Name: In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 48 s
Description: Aprende a evaluar la capacidad supresora de subpoblaciones de células T, B y mieloides en trasplante mediante ensayos in vitro e in vivo en ratas. Este protocolo permite estudiar la inducción de tolerancia inmunológica.

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Este trabajo fue realizado en el contexto del proyecto Labex IGO (n ° ANR-11-LABX-0016-01) que es parte del programa de gobierno francés "Investissements Avenir" administrado por la ANR (ANR-11-LABX-0016-01) y por el proyecto IHU-Cesti financiado también por el " Programa de gobierno francés investissements Avenir", gestionado por la Agencia de investigación nacional de francés (ANR) (ANR-10-IBHU-005). El proyecto IHU-Cesti es apoyado también por Nantes Métropole y Région Pays de la Loire.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Transferencia adoptiva de esplenocitos totales en un destinatario recién injertado es una manera eficiente de detectar la presencia de células reguladoras inducidas o potenciada por un tratamiento. Linfopenia transitoria inducida por la irradiación de host promueve supervivencia de la célula después de la transferencia y establecimiento de la tolerancia. Por otra parte, el letal irradiación deja tiempo para las células con propiedades tolerogénicas para convertir a las nuevas células reguladoras durante la reconstitución...

Aloinjerto cardiaco de rata es un modelo de trasplante de órgano confiable para evaluar tratamientos de inducción de tolerancia, para descifrar los mecanismos de inducción de la tolerancia y el mantenimiento y tiene el potencial para inducir las células reguladoras funcionalmente competentes y dominantes. Los protocolos a continuación describen un completamente desajuste heterotópico cardíaco injerto de una rata de donantes de 1W de Lewis (LEW.1W, RT1u) en una rata de receptores 1A de Lewis (LEW.1A, RT1una). En esta combinación de injerto, el rechazo agudo se produce rápidamente (en cerca de 7 días) y puede evaluarse fácilmente por injerto a medida a través de la palpación del abdomen. Aquí proponemos tres protocolos para inducir la tolerancia para el aloinjerto cardiaco de rata. En estos modelos, tolerancia es inducida o mantenida por tipos de células reguladoras diferentes. En primer lugar, el bloqueo de la interacción CD40-CD40L con un adenovirus codificación CD40Ig (AdCD40Ig) inducida por la generación de CD8+ Tregs capaces de inducir tolerancia cuando eventualmente transferido a recipientes injertada secundaria1. Además, el agotamiento de CD8 células+ (con anticuerpos anti-CD8α) en los receptores tratados con AdCD40Ig generados Bregs y RegMCs2. Análisis profundo de CD8+ Tregs propiedades destacan el papel clave de varias moléculas inmunoreguladoras definidas como interleucina-34 (IL-34) y Fibroleukin-2 (FGL-2)3,4,5,6 . Mientras que la sobreexpresión de IL-34 (con un vector AAV) inducida por Tregs a través de la generación de RegMCs, la sobreexpresión de FGL-2 inducida por Bregs, subyacente a la compleja red de células reguladoras.
Porque rechazo crónico se desarrolla lentamente y es a largo plazo, un análisis en profundidad es necesaria para distinguir la tolerancia frente a rechazo crónico. Injerto generalmente se evalúa por la infiltración celular, fibrosis, engrosamiento de la deposición de C4d vascular de la pared y complemento por immunohistology7. Mientras que la histología métodos requieren el sacrificio de animales o biopsia de injerto, aquí describimos un método simple para evaluar diversas características de aloinjerto tolerado: la aparición y función de las células reguladoras y las respuestas de anticuerpos específicos anti-donantes de sangre muestra mediante citometría de flujo (aquí hemos utilizado celular activado por fluorescencia (FACS) de clasificación).
Mantenimiento de la tolerancia a los aloinjertos tras detención del tratamiento es generalmente asociado con la inducción de células reguladoras8. En las últimas décadas, los estudios se centraron en CD4+Tregs caracterizado por unanimidad ellos por los principales marcadores Foxp3+,altade CD25 y CD127–9,10,11. Del mismo modo, varios marcadores fueron atribuidos a CD8+ Tregs, como CD122+, CD28-, CD45RCbaja, PD1+y Helios+ 1,12,13,14 , 15 , 16 , 17. sobre los años, la expresión de GITR, CTLA4 y citocinas (IL-10, TGFβ, IL-34, 35 IL, FGL-2) se asocian además a un Treg perfil3,4,6,13, 18,19,20,21. Sin embargo, nuevas poblaciones de células reguladoras, como Bregs, RegMCs, NKTregs, carecen de marcadores específicos pertinentes. De hecho, Bregs