Name: La exposición del cerdo del SNC para el análisis histológico: Un Manual para decapitación, Apertura cráneo, cerebro y Remoción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Aprende a exponer y extraer el cerebro y la hipófisis intactos de cerdo mediante disección craneal y apertura de la duramadre. Esta técnica postmortem preserva la integridad tisular para análisis histológico.

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Los autores reconocen con gratitud la ayuda experta de la señora Trine W. Mikkelsen, la señora Lise M. de montaje, y el personal de Påskehøjgaard. El Consejo Danés de Investigación Médica, la Fundación Lundbeck, y la Fundación Novo Nordisk con el apoyo financiero del estudio.

anestesia Animal y euthanesia se realizó de acuerdo con &quot;Principios de laboratorio cuidado de los animales&quot; (NIH publicación No. 86-23, revisada 1985) y aprobada por el Consejo Danés de Ética de la Investigación Animal. 1. Instrumentos <ol><li> Recoge los instrumentos presentados en el video y que figuran en la Tabla de Materiales. </li></ol> 2. Decapitación NOTA: La anestesia se indujo mediante una inyección intramuscular de 5 ml de midazolam (5 mg / ml) y 5 ml de ketamina (25 mg / ml). 5-10 min más tarde, cuando el animal estaba profundamente sedado, una vena de la oreja y se canuló una sobredosis letal (100 mg / kg de peso corporal) de pentobarbital sódico se administra por vía intravenosa (200 mg / ml). Para asegurar que el animal fue sacrificado por completo, el reflejo de dolor interdigital se ensayó como se muestra por Ettrup et al. (2011) 20. eutanasia completa se asegura como se describe enla declaración ética arriba y seguido por una perfusión transcardial con 5 L de solución salina isotónica, como se demuestra por Ettrup et al. (2011) 20. Todos los procedimientos se realizan demostrado postmortem, evitando la necesidad de las precauciones necesarias para la anestesia de bienestar a largo plazo y la supervivencia después del procedimiento. <ol><li> Decapitar al cerdo por un alto incisión cervical circular, usando un bisturí quirúrgico, justo debajo del ángulo mandibular (Figura 1A). </li><li> Todavía con el bisturí quirúrgico, continuar la incisión anterior a través del tejido blando del cuello, incluyendo la laringe y el esófago, hasta que se alcanza la columna vertebral ósea, aproximadamente en el nivel de la unión craneocervical. </li><li> Avanzar en el corte con un bisturí quirúrgico desde el lado anterior de la unión craneocervical, por encima del arco anterior del atlas, y a través de la membrana atlantooccipital anterior, exponiendo así el canal espinal y la médula espinal (Figura 1B). Al mismo tiempo pedir a un asistente para sacar el cuerpo del cerdo lejos de la cabeza de cerdo para facilitar el acceso entre la base del cráneo y la primera vértebra cervical. </li><li> Continuar la incisión quirúrgica a través del saco dural y la médula espinal (Figura 1B). Tenga especial cuidado para asegurarse de que se logra una sección transversal completa de la médula espinal. NOTA: Si no se realiza el paso anterior puede dar lugar a la tracción no deseado en la médula espinal y el cerebro durante los siguientes pasos del proceso de decapitación. </li><li> Con fuerza extender la unión cranocervical a nivel de sección (Figura 1C). Al mismo tiempo, utilizar el bisturí quirúrgico a la sección de los ligamentos atlantooccipitales restantes para liberar la articulación entre los cóndilos del occipital y el proceso articular superior de atlas. Separar la cabeza de cerdo del cuerpo. </li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig1.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 1: Minipig decapitación. Incisión (A) del cuello (flecha, el ángulo mandibular). (B) incisión a través de los ligamentos atlantooccipitales y la médula espinal dura-rodeado (SC) en la unión craneocervical (C1, arco anterior del atlas; OC, cóndilo occipital). (C) La parte posterior de la articulación atlantooccipital es liberado por una extensión contundente (flechas) en el nivel de sección. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig1large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 3. Apertura cráneo <ol><li> Coloque la cabeza de cerdo sobre una mesa. </li><li> Haga una incisión longitudinal dorsal con un bisturí quirúrgico a través de la piel y el tejido blando subyacente de la parte posterior de la boca, sobre el vértice de la cabeza, y hacia abajo a través de la parte posterior dela región occipital. </li><li> Exponer la parte dorsal y posterior del cráneo mediante la eliminación de tejido blando situado en el lateral de la incisión inicial con un bisturí quirúrgico. </li><li> Soltar el músculo temporal bilateralmente en el cráneo (Figura 2A) con un escalpelo quirúrgico. Asegúrese de que el hueso occipital posterior se limpian de tejido blando. </li><li> Utilice la entrada posterior del foramen magnum para eliminar el hueso occipital con una Kerrison punzón y hueso rongeurs óseas y exponer el cerebelo dura-cubierta (Figura 2B). </li><li> Volver a la cara anterior expuesta del cráneo y seleccione un punto de entrada en el hueso frontal, justo en frente de los ojos. En este punto, utilizar un cincel de hueso con un martillo para penetrar en el cráneo y entrar en el seno frontal (Figura 2C). </li><li> Usar la medida del seno frontal para promover la eliminación dorsoposterior de la lámina cráneo exterior con un rongeur hueso o médula punzón y exponer el interior, delgadalámina cráneo óseo que cubre el cerebro (Figura 2D). </li><li> Abrir suavemente el interior lámina cráneo óseo en sentido anterior con un martillo y un cincel de hueso para exponer el cerebro dura-cubierta (Figura 2E). </li><li> Continuar la eliminación de hueso lateralmente usando un cincel de hueso y un rongeur hueso a través del hueso temporal y parietal a fin de liberar la parte dorsoposterior final del cráneo, situado entre las partes ya expuestas de la cerebro dura-cubierta y el cerebelo (Figura 2F). NOTA: A menudo es posible, durante el paso final de este procedimiento, para usar el cincel para romper el hueso del cráneo posterior restante de un lado, al igual que uno abre una puerta. