Inmunoprecipitación de cromatina

Inmunoprecipitación de cromatina, o "ChIP", es una técnica utilizada por los investigadores para evaluar las interacciones DNA proteína. Factores proteicos desempeñan papeles importantes en la regulación génica; no sólo organizan ADN en los cromosomas, pero también se unen a secuencias específicas de ADN, llamados sitios regulatorios — para activar o reprimir la expresión. Durante ChIP, cromatina, que consiste en DNA y sus proteínas asociadas, es "immunoprecipitated," lo que significa que está aislado mediante el uso de anticuerpos. Con este método, los investigadores pueden evaluar qué proteínas se asocian con que secuencias de ADN.

En este video repasamos modificaciones de la cromatina y su papel en la regulación epigenética, y cómo ChIP puede analizar estas modificaciones. Luego describen un procedimiento generalizado para esta técnica y finalmente discutir cómo los científicos están utilizando ChIP de investigación hoy.

Vamos a empezar revisando Cuáles son modificaciones de la cromatina y cómo estudiar con ChIP.

En eucariotas, el ADN se almacena en núcleos por ser "envuelto" alrededor de los complejos. Estas proteínas son las histonas, y cada histona envueltas de ADN complejo se conoce como un "nucleosoma." Expresión génica está regulada por la "ocupación de nucleosoma", o si un estiramiento de la DNA se embala en los nucleosomas. Transcrito ADN tiende a localizarse en regiones "nucleosoma-libre", que permiten proteínas asociar con los sitios reglamentarios de un gen y permitan la RNA polimerasa para llevar a cabo la transcripción.

La evidencia actual sugiere que cambios en la estructura de la cromatina que regulan la expresión de genes están mediadas por modificaciones químicas a las histonas, generalmente en su "cola" libremente móvil. Las más comunes son acetil metil y grupos fosfato que se agregan o quitan de aminoácidos específicos, y se observan estas modificaciones de las histonas diferentes para ser asociado a diferentes niveles o modos de la expresión génica.

Por ejemplo, la adición de tres grupos metilo a los residuos de lisina 27 en la subunidad de la histona H3 — una modificación denominada H3K27me3, ha estado vinculada al silenciamiento génico. Por otra parte, la modificación de H3K9ac, donde un grupo del acetilo se agrega el residuo de lisina 9 en la histona H3, se ha asociado con la activación del gen.

Modificaciones de las histonas se presumen para desempeñar un papel en la regulación epigenética de la expresión génica, marcando regiones de la cromatina como "activo" o "silenciosa". Un mecanismo por que histona modificaciones se creen que ejercen sus efectos es contratar factores de transcripción o "remodelar" las enzimas, que mover físicamente las posiciones de los nucleosomas de la cromatina.

Con ChIP, modificaciones específicas de histonas pueden ser objetivo de los anticuerpos, que se pueden "tirar" junto con el ADN circundante. Los investigadores entonces pueden utilizar la PCR, microarrays, o secuenciación para identificar las regiones de ADN asociado con modificaciones de las histonas de interés. Variando los anticuerpos utilizados durante el ChIP, esta técnica también puede ayudar a identificar regiones de DNA limitadas por factores de transcripción y otras proteínas reguladoras.

Ahora que conoces los principios del ChIP, vamos a ir a través de un procedimiento generalizado para esta técnica.

Para empezar, las células de interés son recogidas y tratadas con productos químicos como el formaldehído, que actúan como "cross-linking" reactivos y ayudar a fijar las proteínas a las secuencias de ADN que asocian al facilitar la formación de enlaces covalentes entre ellos. Debe tener cuidado para no "sobre"de tratar las células con formaldehído, como esto puede afectar la capacidad de los anticuerpos para reconocer sus modificaciones de las histonas objetivo en etapas posteriores de la viruta. Para detener el proceso de cross-linking, glicina es añadida a la solución de formaldehído con la cual se reciben las células. Las células son luego recogidas y lisis para liberar la cromatina.

Para solubilizar la cromatina y definir con precisión las regiones de ADN asocian con histonas modificadas, la cromatina es mecánicamente "cortada" en trozos pequeños usando ondas de sonido, un proceso llamado sonicación. Por lo general, los científicos pretenden crear cromatina fragmentos 200 a 1000 pares de bases en longitud. Una vez que se generan fragmentos de cromatina de tamaño deseado, se añade un anticuerpo a la solución, y la mezcla se incuba para darle tiempo al anticuerpo para reconocer su modificación de histonas de destino.

Bolas magnéticas a las que pueden atar los anticuerpos entonces se introducen en la mezcla, inmovilización de los complejos de la cromatina asociada a anticuerpos. Los granos se recogen mediante el uso de bastidores magnéticos y lavaron varias veces para enjuagar cualquier cromatina independiente o anticuerpos.

Para liberar la cromatina de ellos, los granos se colocan en una solución que contiene el detergente SDS, y después de recoger los granos con un imán, el sobrenadante se mantiene. La proteinasa K de la enzima entonces se añade a esta solución para degradar las proteínas, como las histonas, por lo que el componente ADN de la cromatina puede ser aislado. El ADN resultante es luego purificado y analizado.

Ahora echemos un vistazo a cómo los científicos están actualmente utilizando ChIP en sus laboratorios.

Muchos investigadores usan ChIP para evaluar cambios en modificaciones de las histonas por señales extracelulares. Aquí, las células humanas cultivadas fueron tratadas con una citoquina específica, o molécula de señalización, y se evaluaron los cambios en la metilación de histonas. Ensayando el ChIP de DNA con PCR en tiempo real, los investigadores determinaron que, en respuesta al tratamiento, el gene de codificación por el factor de transcripción IRF1 obtuvo una marca de histona activa, H3K36me3. Esta modificación permitió una proteína reguladora y la ARN polimerasa II a asociar IRF1, dando por resultado su transcripción.

ChIP también puede utilizarse para profundizar en los cambios en la expresión génica que ocurren durante la regeneración y la lesión del tejido. En este experimento, los investigadores dañan un componente del sistema nervioso periférico en ratones, el nervio ciático y luego utilizar ChIP para buscar nuevas interacciones DNA proteína en otras estructuras del sistema nervioso periférico, como los ganglios que flanquean la médula espinal. Los científicos concluyeron que sigue lesión del nervio, la proteína p53, que es un regulador de la reparación del ADN, se asoció con un gen implicado en la regeneración de los tejidos, GAP43.

Finalmente, algunos científicos están trabajando para racionalizar procedimientos del ChIP para aumentar el rendimiento y la eficiencia de los experimentos. Aquí, los investigadores fueron capaces de "automatizar" el ChIP, tener una máquina de realizar muchos de los pasos en el protocolo. Esto permitió a los investigadores evaluar simultáneamente ADN asociado con varias modificaciones de las histonas diferentes, usando un número relativamente pequeño de células — 10.000, arrojando resultados similares a ésos considerados con un mayor número de células, o con técnicas de ChIP estándar, "manuales".

Sólo has visto video de Zeus en la inmunoprecipitación de la cromatina. En este video, hemos analizado cómo el ADN y las proteínas forman cromatina y los pasos de un protocolo, llaman ChIP, que puede usarse para identificar secuencias de ADN asociadas con proteínas o Estados específicos de la cromatina. También exploramos cómo investigadores están usando y modificando ChIP para entender mejor el papel de las interacciones DNA proteína durante la regulación de los genes. ¡Como siempre, gracias por ver!