divulgan sobre todo como inmaduros CD24+ de las células, con la expresión ambigua de CD27 y a veces la producción de IL-10 y TGFβ granzima B22,23,24. La complejidad del linaje celular mieloide requiere una combinación de varios marcadores para definir su perfil regulatorio o proinflamatorias tales como el CD14, CD16, CD80, CD86, CD40, CD209a o CD16325,26. Por último, se han divulgado algunos marcadores para identificar NKTregs como CD11b+, CD27+, TGFβ+, pero más estudios son necesarios más fenotípicamente describirlos27,28,29 ,30,31,32. Por lo tanto, se requieren evidencias de actividad supresora legitimar aún más la descripción fenotípica para la identificación de nuevos biomarcadores, nuevos mediadores inmunoreguladoras y ampliar el alcance a nuevas terapias con células madre.
Proponemos dos métodos complementarios para evaluar la actividad supresora de las células. En primer lugar, el método en vitro consta de prevencion células con células de etiqueta efectoras T estimuladas por antígenos alogénicos de donante que presenta las células (APCs) en diferentes proporciones durante 6 días de cultivo, y analizando el efector proliferación de la célula de T que refleja supresión inmune dirigida por el donante. Las células procedentes de ratas tratadas pueden compararse directamente a las células ingenuas ratas y ratas injertadas no tratadas para la actividad represiva (o a cualquier otra población de células reguladoras), en una gama de cocientes del supresor: efector. Además, este método no requiere ningún trasplante, y se obtienen resultados dentro de 6 días. En segundo lugar, el método en vivo consiste en transferir las células reguladoras previstas de una rata tratada a un destinatario injertado recién irradiado. Mientras que las células B, células mieloides o T las células de las ratas no tratadas ingenuo generalmente no para inhibir el rechazo agudo y prolongar la supervivencia del injerto a transferencia adoptiva, las células con actividad supresora potenciada de receptores tratados tienen estos atributos 1,2,3,4,33. Linfopenia inducida por la irradiación del destinatario se recomienda permitir eventualmente transferidas células siguen siendo inafectadas por la homeostasis de la sangre y dominar más fácilmente las respuestas inmunes de los donantes. Para ambos métodos, la utilización en vitro de allogeneic de terceros APC o en vivo la transferencia adoptiva de prevencion las células en los receptores injertados con un corazón de terceros permiten análisis de la especificidad de los donante. Considerando que el método en vivo requiere un número considerable de células, poco representado las subpoblaciones de células pueden evaluarse más fácilmente actividad supresora en vitro33.
Respuesta humoral también puede ser medido para evaluar el estado de la tolerancia y el control de las respuestas de anticuerpos dirigidos a los antígenos del donante. De hecho, la tolerancia se caracteriza por la ausencia de la respuesta humoral hacia el donante sino la conservación de la capacidad de los beneficiarios a desarrollar la respuesta humoral a antígenos nuevos y preservación de las respuestas de memoria. En primer lugar, el principio de la detección del aloanticuerpo se basa en el reconocimiento de las células del donante por receptores anticuerpos tras incubación del tipo de la célula donante con el suero del receptor injertado. Segunda respuestas humorales a antígenos exógenos pueden ser evaluados después del estímulo de receptores tolerantes a largo plazo con hemocianina de Lapa de ojo de la cerradura (KLH) emulsionado con completa adyuvante de Freund de. La presencia de anticuerpos IgM e IgG específicos contra los antígenos puede detectarse los días 4 y 13, respectivamente, después de la inmunización, con ensayo de inmunosorbente vinculado enzima (ELISA)34. En tercer lugar, la preservación de la respuesta inmune de memoria puede ser evaluada por la inyección de xenogeneicos de glóbulos rojos (gr) a -7 y + 3 días del trasplante y la tinción con destinatario suero de recolectadas en días + 8 y + 17 después del trasplante de glóbulos rojos. Todos estos métodos permiten la identificación de subtipos de inmunoglobulinas mediante anticuerpos específicos de la secundarios y adquisición rápida de los resultados en menos de 1,5 h por la FACS coloración o unas horas por ELISA.
Finalmente, estos protocolos están diseñados para la caracterización de los modelos de trasplante y pueden ser, en cierta medida, aplicada a los modelos de enfermedad autoinmune. Los principios del método pueden transponerse a todas las especies.