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig2.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" /> Figura 2: Minipig abertura cráneo. (A) La exposición de la dorsoposteriosuperficie del cráneo r, incluida la eliminación de la occipital y los músculos temporales. (B) La retirada del hueso occipital (CB, cerebelo dura-cubierto; OB, hueso occipital; OC, cóndilo occipital; y SC, médula espinal). (C) un martillo y un cincel de hueso se utilizan para penetrar en el cráneo anterior y para entrar en el seno frontal en el nivel de los ojos. (D) La medida del seno frontal (FS) se utiliza para eliminar el hueso del cráneo de espesor exterior (1), la exposición de una lámina fina de hueso interior (2) que cubre el cerebro. (E) La eliminación de la lámina delgada de hueso, dejando al descubierto el cerebro dura-cubierta (flecha). (F) Por último, un martillo y un cincel de hueso se utilizan para conectar lateralmente el de las aberturas del cráneo anterior y posterior. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig2large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 4. Cerebro RemovAlabama <ol><li> El uso de fórceps quirúrgicos para levantar la duramadre y crear una incisión cerca suave para el seno sagital superior venosa usando un bisturí quirúrgico fino (Figura 3A). </li><li> Utilice micro-tijera o un cuchillo de duramadre a abrir más la duramadre que recubre la superficie dorsal del cerebro. NOTA: El cuidado especial debe ser tomado cuando la eliminación de la duramadre que corresponde a la tentorium cerebelar (Figura 3B), como la preservación de esta hoja dural evitará la extracción del cerebro posterior. </li><li> Coloque la cabeza de cerdo verticalmente (Figura 3C). </li><li> Utilice el cincel de hueso o un disector para liberar el cerebro ventroanterior mediante disección roma del bulbo olfatorio del suelo dura-cubierta de la cavidad craneal (Figura 3D). </li><li> Utilice un bisturí quirúrgico bien a la sección del quiasma óptico expuesto (Figura 3E). Exponer y la sección del tallo hipofisario y los nervios oculomotores. </li><li> Soltar el tronco cerebral ventral seccionando la LOnervios wer craneales (Figura 3F) con un bisturí quirúrgico fino. Asegúrese de que la tentorium cerebelosa dural se realizó una incisión por completo (Figura 3B), ya que esta hoja dural será lo contrario cortar a través del tronco cerebral durante el proceso de liberación. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig3.jpg" style="font-size: 14px;" /> Figura 3: la extracción del cerebro Minipig. De apertura (A) Dural con fórceps quirúrgicos y un cuchillo duramadre. (B) Se debe tener cuidado para incidir completamente la hoja dural (flecha), situada entre el cerebro y el cerebelo. (C) La cabeza de cerdo se coloca verticalmente para una mejor visualización de las estructuras de la base del cráneo y para que la gravedad ayude en el desplazamiento previsto del cerebro. (D) un disector o un cincel de hueso se usa para aliviar el bulbo olfativo por la sección romo de la dura-covered base del cráneo. (E) La disección se continúa en una dirección posterior a lo largo de la base del cráneo para la exposición y el seccionamiento del quiasma óptico (flecha), tallo infundibular, y los nervios oculomotores. (F) La liberación cerebro se completa con la sección de los nervios craneales inferiores a medida que salen de la superficie ventral del tronco cerebral (III, el nervio oculomotor; IV, nervio troclear; V, nervio trigémino; y VI, ocular externo del nervio). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig3large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 5. Eliminación de la hipófisis <ol><li> Identificar el tallo hipofisario y su hoja dural circundante (la sellae diapragma) en el suelo cráneo (Figura 4A). </li><li> Incisión en el lateral de la hoja dural al tallo hipofisario usando un bisturí quirúrgico fino (Figura 4B). </li><li> Utilice un disector para liberar el pozouitary y la saca de la fosa pituitaria (Figura 4C). </li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55511/55511fig4.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14px;" /> Figura 4: eliminación pituitaria Minipig. (A) La fosa pituitaria (*) se identifica en el suelo cráneo (1, bulbo olfatorio; 2, quiasma óptico, y PF, posterior fosa craneal). (B) La cubierta dural (diagphragm selar, (flecha)) se realiza una incisión lateralmente. (C) La pituitaria (flecha) se libera con un disector y sacó de la fosa pituitaria. Barra de escala (AC) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55511/55511fig4large.jpg" style="font-size: 14px;" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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<li>Jortner, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+return+of+the+dark+neuron.+A+histological+artifact+complicating+contemporary+neurotoxicologic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">The return of the dark neuron. A histological artifact complicating contemporary neurotoxicologic evaluation.</a> Neurotoxicology. 27, 628-634 (2006).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La mayoría de los estudios de neurociencia experimentales se llevan a cabo en las especies de animales pequeños, tales como ratones y ratas, donde el acceso al SNC se ve facilitada por una fina calavera y dural-espesor. Sin embargo, en los animales de experimentación más grandes como cerdos 1, 4, 8, ovejas 32, y primates no humanos, el espesor considerable de estas estructuras requiere el uso de instrume...

