorear la ventana del espectro de energía correcta para fósforo-32.Continúe con el análisis de los resultados según se describe en el protocolo del texto. Las fracciones purificadas de ERK2 se utilizaron en un ensayo de quinasa con MBP en presencia o ausencia de MEK1R4F, un estimulador constitutivamente activo de la actividad quinasa de ERK2. En un experimento similar, se realizó un ensayo de quinasa de MBP para medir la actividad de mutantes recombinantes de ERK2 purificados a partir de cultivos bacterianos en relación con la proteína tipo silvestre.Aunque ERK2 fue capaz de fosforilar MBP cuando fue estimulado por MEK1R4F, la actividad quinasa de ERK2 se ve drásticamente abrogada por la mutación de la lisina catalítica o de una treonina cercana a los sitios canónicos de fosforilación dual. ERK2 T188D y ERK2 T188E muestran una actividad quinasa marginal hacia un pequeño péptido flexible. Sin embargo, no logran fosforilar de manera robusta los sustratos conocidos de ERK2, Nup153 y PDX1, como se observa con ERK2 de tipo silvestre.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en uno o dos días si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar ATP radiomarcado para ensayar la actividad de las proteínas cinasas y así comprender mejor las redes de señalización en las que participan. Al intentar este procedimiento, es importante recordar optimizar el protocolo de precipitación de aminoácidos para aislar las cinasas de interés, teniendo en cuenta cantidades iguales de proteína, y medir las concentraciones de proteína recombinante para garantizar comparaciones precisas de la actividad de la cinasa.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la señalización celular exploraran vías específicas de transducción y sus roles en la regulación homeostática, así como sus contribuciones a la progresión de enfermedades. No olvide que trabajar con materiales radiactivos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.

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Quinasa con repeticiones ricas en leucina 2 es una quinasa multidominio grandes, las mutaciones en el que son la causa genética más común de enfermedad de Parkinson. Análisis de la actividad quinasa de la proteína ha demostrado ser una herramienta crucial en la comprensión de la biología y la disfunción de esta proteína. En este...

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Este video muestra un ensayo enzimático basado en cromatografía en capa fina para determinar la actividad de la pirofosfoquinasa utilizando nucleótidos radiomarcados. El método proporciona información sobre la síntesis de nucleótidos y las reacciones de fosfotransferencia.

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