<table><tbody><tr><td><animales fuertes></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEW.1W y LEW.1A ratas</td><td>Janvier Labs, Francia</td><td></td><td>8 semanas de edad,&nbsp;</td></tr><tr><td>Ratas donantes de terceros BN</td><td>Janvier Labs, Francia</td><td></td><td>de 8 semanas de edad,&nbsp;</td></tr><tr><td>name</td><td>company</td><td>número de catálogo</td><td>comments</strong</td></tr><tr><td>>reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AdCD40Ig</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francia</td><td></td><td>plásmidos caseros</td></tr><tr><td>IL34-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francia</td><td></td><td>plásmidos caseros</td></tr><tr><td>FGL2-AAV</td><td>Viral Vector Core, INSERM UMR 1089, Nantes, Francia</td><td></td><td>plásmidos caseros</td></tr><tr><td>anti-TCRab</td><td>Hibridoma de la Colección Europea de Cultivo Celular, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon R7/3</td><td>Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>anti-CD25</td><td>Hibridoma de la Colección Europea de Cultivo Celular, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon</td> <td>OX39Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>hibridoma anti-CD8</td><td>de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon OX8</td><td>Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>anti-CD45RA</td><td>Hibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon OX33 Cultivo</td><td>casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>anti-CD161</td><td>Hibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon 3.2.3 Cultivo</td><td>casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>hibridoma anti-CD11b/c</td><td>de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon OX42</td><td>Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluoróforos</td></tr><tr><td>anti-TCRgd</td><td>Hibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon</td> <td>V65Cultivo, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>casero anti-CD45RC</td><td>Hibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon OX22</td><td>Cultivo casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>anti-CD4</td><td>Hibridoma de la Colección Europea de Cultivos Celulares, Salisbury, Reino Unido</td><td>Clon OX35 Cultivo</td><td>casero, purificación y acoplamiento de fluororóforos</td></tr><tr><td>anti-CD45R</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#554881, clon</td><td></td>de His24</tr><tr><td>IgG-FITC anti-ratas</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, EE. UU.</td><td>#112-096-071</td><td></td></tr><tr><td>IgG1 anti-ratas</td><td>Serotec</td><td>#MCA 194</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a anti-ratas</td><td>Serotec</td><td>#MCA 278</td><td></td></tr><tr><td>IgG2b anti-ratas</td><td>Serotec</td><td>#MCA 195</td><td></td></tr><tr><td>IgM-FITC</td> <td>anti-ratasJackson ImmunoResearch Laboratories, INC, Baltimore, EE. UU.</td> <td># 115-095-164</td><td></td></tr><tr><td>estreptavidina HRP</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td> <td># 554066</td><td></td></tr><tr><td>KLH</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, EE. UU.</td> <td># 9013-72-3</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>Thermo Fisher &nbsp; Scientific Inc, EE. UU</td><td></td><td>. Solución tampón de fosfato sin calcio y magnesio,&nbsp;</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, Saint-Louis, EE. UU.</td><td>#9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos de sustrato TMB</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#555214</td><td></td></tr><tr><td>CellTraceTM Kit de proliferación celular CFSE</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EE. UU</td><td></td><td></td></tr>.#C34554 <tr><td>RPMI 1640 medio 1X</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EE. UU.</td> <td># 31870-025</td><td></td></tr><tr><td>estreptomicina penicilina</td><td>Thermo Fisher &nbsp; Scientific Inc, EE. UU.</td> <td># 15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tampón Hepes</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, USA</td><td>#15630-056</td><td></td></tr><tr><td>aminoácidos no esenciales</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, EE. UU.</td> <td># 11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Thermo Fisher &nbsp; Scientific Inc, EE. UU.</td> <td># 11360-039</td><td></td></tr><tr><td>2 beta mercaptoetanol</td><td>Sigma, Saint-Louis, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr> #M3148 <tr><td>Tinte de proliferación celular eFluor & reg; 450 Cell</td><td>Thermo Fisher &nbsp; Scientific Inc, EE. UU.