Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real
27 de junio de 2017
Aquí presentamos un protocolo para la detección de la expresión de microRNA en la membrana peritoneal de rata mediante la cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real. Este método es adecuado para estudiar el perfil de expresión de microARN en la membrana peritoneal de rata en varias condiciones patológicas.
El objetivo general de este procedimiento es purificar y detectar con éxito miARN en la membrana peritoneal de la rata. Para comenzar este procedimiento, después de la anestesia inhalatoria con isoflurano al 4%. Rocíe la piel abdominal de la rata con etanol al 70% y colóquela en la lámina de corcho, sobre su espalda.
A continuación, realice una incisión longitudinal en la piel abdominal, el músculo y la membrana peritoneal del animal con tijeras y pinzas. Levante la membrana peritoneal con las pinzas y haga incisiones horizontales en su parte superior a lo largo del hueso de la costilla inferior debajo del diafragma. Y en su parte inferior en la región lateral con las tijeras quirúrgicas.
A continuación, realice incisiones longitudinales laterales para extraer la membrana peritoneal del cuerpo, utilizando las tijeras quirúrgicas. A continuación, lávelo con PPS en una placa de Petri. Cortar y recortar 20 miligramos de muestra de membrana peritoneal.
En este procedimiento, coloque una muestra de membrana peritoneal de 20 miligramos en un homogeneizador de vidrio. Y agregue 700 microlitros de reactivo de lisis a base de fenol guanidina. Después de eso, homogeneice la muestra de membrana peritoneal en hielo, presionando lentamente un mortero sobre la muestra con torsión.
Repita este proceso varias docenas de veces, hasta que la muestra de membrana peritoneal se haya disuelto completamente en el reactivo de lisis a base de fenol guanidina. Para una mayor homogeneización, transfiera el lisado homogeneizado a un sistema de trituración de biopolímeros en la columna de centrifugación de micro centrífuga en un tubo de recolección de dos mililitros. A continuación, centrifugarlo a 14.000 veces G durante tres minutos a cuatro grados centígrados.
A continuación, transfiera el lisado homogeneizado a un nuevo tubo de microcentrífuga. Agregue 140 microlitros de cloroformo al lisado homogeneizado y tape el tubo de forma segura. Posteriormente, mezcle el tubo por inversión durante 15 segundos.
Después, incuba la muestra durante dos o tres minutos a temperatura ambiente. A continuación, centrifugarlo a 12.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 300 microlitros del sobrenadante a un nuevo tubo de microcentrífuga, sin alterar el precipitante.
Y agregue 450 micro litros de etanol 100%. A continuación, mezcle la muestra mediante vórtice durante cinco segundos. A continuación, pipetee hasta 700 microlitros de la muestra en una columna de centrifugación a base de membrana de silicona, colocada en un tubo de recolección de dos mililitros, y cierre la tapa.
A continuación, centrifugarlo a 15.000 veces G durante 15 segundos. Después de la centrifugación, deseche el flujo en el tubo de recolección. A continuación, añada 700 microlitros de tampón de lavado 1 a la columna de centrifugación basada en membrana de silicona para lavar rigurosamente la muestra y cerrar el tapón.
Centrifugar a 15.000 veces G durante 15 segundos. Después de la centrifugación, deseche el flujo en el tubo de recolección. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado 2 a la columna de centrifugación a base de membrana de sílice, para eliminar cualquier rastro de sal, y cierre la tapa.
A continuación, centrifugarlo a 15.000 veces G durante 15 segundos. Después de la centrifugación, deseche el flujo y el tubo de recolección y repita este procedimiento nuevamente. A continuación, centrifugar la columna de centrifugación basada en membrana de sílice nuevamente a 15.000 veces G durante un minuto.
Después de la centrifugación, deseche el tubo de recolección y cualquier flujo a través de él. Coloque la columna de centrifugación a base de membrana de sílice en un nuevo tubo de recolección de un punto cinco mililitros. A continuación, transfiera 25 microlitros de agua libre de RNasa a la columna y cierre el tapón.
Deje la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos. Centrifugar a 15.000 veces G durante un minuto. A continuación, transfiera el alouette de 25 microlitros que contiene el ARN total a un nuevo tubo de microcentrífuga y guárdelo a menos 80 grados centígrados antes de usarlo.
En este procedimiento, prepare una solución de mezcla maestra que contenga dos microlitros de mezcla de ácido nucleico 10x, dos microlitros de mezcla de transcriptasa inversa y cuatro microlitros de tampón Hispec 5x, para un total de 8 microlitros por tubo. A continuación, dispense 8 microlitros de la solución de mezcla maestra en cada tubo. Mida la cantidad de ARN totales utilizando un espectrofotómetro.
A continuación, añada un microgramo de los ARN totales aislados, purificados de la muestra de membrana peritoneal, a cada tubo. A continuación, agregue agua libre de RNasa a cada tubo para llevarlo a un total de 20 microlitros. A continuación, mézclalo bien pipeteando y centrifugado durante 15 segundos.
A continuación, incubar la muestra durante 60 minutos a 37 grados centígrados. Luego incubarlo durante cinco minutos a 95 grados centígrados. Transfiera el ADNc recién generado a un nuevo tubo de microcentrífuga y dilúyalo 10 veces con agua libre de ARNasa.
