Name: El pez cebra In Situ Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Aprende a preparar la médula espinal in situ en Danio rerio para registrar neuronas sensoriales y motoras mediante técnicas electrofisiológicas. Este método permite estudiar la excitabilidad eléctrica durante el desarrollo embrionario y larval.

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (F32 NS059120 a RLM y R01NS25217 y P30NS048154 a ABR).

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

Los métodos descritos aquí permiten la caracterización eléctrica y morfológica de las neuronas sensoriales y motoras de embriones de pez cebra después de la disección mínima de la médula espinal. Las neuronas permanecen sanos durante al menos 1 h, el límite de tiempo impuesto en estas grabaciones. Las neuronas han sido registrados utilizando la configuración de célula completa estándar, así como de parches nucleadas; el último método minimiza los problemas de espacio-clamp que se opone a que un estudio biofísico detalla...

<html> George Streisinger fue pionera en el uso de Danio rerio, conocido comúnmente como el pez cebra, como un sistema modelo para el análisis genético de desarrollo de los vertebrados 10. El modelo ofrece varias ventajas, incluyendo: (1) relativamente simple y barato cría de animales; (2) fertilización externa, lo que permite un fácil acceso a los embriones de las etapas de desarrollo más tempranas; y (3) un embrión transparente, permitiendo la observación directa y repetidas de células, tejidos y órganos, ya que forman. En las décadas siguientes, varios avances aumentaron aún más el poder del modelo de pez cebra. En particular, las pantallas adelante genéticos y los esfuerzos de secuenciación de todo el genoma jugaron un papel clave en la identificación de mutaciones y genes críticos para muchos procesos de desarrollo 11, 12, 13, 14,&quot;&gt; 15, métodos de clonación 16. Puerta de enlace han permitido la aplicación rutinaria de transgénicos se aproxima a 17, 18. Los recientes avances en la edición genoma, ejemplificada por la transcripción del tipo activador de (Talens) y agrupados repeticiones intercaladas regularmente cortos palindrómicas (CRISPR) -Cas9 nucleasas, permitir la introducción selectiva de mutaciones, así como knock-out y knock-in se aproxima a 19, 20, 21, 22. combinados, estos métodos hacen que el pez cebra un poderoso modelo para el estudio de los mecanismos genéticos que subyacen a los comportamientos específicos y varias enfermedades humanas 23, 24, 25, 26, 27. Este trabajo se centra en el desarrollola regulación mental y el papel de la actividad eléctrica en el desarrollo neuronal. La atención se centra en la médula espinal, para el que el modelo de pez cebra ofrece varias ventajas. En primer lugar, es relativamente fácil de acceder pez cebra en estadios embrionario y larval; Por lo tanto, se puede estudiar la función de la médula espinal durante las etapas de desarrollo que tienen menos neuronas y circuitos simples 28, 29. Por otra parte, la médula espinal pez cebra tiene un conjunto diverso de neuronas, similar a otros vertebrados, como se demuestra por los patrones característicos y distintivos de factores de transcripción 30, 31, 32, 33, 34, 35. La mayoría de los estudios en el pez cebra que tienen como objetivo descubrir los mecanismos que subyacen a la función de los circuitos de la médula espinal, especialmentelos que apoyan la locomoción, se centran comprensiblemente en estadios larvarios 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Sin embargo, muchas de las neuronas que forman las redes de locomotoras espinales iniciado su diferenciación en las etapas embrionarias tempranas, ~ 9-10 h después de la fertilización (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. En vista de esto, la comprensión de cómo surgen las propiedades morfológicas y eléctricas de las neuronas espinales y el cambio entre las etapas embrionario y larval es importante para un overacomprensión ll de la formación y la función de circuito locomotor. Los métodos de disección descritas aquí permiten grabaciones de patch clamp de neuronas de la médula y se han aplicado con éxito en las etapas embrionarias (~ 17-48 HPF) y estadios larvarios (~ 3-7 días después de la fertilización [dpf]). Este enfoque limita la cantidad de disección requerida para proporcionar acceso a las neuronas de interés. El protocolo se diferencia de la mayoría de los otros métodos publicados para la grabación de las neuronas espinales de pez cebra en que pegamento veterinario de sutura se utiliza, en lugar de un pasador de tungsteno bien, para unir el embrión o larva a la cámara de registro. La disponibilidad de dos enfoques diferentes (es decir, cola de sutura contra el pasador de tungsteno) para el montaje de los embriones de pez cebra o larvas para el análisis electrofisiológico proporciona a los investigadores con opciones alternativas para alcanzar sus objetivos experimentales específicas. En primer lugar, los procedimientos de acceso y grabación en una emergente<html> ulación de las neuronas sensoriales primarias, células Rohon-Barba, se describen. Los cuerpos celulares de estas neuronas se encuentran dentro de la médula espinal dorsal. Existen células Rohon-Barba en numerosas especies de vertebrados, se diferencian en el desarrollo temprano, y subyacen a la respuesta táctil embrionaria 6, 44, 47, 48. En segundo lugar, los procedimientos de acceso y registro de las neuronas motoras espinales se detallan. surgen de pez cebra neuronas motoras espinales durante dos oleadas de la neurogénesis. Surgen las neuronas motoras primarias nacidos antes-al final de la gastrulación (~ 9-16 hpf), con sólo 3-4 neuronas motoras primaria presentes por hemisegment 45, 46, 49. En contraste, la población nacida después de las neuronas motoras secundarias es más numeroso y se produce durante un período prolongado, a partir de ~ 14 HPFef &quot;&gt; 45, 50. génesis secundaria de neuronas motoras en los segmentos de mediados de tronco se ha completado todo por 51 HPF 50. neuronas motoras secundarias se considera que son la contrapartida de las neuronas motoras en amniotas 46. Curiosamente, las neuronas supraespinales, a través de la dopamina, regulan la locomoción en la larva y el motor secundario génesis neurona en el embrión y larva joven 50, 51. neuronas motoras primarias y secundarias comprenden cada uno varios subtipos diferentes. cada motor primario proyectos subtipo neurona un axón periférico que inerva un grupo muscular característica, lo que resulta en un estereotipo, la identificación de trayectoria axonal. Generalmente, las neuronas motoras secundarias siguen las vías axonales previamente establecidos por las neuronas motoras primarias. por lo tanto, con respecto a las trayectorias axonales, neuronas motoras primarias y secundarias son similares, con la excepción de que el espesor axonal y somata tamaño unare mayor para las neuronas motoras primarias 45. En tercer lugar, se discuten los métodos para la grabación de algunos tipos de interneuronas. Sin embargo, en estos casos, se requiere una cantidad limitada de la eliminación de otras células de la médula espinal, y por lo tanto la médula espinal es menos intacta que para las grabaciones de células Rohon-Barba o neuronas motoras.