</td> <td># 65-0842-85</td><td></td></tr><tr><td>Glutamina</td><td>Sigma, Saint-Louis, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr> #G3126 <tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher &nbsp; Scientific Inc, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr>#D1306 <tr><td>Colagenasa D</td><td>Roche Diagnostics, Alemania</td><td>#11088882001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma, Saint-Louis, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr>#E5134 <tr><td>NaCl 0.9%</td><td>Fresenius Kabi</td><td>#B230561</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads magnéticos</td><td>Dynal, Invitrogen</td><td>#11033</td><td>Cabra anti-ratón IgG</td></tr><tr><td>One Comp eBeads</td><td>Ebiosciences, San Diego, EE. UU.</td><td>#01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Consulte las directrices</td><td></td><td></td>institucionales</tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Consulte las directrices</td><td></td><td></td>institucionales</tr><tr><td>Naplbuphine</td><td>Consulte las directrices</td><td></td><td></td>institucionales</tr><tr><td>Terramicina</td><td>Consulte las directrices institucionales</td> Buprenorfina Consulte las directrices <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>institucionales Directrices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Meloxicam</td><td>Consultar las directrices</td><td></td><td></td>institucionales</tr><tr><td>Completar el adyuvante</td><td></td><td></td><td></td>de Freund</tr><tr><td>Rompun</td><td>Consultar las directrices</td><td></td><td></td>institucionales</tr><tr><td>Ringer lactato</td><td>Consultar las directrices institucionales</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Consultar las directrices institucionales</td><td></td><td></td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de <td>lisis de glóbulos rojos</td><td>Diluir 8,29 g de NH4Cl (Sigma, Saint-Louis, EE. UU. A-9434), 1 g de KHCO3 (Prolabo 26 733.292) y 37,2 mg de EDTA (Sigma, Saint-Louis, EE. UU. E5134) en 800 ml de H2O. Ajuste el pH a 7.2-7.4 y complete a 1L con H2O.</td></tr><tr><td>Colagenasa D</td><td></td><td></td><td>Diluida 1g colagenasa en 500 ml RPMI-1640 + 5 ml Hepes + 2% FCS</td></tr><tr><td>PBS-FCS (2%)-EDTA (0,5%)</td><td></td><td></td><td>Añadir 5 mL de EDTA 0,1M (Sigma, Saint-Louis, USA E5134) y 20ml de FCS a 1ml de PBS 1X</td></tr><tr><td>CFSE (Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit Invitrogen)</td><td></td><td></td><td>Diluir 50&micro; g (=1 vial) de CFDA SE (componente A) en 90&mu; l Solución DMSO (componente B) para obtener una solución madre de 10 mM. A continuación, diluir la solución madre a 1/20 000 en PBS 1X para obtener un 0,5&mu; M solución</td></tr><tr><td>completa de medio para cocultivo</td><td></td><td></td><td>500 ml de medio completo RPMI-1640 con 5 ml de Penicilina (80 unidades/ml)-Steptomycin (80 mg/ml), 5 ml de L-Glutamina, 5 ml de Aminoácidos No Esenciales (100X), 5 ml de Piruvato Sódico (100 mM), 5 ml de tampón HEPES (1M), 2,5 ml de mercaptometanol (7 ml de caldo de 2-bmercaptoetanol diluido en 10 ml de RPMI), 10% FCS</td></tr><<tr><td>strong>name</td><td>company</td><td>número de catálogo</td><td>comments</td></tr><tr><td>equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon 50ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#227261</td><td></td></tr><tr><td>halcón 15ml</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#188271</td><td></td></tr><tr><td>tamiz</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Platos de cultivo de plástico Corning</td><td>VWR, Pessac</td><td>#391-0439</td><td></td></tr><tr><td>100&micro; m y 60&micro; m filtros de tejido</td><td>Sefar NITEX, Heiden, Suiza</td><td>#03-100/44 y #03-60/35</td><td></td></tr><tr><td>96 pocillos Placas inferiores en U para cocultivo</td><td>&nbsp; Placa de cultivo de tejidos con fondo en U Falcon, estéril, Corning</td><td>#353077</td><td></td></tr><tr><td>Placas inferiores en V de 96 pocillos para tinción FACS</td><td>ThermoScientifique, Danemark</td><td>#249570</td><td></td></tr><tr><td>Placas ELISA de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Serengue Nunc Maxisorb</td><td></td><td></td></tr><tr><td>para trituración de bazo</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td>#309649</td><td></td></tr><tr><td>Lector de ELISA</td><td>SPARK 10M, Tecan, Suiza</td><td>SPARK 10M, Tecan, Suiza</td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>baño maría&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>irradiador de rayos X</td><td>Lincolshire, Inglaterra</td><td>Faxitron CP160</td><td></td></tr><tr><td>agitador</td><td></td><td></td><td></td>solar</tr><tr><td>FACS Canto II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Aria II</td><td>BD Biosciences, Mountain View, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>imán</td><td>Thermo Fisher&nbsp; Scientific Inc, Estados Unidos</td><td>12302D</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro e in vivo la evaluación de la actividad supresora t, b y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