<html> Los estudios de neurociencia traslacional en cerdos se han vuelto cada vez más populares en las últimas dos décadas. El gran tamaño del cerebro de cerdo permite el uso de generadores de imágenes cerebrales clínica convencionales y el uso directo y las pruebas de los procedimientos neuroquirúrgicos y el equipo de la clínica humana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. En los últimos 20 años, cerdos, especialmente cerdos enanos (por ejemplo, Göttingen minipig), se han utilizado para examinar las modalidades de tratamiento neuromoduladores, como el trasplante de células madre; transfección vector viral; y la estimulación cerebral profunda dirigida hacia la enfermedad de Parkinson, la obesidad, la depresión y la enfermedad de Alzheimer 2, 6,= &quot;xref&quot;&gt; 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17. Esto ha sido seguido por el desarrollo de enfoques estereotáxica y quirúrgicos para manipular el cerdo enano CNS 3, 18, 19, 20, 21. Los cambios del SNC instituidos se han evaluado en animales vivos usando imágenes del cerebro (PET 10, 13, 22, 24 y MR 23), cistometría 11, 12, 25, análisis de la marcha17, la evaluación neurológica 9, 17, y el examen postmortem base de la histología y análisis estereológico 14, 15, 17, 26, 27, 31. Sin embargo, el análisis post-mortem requiere la exposición y la eliminación del cerebro de cerdo, que no es una tarea fácil, como, cráneo óseo de espesor y un dural fibrosa que cubre rodean el cerebro de cerdo. El objetivo de este documento y vídeo de instrucción es describir cómo el cerebro de cerdo postmortem y la pituitaria pueden estar expuestos y eliminados en un estado intacto en 15-20 min utilizando herramientas quirúrgicas no motorizados. El vídeo de instrucciones y las ilustraciones fotográficas muestran cerdos enanos varones (edad: 6 meses, el peso corporal: 20-25 kg) utilizados para un estudio anatómico de la glándula pituitaria cerdo enano.