<table><tbody><tr><td>Filtro de vacío/Botella de almacenamiento, 0,22 mm poro</td><td>Corning</td><td>431096</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0,2 mm</td><td>Whatman</td><td>6780-2502</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td>Etilo 3-aminobenzoato sal de metanosulfonato&nbsp;</td></tr><tr><td>&alpha;-bugarotoxina</td><td>Tocris</td><td>11032-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotoxina</td><td>Tocris</td><td>4368-28-9</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-549 sal de hidracina</td><td>Sondas moleculares</td><td>A-10438</td><td>colorante fluorescente</td></tr><tr><td>Spin-X filtro de tubo de centrífuga</td><td>Corning</td><td>8161</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio Fisher</td><td></td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard silicona kit de elastómero</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>elastómero de silicona</td></tr><tr><td>Placas de Petri</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>30-0038</td><td>diámetros interior y exterior de 0,78 y 1,0 mm (capilares de vidrio de pared delgada)Capilares de</td></tr> <tr><td>vidrio de borosilicato</td><td>Drummond Scientific</td><td>1-000-1000-100</td><td>diámetros interior y exterior de 1,13 y 1,55 mm (capilares de vidrio de pared gruesa)</td></tr><tr><td>Accesorio de polipropileno de púas en miniatura&nbsp;</td><td>Cole-Palmer</td><td>6365-90</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond adhesivo tisular&nbsp;</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Extractor de microelectrodos</td><td>Sutter Instruments</td><td>&nbsp; Modelo P-97&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200B</td><td></td></tr><tr><td>Head</td><td>stage Molecular Devices</td><td>CV203BU</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador motorizado&nbsp; &nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Tygon tubing</td><td>Fisher</td><td>14-169-1B</td><td>ID 1/16 IN, OD 1/8 IN y WALL 1/32 IN (tubo de laboratorio flexible)</td></tr><tr><td>Portaelectrodos</td><td>Molecular Devices</td><td>1-HC-U</td><td></td></tr><tr><td>Pharmaseal Llaves de paso de tres vías&nbsp;</td><td>Baxter</td><td>K75</td><td></td></tr><tr><td>Digitalizador</td><td>Axon Instruments</td><td>Digidata 1440A</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td>Axioskop2 FS plus</td><td></td></tr><tr><td>40X/0.80W Achroplan objetivo</td><td>Zeiss Software de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>adquisición y análisis de datos&nbsp;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>PClamp 10 - Clampex y Clampfit&nbsp;</td></tr><tr><td>Extractor de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modelo P-97</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td colspan="4">Soluciones de disección y grabación (en mM)</td></tr><tr><td>Todas las soluciones, excepto la intracelular, son estables durante ~2-3 meses cuando se filtran (tazas de filtro de 0,22 mm) y se almacenan a temperatura ambiente (RT).</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>La solución intracelular se filtra (filtros de jeringa de 0,2 mm) y se almacena congelada (-20 &deg; C) en pequeñas alícuotas que se descongelan individualmente el día de su uso.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disección/Timbre' s solución</td><td></td><td></td><td>145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2,2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (con NaOH)</td></tr><tr><td>Pipeta (intracelular) solución</td><td></td><td></td> de registro <td>135 KCl, 10 EGTA-ácido, 10 HEPES; pH 7,4 (con KOH).</td></tr><tr><td>Baño (extracelular) de solución de registro/voltaje y pinza amperimétrica</td><td></td><td></td><td>125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (con NaOH).</td></tr><tr><td>Alexa-594 solución de stock de sal de hidracina.</td><td></td><td></td><td>Prepare un stock de 13,2 mM en ddH2O, alícuota (~100 &micro; l) y almacenar a -20 &deg;C. Para su uso, diluya la solución madre 132 veces con la solución de pipeta hasta una concentración final de 100 mM. Después de la dilución, filtre la solución de pipeta que contiene Alexa-594 &nbsp; con un filtro de tubo de centrífuga.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Agentes inmovilizadores</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.4% de etil, 3-aminobenzoato, sal de metanosulfonato (Tricaine)</td><td></td><td></td><td>Prepare una solución madre al 0,4% en 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricaína/100 mL 0,2 M Tris</td></tr><tr><td colspan="4">Ajuste el pH a 7 con NaOH y almacene a -20 °C.</td></tr><tr><td colspan="4">Para su uso, diluya la solución madre ~25 veces en medios embrionarios</td></tr><tr><td>250 mM &alpha;-bungarotoxina</td><td></td><td></td><td>Prepare un caldo de 250 mM en ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 &micro; L alícuotas, y sotre a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Para su uso, diluir 2.500 veces con solución extracelular hasta una concentración final de 100 nM.</td></tr><tr><td>1 mM Tetrodotoxina</td><td></td><td></td><td>Prepare un caldo de 1 mM en ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 &micro; L alícuotas, y sotre a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td colspan="4">Para su uso, diluir 2.000 veces con solución extracelular hasta una concentración final de 500 nM.</td></tr></tbody></table>

