Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado

El objetivo general de este ensayo es medir la actividad enzimática de las proteínas quinasas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de quinasas, como el grado de actividad de una quinasa o mutante de quinasa, su especificidad y si su actividad es sensible a diferentes tratamientos celulares. La principal ventaja de esta técnica es que es versátil y cuantitativa.

El demostrador del procedimiento estará a cargo de Steve Stippec, un científico investigador del Laboratorio Cobb que tiene mucha experiencia con este ensayo. Para empezar, añade dos microlitros de un miligramo por mililitro de anticuerpo a 200 microlitros de lisados celulares e incuba a cuatro grados centígrados durante una hora mientras se balancea. Lave las perlas de proteína A-sefarosa dos o tres veces agregando tampón de lisis y luego toque el centrifugado a cuatro grados centígrados durante 30 segundos a un minuto a 5000 veces g, luego retire el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender las perlas en tampón.

A continuación, añada 30 microlitros de purín al 50% de perlas de proteína A-Sepharose y tampón de lisis a los lisados. Incubar los lisados a cuatro grados centígrados durante una hora mientras se balancean. Toque el centrifugado a cuatro grados centígrados para pellet las cuentas y eliminar el sobrenadante.

Lave las perlas tres veces con un mililitro de tampón de lavado de perlas, seguido de un centrifugado al tacto, luego lave las perlas una vez con un tampón de reacción de quinasa X. Después de girar al tacto, retire la mayor cantidad posible de tampón sin quitar las cuentas. Para inicializar el ensayo, agregue toda la mezcla de reacción a la muestra de quinasa.

Incubar la reacción a 30 grados centígrados durante cinco minutos a una hora, dependiendo de la actividad de la quinasa que se esté analizando. Detenga la reacción colocándolo sobre hielo y agregando 7,5 microlitros de cinco tampones de muestra X Laemmli, luego caliente la reacción a 100 grados Celsius durante tres a cinco minutos en el bloque de calor. Después de girar la muestra al tacto, cargue 20 microlitros por pocillo en un gel SDS-PAGE del 10 al 15%.

Asegúrese de mantener el aparato de gel protegido para limitar la exposición al fósforo-32 porque es un emisor beta de alta energía. Pasa el gel el tiempo suficiente para separar la quinasa y el sustrato. Después de la carrera, retire el gel de las placas de vidrio y aluminio, luego coloque el gel en 50 mililitros de tinte Coomassie durante una hora en un agitador orbital ajustado a 50 RPM.

Para este paso, use un recipiente que sea un poco más grande que el gel en sí. Para eliminar el gel, muévalo de la mancha a la solución de fijación. Coloca pedazos de espuma o toallitas de laboratorio anudadas en el recipiente con el gel para absorber el tinte Coomassie.

Mezcle el gel con 600 a 700 mililitros de solución fijadora durante la noche en un agitador orbital a 50 RPM. Al día siguiente, retire el gel de la solución fijadora y sumérjalo en 200 mililitros de metanol durante uno o dos minutos con una agitación suave hasta que el gel se vuelva blanco lechoso. Esto ayudará a evitar grietas durante el paso de secado.

A continuación, humedezca un trozo de papel de filtro cualitativo de aproximadamente 14 centímetros por 14 centímetros con metanol y colóquelo en un secador al vacío de gel de losa. Coloca el gel sobre el papel de filtro, con la parte delantera hacia arriba. Cubra cuidadosamente el gel con una envoltura de plástico, luego encienda y encienda la secadora y aplique aspiradora.

Una vez que se haya alcanzado el vacío después de solo unos segundos, extienda las burbujas de aire con una rebrada de goma suave. Continúa la carrera durante 90 minutos. Retire el gel seco y coloque un marcador de autorad, como una regla fosforescente o un punto, en el papel de filtro en el costado del gel y colóquelo en un casete que contenga una pantalla intensificadora.

Utilice un contador Geiger para comprobar la intensidad de la señal. Para señales más débiles, la exposición a menos 70 grados Celsius a menos 80 grados Celsius con una pantalla intensificadora aumentará la densidad de la banda de la película. En un cuarto oscuro, coloque un trozo de película encima del gel seco dentro del casete de película que contiene una pantalla intensificadora.

Si el recuento de CPM es de 100 o menos, intente una exposición nocturna a menos 70 a 80 grados Celsius. Alternativamente, si el recuento está más cerca de 10.000, comience con una exposición de una hora y optimice a partir de ahí. Al final de la exposición, retire la película antes de revelarla en un procesador de película médica o de rayos X.

Marque las bandas correspondientes a los estándares de proteínas en la película. Además, etiquete los patrones de proteínas y los carriles de reacción para futuras referencias. Extirpa las bandas del gel que corresponden a las bandas de interés de la película.

Coloque las bandas en viales de centelleo de siete mililitros y agregue cuatro mililitros de líquido de centelleo. Cuente las bandas con un contador de centelleo líquido. Confirme que el contador está configurado para monitorear la ventana correcta del espectro de energía para el fósforo-32.

Proceda a analizar los resultados como se describe en el protocolo de texto. Se utilizaron fracciones de ERK2 purificadas en un ensayo de quinasa con MBP en presencia o ausencia de MEK1R4F, un estimulador constitutivamente activo de la actividad de la quinasa ERK2. En un experimento similar, se utilizó un ensayo de quinasa MBP para medir la actividad de mutantes ERK2 recombinantes purificados a partir de cultivos bacterianos en relación con la proteína de tipo salvaje.

Aunque ERK2 fue capaz de fosforilar MBP cuando fue estimulada por MEK1R4F, la actividad de la quinasa ERK2 se anula drásticamente por mutación de la lisina catalítica o una treonina proximal a los sitios canónicos de fosforilación dual. ERK2 T188D y ERK2 T188E muestran una actividad marginal de quinasa hacia un péptido pequeño y flexible. Sin embargo, son incapaces de fosforilar de forma robusta los sustratos ERK2 conocidos, Nup153 y PDX1, como se ha visto con el tipo salvaje ERK2.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en uno o dos días si se realiza correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar el ATP radiomarcado para analizar la actividad de las proteínas quinasas para comprender mejor las redes de señalización en las que residen. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe optimizar el protocolo de precipitación de aminoácidos para reducir las quinasas de interés para tener en cuenta cantidades iguales de proteína y medir las concentraciones de proteína recombinante para garantizar comparaciones precisas de la actividad de la quinasa.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la señalización celular exploraran vías de transducción específicas y sus roles en la regulación homeostática, así como sus contribuciones a la progresión de la enfermedad. No olvide que trabajar con materiales radiactivos puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal, al realizar este procedimiento.