En este procedimiento, prepare una mezcla maestra que contenga 12 coma cinco microlitros de 2x PCR master mix, dos coma cinco microlitros de cinco micromolares de cada cebador miARN disuelto en agua libre de nucleasa, y un coma dos cinco microlitros de cebador universal 10x, para cada pocillo. Dispense 22 coma cinco microlitros de esta mezcla maestra en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. A continuación, añada dos coma cinco microlitros de ADNc molde a cada pocillo.
Selle la placa de reacción de 96 pocillos con un trozo de película. A continuación, centrifugarlo a 1.000 veces G durante 30 segundos. Para ejecutar el programa de ciclo de PCR, configure la placa en el instrumento de PCR en tiempo real.
En el software de PCR en tiempo real, defina las propiedades experimentales. A continuación, asigne nombres a las muestras y a los miARN objetivo de cada pocillo. Luego, en el software de PCR en tiempo real, ingrese un volumen de reacción de 20 microlitros y las siguientes condiciones de ciclo de PCR de acuerdo con las instrucciones.
Pre incubación a 95 grados centígrados durante 15 minutos. Y luego 40 ciclos de desnaturalización a 94 grados Celsius durante 15 segundos, y arrodillarse a 55 grados Celsius durante 30 segundos, y extensión a 70 grados Celsius durante 30 segundos. Con base en el cribado de microarrays de miRNA, se ha encontrado que los niveles de seis miRNAs están significativamente aumentados en la membrana peritoneal de ratas con fibrosis peritoneal, en comparación con los de ratas simuladas y ratas control, utilizando QRTCPR, siguiendo el protocolo presentado en este manuscrito.
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Visión general
Este protocolo describe la detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de rata utilizando la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real cuantitativa. Está diseñado para estudiar perfiles de expresión de microARN en varias condiciones patológicas.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología
- Investigación de microARN
Antecedentes
- Los microARN juegan roles cruciales en la regulación génica.
- Entender su expresión en condiciones patológicas es vital.
- La membrana peritoneal de rata sirve como modelo para estudiar estas expresiones.
- La PCR en tiempo real cuantitativa es un método confiable para la detección.
Propósito del estudio
- Purificar y detectar miARN en la membrana peritoneal de rata.
- Analizar perfiles de expresión de microARN en varias condiciones.
- Proporcionar un protocolo detallado para investigadores en el campo.
Métodos utilizados
- Anestesia inhalatoria con 4% de isoflurano.
- Preparación del área abdominal con etanol al 70%.
- Incisión quirúrgica para acceder a la membrana peritoneal.
- Uso de tijeras y fórceps para la extracción de la membrana.
Resultados principales
- Purificación exitosa de miARN de la membrana peritoneal.
- Detección cuantitativa de la expresión de microARN lograda.
- Protocolo validado para su uso en varios estudios patológicos.
- Aplicaciones potenciales en la comprensión de los mecanismos de las enfermedades.
Conclusiones
- El protocolo es efectivo para estudiar microARN en modelos de ratas.
- Proporciona información sobre el papel de los microARN en la patología.
- La investigación futura puede basarse en esta metodología para aplicaciones más amplias.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Quantitative real-time PCR-based detection of microRNA expression in rat peritoneal membrane enables precise interrogation of gene regulation in disease-relevant tissue models. This workflow supports early discovery teams seeking to validate mechanistic hypotheses and identify translational biomarkers in fibrotic and inflammatory pathologies. Reliable miRNA quantification in preclinical models enhances predictive confidence and informs risk-adjusted portfolio decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of miRNA-mediated regulatory pathways in disease models.
- Supports biological de-risking by quantifying miRNA changes in response to pathological stimuli.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of miRNA expression between control and disease states.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized protocol for miRNA extraction and quantification from tissue samples.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for downstream screening and assay development.
- Establishes assay readiness for evaluating compound effects on miRNA expression profiles.
Translational & Preclinical Research
- Aligns miRNA expression data with disease-relevant preclinical models for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from early discovery through preclinical validation by supporting mechanistic studies in vivo.
- Informs risk-adjusted advancement decisions based on quantitative molecular readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies to preclinical biomarker validation, supporting both hypothesis testing and translational research.
- Discovery Biology: Quantitative miRNA profiling clarifies regulatory pathways and supports hypothesis-driven research.
- Screening: Standardized qRT-PCR outputs enable reproducible comparison across experimental conditions.
- Analytics: Provides robust quantitative measurements for statistical analysis of miRNA expression changes.
- Translational Research: Connects molecular findings in animal models to potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted for diverse tissue types and disease models, supporting broad R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable miRNA quantification workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and translational biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue dissection, RNA handling, and qRT-PCR analysis.
- Needs access to real-time PCR instrumentation and validated reagents.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis.
- Adaptation may be necessary for different tissue types or disease models.
- Sample quality and RNA integrity are critical for reliable quantification.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Peritoneum Sample Collection
8:29
Conclusion
8:06
Results: Upregulated miRNAs in the Peritoneal Membrane of Peritoneal Fibrosis Rats
1:54
Purifying Total RNAs from Peritoneal Membrane Samples
5:36
Reverse Transcription of Total RNA
6:44
qRT-PCR of miRNA