el pez cebra<em&gt; in situ</em&gt; médula espinal preparación para registros electrofisiológicos de spinal sensory y neuronas motoras

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

El pez cebra, introducido por primera vez como un modelo de desarrollo, han ganado popularidad en muchos otros campos. La facilidad de la cría de un gran número de organismos que se desarrollan rápidamente, combinada con la claridad óptica embrionario, sirvió como atributos de peso iniciales de este modelo. Durante las últimas dos décadas, el éxito de este modelo ha sido impulsado además por su susceptibilidad a las pantallas de mutagénesis a gran escala y por la facilidad de transgénesis. Más recientemente, los enfoques de edición gen haber aumentado la potencia del modelo. Para los estudios del desarrollo neurológico, el embrión de pez cebra y larva proporcionan un modelo al que se pueden aplicar varios métodos. Aquí, nos centramos en los métodos que permiten el estudio de una propiedad esencial de las neuronas, excitabilidad eléctrica. Nuestra preparación para el estudio electrofisiológico de neuronas de la médula de pez cebra implica el uso de pegamento veterinario de sutura para asegurar la preparación de una cámara de registro. Los métodos alternativos para la grabacióna partir de embriones de pez cebra y larvas implicar la unión de la preparación a la cámara utilizando un alfiler fino de tungsteno 1, 2, 3, 4, 5. Un pasador de tungsteno es la más utilizada para montar la preparación en una orientación lateral, aunque se ha usado para montar larvas dorsal del lado hasta 4. El pegamento de sutura se ha usado para montar embriones y larvas en ambas orientaciones. Usando el pegamento, una disección mínima se puede realizar, permitiendo el acceso a las neuronas espinales sin el uso de un tratamiento enzimático, evitando así cualquier daño resultante. Sin embargo, para las larvas, es necesario aplicar un tratamiento enzimático breve para eliminar el tejido muscular que rodea la médula espinal. Los métodos descritos aquí se han utilizado para estudiar las propiedades eléctricas intrínsecas de las neuronas motoras, interneuronas, y las neuronas sensoriales en varios developmental etapas 6, 7, 8, 9.