<table><tbody><tr><td>Mango de bisturí pesado # 4</td><td>FST (Fine Science Tools)</td> <td>10008-13</td><td>Bueno para incisión en la piel y eliminación de tejidos</td></tr><tr><td>blandos Hojas de bisturí no estériles # 23</td><td>FST&nbsp;</td><td>10023-00</td><td></td></tr><tr><td>Mango de bisturí #7</td><td>FST&nbsp;</td><td>10007-12</td><td>Óptimo para la incisión dural y el trabajo</td></tr><tr><td>de precisión Hojas de bisturí no estériles #11</td><td>FST&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinza quirúrgica</td><td>FST&nbsp;</td><td>11024-18</td><td>La punta de las pinzas quirúrgicas asegura un agarre firme&nbsp;</td></tr><tr><td>Kerrison Bone Punch</td><td>Aesculap Neurosurgery</td><td>FF713R</td><td>Debe ser robusto, tamaño de mordida 3-5 mm</td></tr><tr><td>Bone Rongeur</td><td>Aesculap Neurosurgery</td><td>MD615</td><td>Debe ser robusto, tamaño de mordida 15 x 5 mm</td></tr><tr><td>Bone Rongeur</td><td>Aesculap Neurosurgery</td><td>FO551R</td><td>Debe ser robusto, tamaño de mordida 25 x 15 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>Cincel de hueso</td><td>Lawton</td><td>67-0335</td><td>El tamaño de la cabeza del cincel no debe exceder los 20 mm</td></tr><tr><td>Mazo (martillo)Millarco</td><td></td> <td>5624108</td><td>Peso 300 g, longitud 30 cm, tamaño del área de golpe de la cabeza 2 x 2 cm</td></tr><tr><td>Microtijera</td><td>FST&nbsp;</td><td>14002-14 y nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Disector</td><td>Aesculap Neurocirugía</td><td>OL165R</td><td></td></tr><tr><td>G&ouml; ttingen minipigs</td><td>Ellegaard G&ouml; ttingen Minipigs A/S, Dinamarca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Euthanimal</td><td></td><td></td><td>pentobarbital</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midazolam&nbsp;</td><td>Hameln Productos Farmacéuticos</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

la exposición del cerdo del snc para el análisis histológico: un manual para decapitación, apertura cráneo, cerebro y remoción

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Los cerdos se han vuelto cada vez más popular en la investigación traslacional animal grande neurociencia como un sustituto económicamente y éticamente factible primates no humanos. El tamaño del cerebro grande del cerdo permite el uso de generadores de imágenes cerebrales clínica convencionales y el uso directo y las pruebas de los procedimientos y equipos de neurocirugía de la clínica humana. Además análisis macroscópico e histológico, sin embargo, requiere la exposición postmortem del sistema de cerdo nervioso central (CNS) y la extracción del cerebro posterior. Esta no es una tarea fácil, ya que el cerdo CNS está encapsulada por una, estructura ósea del cráneo de espesor y la columna vertebral. El objetivo de este documento y vídeo de instrucción es describir cómo exponer y retirar el cerebro de cerdo postmortem y la glándula pituitaria en un estado intacto, adecuado para el análisis macroscópico e histológico posterior.