In Vitro and In Vivo Assessment of T, B and Myeloid Cells Suppressive Activity and Humoral Responses from Transplant Recipients

La principal preocupación en el trasplante es lograr tolerancia específica a través de la inducción de células reguladoras. La comprensión de los mecanismos de tolerancia requiere modelos confiables. Aquí, describimos los modelos de la tolerancia al aloinjerto cardiaco de rata, inducido por el bloqueo de señales de coestimulación o upregulation de moléculas inmunorreguladoras a través de la transferencia de genes. Cada uno de estos modelos permite en vivo la generación de células reguladoras como las células T reguladoras (Tregs), las células B reguladoras (Bregs) o células mieloides reglamentarias (RegMCs). En este manuscrito, Describimos dos protocolos complementarios que se han utilizado para identificar y definir la actividad reguladora celular in vitro e in vivo para determinar su responsabilidad en la inducción de la tolerancia y mantenimiento. En primer lugar, un ensayo represivo en vitro permite la identificación rápida de las células con capacidad supresora de la respuesta inmune efectora una manera dosis dependiente y puede ser utilizado para otros análisis como medición de citocinas o citotoxicidad. En segundo lugar, la transferencia adoptiva de células desde un recipiente tratado tolerante a un destinatario injertado recién irradiado, destacó las propiedades tolerogénicas de estas células en el control de las respuestas inmunes del injerto dirigida o conversión (nuevo) las células reguladoras había llamado tolerancia infecciosa). Estos métodos no están restringidos a las células con marcadores fenotípicos conocidos y pueden ser extendidos a cualquier población de la célula. Además, donante dirigido allospecificity de células reguladoras (una meta importante en el campo) puede evaluarse mediante el uso de células de donante tercero o injerto in vitro o en vivo. Finalmente, para determinar la capacidad de tolerogénicas específicos de estas células reguladoras, le ofrecemos protocolos para evaluar las respuestas de anticuerpos humorales de anti- donantes y la capacidad del destinatario para desarrollar la respuesta humoral contra antígenos conocidos nuevo o antiguo. Los modelos de tolerancia descrito pueden ser utilizados para caracterizar las células reguladoras, para identificar nuevos biomarcadores y moléculas inmunoreguladoras y son adaptables a otros modelos de trasplante o enfermedades autoinmunes en roedores o humanos.

La evaluación de la actividad represiva tras la clasificación de la APC (figura 1), células de la respuesta y Tregs simultáneamente (figura 2), o individualmente (figura 4), y cualquier otras células reguladoras putativos (figura 3), puede ser hecho en vivo por la inyección directa de células reguladoras y en vitro por la medida del brillo de la CFSE (<...

Aquí, presentamos un protocolo para inducir tolerancia en el trasplante y evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de subconjuntos distintos de la célula del receptor y el estado inmune del receptor hacia el donante o los antígenos exógenos.

In Vitro e In Vivo la evaluación de la actividad supresora T, B y las células mieloides y las respuestas humorales de los receptores de trasplante

The main concern in transplantation is to achieve specific tolerance through induction of regulatory cells. The understanding of tolerance mechanisms ...

La inducción de tolerancia en trasplantes se asocia a menudo con la aparición de una población de células reguladoras. Ausencia de respuesta inmunitaria frente al donante, pero inmunidad conservada contra antígenos exógenos. Disponemos de diferentes protocolos para evaluar in vitro e in vivo la capacidad supresora de cualquier subconjunto de células reguladoras y el estado de las respuestas humorales del huésped.Sedue un ratón donante Lewis 1W mediante inhalación de isoflurano en O₂, suplementado con N₂O al 1% después de cinco minutos. Coloque al animal en decúbito dorsal y desinfecte el abdomen con betadina para realizar una toracotomía. Pinche la vena cava inferior y la vena cava superior, coloque ligaduras y luego córtelas.Luego, corte la arteria pulmonar y la aorta, y guarde el injerto en NaCl frío al 0,9 %. Anestesie una rata receptora Lewis 1A de 150 gramos de ocho a 12 semanas mediante inhalación de isoflurano con O2 suplementado con N2O al 1 %. Coloque al animal en decúbito dorsal y desinfecte el abdomen con betadina para realizar una laparotomía cefalopúbica. Exteriorice los intestinos, pinche los vasos sanguíneos abdominales. Realice una anastomosis lateral terminal entre

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