Hemos registrado con éxito de las neuronas Rohon-barba en 17 hpf embriones a través de 7 dpf larvas (Figura 5A y 5B). Cuando se registraron células Rohon-barba, la preparación se monta en el lado dorsal hacia arriba. Dicho montaje permite la identificación inequívoca de células Rohon-Barba sobre la base de sus posiciones dorsal superficial y grandes tamaños soma. La identificación se confirmó adicionalmente por el potencial de membrana en reposo hiperpol...

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

El objetivo general de esta preparación es permitir el estudio electrofisiológico de neuronas espinales de pez cebra en situ durante las etapas embrionarias y larvarias. Los análisis electrofisiológicos complementan los potentes enfoques genéticos y de imagen que también son posibles con el modelo de pez cebra. Aunque el método fue desarrollado originalmente para estudiar neuronas de rohon beard, hemos adaptado fácilmente el enfoque con el tiempo y ahora podemos estudiar varios tipos de neuronas espinales.La doctora Rosa Moreno, asociada de investigación, con quien he tenido el placer de colaborar durante muchos años, demostrará el procedimiento. Para comenzar este procedimiento, retire la bombilla negra de un orificio de vidrio y sustitúyala por un adaptador de goma blanco procedente de otro orificio de vidrio. A continuación, corte un trozo de tubo flexible a una longitud de aproximadamente 38 centímetros.A continuación, conecte el tubo flexible mediante un pequeño adaptador recto de polipropileno. Para preparar el elastómero de silicona, agregue la base y el agente de curado a un tubo cónico de plástico en una proporción de cuatro a uno. Posteriormente, mezcle bien la base del elastómero y el agente de curado.Vierta la mezcla en dos placas de Petri de 100 milímetros, hasta una profundidad de aproximadamente un milímetro en una placa de Petri y de aproximadamente 2,5 milímetros en la otra. Deje que el elastómero de silicona se cure mediante exposición al aire durante cuatro a cinco días. Si se necesita el elastómero curado antes, incúbelo a 60 grados Celsius.Posteriormente, recorte un rectángulo de 3,8 centímetros por 6,3 centímetros del elastómero curado de un milímetro de espesor para utilizarlo como la base de la cámara. Del silicona curada de 2,5 milímetros de espesor, corte un rectángulo de 3,8 centímetros por 6,3 centímetros. Luego, de este último, recorte un rectángulo interno de 2,5 centímetros por cinco centímetros para generar un marco para la parte superior de la cámara.Para preparar la cámara de disección, coloque el rectángulo delgado de silicona directamente encima del portaobjetos, asegurándose de eliminar cualquier burbuja de aire entre la silicona y el vidrio. Luego, coloque el marco rectangular de silicona encima de la capa inferior delgada de silicona. En este procedimiento, coloque un embrión en una cámara de disección que contenga de dos a tres mililitros de solución de Ringer.Inmovilice el embrión añadiendo 100 microlitros de solución de tricaina al 0,4 % a la cámara. Luego, prepare algunas micropipetas de inyección con puntas largas y delgadas a partir de vidrio de pared delgada utilizando un tirador de micropipetas. Fije una micropipeta de vidrio estirada al fondo de vidrio del dispensador de pegamento.Bajo el microscopio estereoscópico, use pinzas para romper la punta de la micropipeta de vidrio, obteniendo una punta de aproximadamente 75 micrómetros de diámetro. A continuación, cargue la micropipeta de vidrio con tres a cinco microlitros de pegamento aplicando succión a través de la boquilla. Acérquese con la punta cargada de pegamento a la cámara de disección.Luego acerque la punta de la micropipeta cargada con pegamento cerca de la cabeza del embrión, manteniendo una ligera presión positiva en la micropipeta mediante el tubo bucal. Una vez que la punta esté cerca de la cabeza del embrión, aplique suficiente presión positiva para expulsar una pequeña gota de pegamento en el fondo de la cámara. Utilice una aguja de disección para mover el embrión hacia la gota de pegamento de modo que la cabeza haga contacto con el pegamento.Oriente el embrión con el lado dorsal hacia arriba y presione la cabeza para asegurar un buen contacto con el pegamento. A medida que el pegamento se endurece lentamente, use la aguja de disección para reposicionar el embrión de modo que quede con el lado ventral hacia abajo y el lado dorsal hacia arriba. Sumerja la aguja de disección en la gota de pegamento y arrastre algunos hilos del pegamento sobre y a través de la cabeza del embrión para asegurar aún más su posición.Una vez que la cabeza esté firmemente adherida al silicona y el pegamento haya solidificado, sacrifique el embrión mediante una transección a nivel del encéfalo posterior con otra micropipeta de vidrio. Utilice una micropipeta de vidrio nueva para realizar varios cortes superficiales en la piel en una posición caudal al encéfalo posterior. Perfore superficialmente la piel moviendo la pipeta perpendicularmente al eje rostrocaudal en cada lado del tronco para especímenes montados dorsalmente, o en el lado expuesto del tronco para especímenes montados lateralmente.Para crear un colgajo de piel que las pinzas puedan agarrar, raspe la piel varias veces con la micropipeta, a la altura del corte inicial y perpendicularmente a este. Con ayuda de las pinzas, levante gradualmente el colgajo de piel y tire de la piel en dirección caudal. A continuación, coloque una pequeña gota de pegamento cerca de la cola del embrión.Utilice este pegamento para fijar la cola a la parte inferior de la cámara de disección. Mientras el pegamento se endurece, ajuste la posición del tronco con la aguja de disección para asegurarse de que el tronco permanezca orientado dorsalmente y de que esté firmemente adherido a la cámara. Tras esta disección inicial, enjuague extensamente la preparación con solución de Ringer para eliminar la tricaina y los restos, y deje reposar la preparación durante cinco minutos.A continuación, sustituya la solución de disección por solución extracelular para grabación. Si es necesario, agregue un agente inmovilizante a la preparación. Luego, transfiera la cámara de disección con el embrión montado a la platina de un microscopio compuesto vertical, equipado con un objetivo de inmersión en agua de 40 X y larga distancia de trabajo.Luego monte un capilar vacío de vidrio de paredes gruesas de silicato en el porta-electrodos de la etapa de cabezal. Conecte un tubo en un extremo a la salida de aire del porta-electrodos y en el otro extremo a una llave de paso de tres vías. A continuación, coloque una boquilla en un extremo de otro tramo de tubo y conéctelo a la llave de paso de tres vías en el otro extremo.Posteriormente, lleve la punta de la micropipeta a la porción más dorsal de la médula espinal y perfore suavemente las meninges. A continuación, realice movimientos rápidos y cortos de lado para aflojar las meninges. Una vez que la punta de la micropipeta haya atravesado las meninges, avance y eleve la micropipeta para separar las meninges de la médula espinal.Posteriormente, mueva el micropipeta en dirección rostral avanzando sobre uno o dos hemisegmentos para exponer las células de la barba de Rohon. Según nuestra experiencia, las neuronas de la barba de Rohon son más frágiles que otras neuronas espinales. Para mantenerlas sanas, exponemos una o dos barbas de Rohon a la vez.Se obtuvieron grabaciones en condición de voltaje constante de corrientes salientes y entrantes a partir de las neuronas de Rohon-Beard en embriones y larvas de uno, dos y siete días post-fecundación. El potencial de sostenimiento fue de 80 milivoltios, y las corrientes se indujeron mediante un paso despolarizante a +20 milivoltios. En modo de condición de corriente constante, la inyección de una corriente de 0,35 nanoamperios durante un milisegundo induce un potencial de acción único en las neuronas de Rohon-Beard tanto en embriones como en larvas.En ausencia de estimulación eléctrica, las neuronas de la barba de Rohon no presentan actividad de disparo espontáneo. El potencial de reposo de las neuronas de la barba de Rohon se vuelve progresivamente más negativo a medida que avanza el desarrollo. Una vez dominado este método, los embriones pueden montarse y disecarse para exponer las barbas de Rohon en menos de 10 minutos.Como se mencionó en el protocolo, es importante comprender los factores que determinan qué tan rápidamente se endurece el pegamento. Este video destaca los pasos críticos para realizar grabaciones de neuronas espinales en pez cebra.

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