Para evitar que el material de tejido de la desecación, se recomienda para almacenar el cerebro eliminado y la hipófisis en una jarra llena de fijador o solución salina isotónica inmediatamente después que se ha realizado el análisis macroscópico. El material tejido puede ser almacenado en el fijador por año, mientras que el almacenamiento en solución salina isotónica, incluso en un refrigerador, dará lugar a la descomposición del tejido con el tiempo. <p class="jove_content" fo:keep...

El objetivo de este documento y vídeo de instrucción es describir cómo exponer y retirar el cerebro de cerdo y la glándula pituitaria postmortem en un estado intacto, adecuado para el análisis macroscópico e histológico posterior.

La exposición del cerdo del SNC para el análisis histológico: Un Manual para decapitación, Apertura cráneo, cerebro y Remoción

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

En este video, se muestra cómo exponer y extraer el cerebro de cerdo intacto y la hipófisis intacta abriendo el cráneo y la duramadre. Declaración de ética: La anestesia y eutanasia animal se realizaron de acuerdo con los "Principios para el cuidado de animales de laboratorio" y fueron aprobadas por el Consejo Danés de Ética en Investigación Animal. La anestesia se indujo en cerdos miniatura macho de la raza Gottingen mediante una inyección intramuscular de midazolam y ketamina.Cinco a diez minutos después, cuando los animales estaban profundamente sedados, se canuló una vena auricular y se administró una sobredosis letal de pentobarbital sódico por vía intravenosa. Para asegurar que los animales estaban completamente eutanasiados, se probó el reflejo de dolor interdigital como se ha mostrado previamente. Tras una eutanasia adecuada, los animales fueron perfundidos transcardíacamente con cinco litros de solución salina isotónica.Todos los procedimientos demostrados se realizan, por consiguiente, post mortem, excluyendo la necesidad de precauciones de bienestar necesarias para anestesia prolongada y supervivencia postprocedimiento. Instrumentos utilizados: mango pesado de escalpelo número cuatro y hojas de escalpelo no estériles, número 23.Adecuado para incisiones en la piel y eliminación de tejidos blandos. Mango de bisturí número siete y hojas de bisturí no estériles, número 11. Óptimo para incisiones durales y trabajos de precisión.Pinzas quirúrgicas, con una mordida que garantice un agarre firme. KAIRison Bone Punch. Debe ser resistente, con un tamaño de mordida de tres a cinco milímetros.Corredera ósea. Debe ser robusta y tener una abertura de unos cinco a 15 milímetros, para trabajos óseos delicados. Corredera ósea más grande.Con un tamaño de corte de aproximadamente 25 por 15 milímetros, para la eliminación de fragmentos óseos más gruesos. Cincel óseo. La cabeza no debe ser mayor de 20 milímetros.Un mazo, adecuado para el cincel óseo. Tijeras microquirúrgicas, con punta afilada. Disector. Decapitación. Se decapita al cerdo realizando una incisión cervical circular alta, justo por debajo del ángulo mandibular.Continúe la incisión a través del tejido blando del cuello. Corte a través de la laringe y el esófago hasta alcanzar el hueso y la columna vertebral. Aproximadamente a la altura de la unión craneocervical.Avanzar el corte desde el lado anterior de la unión craneocervical, a través de la membrana atlantooccipital anterior, mediante lo cual se expone la médula espinal. Al mismo tiempo, un asistente tirará del cuerpo del cerdo alejándolo de la cabeza, ya que esto facilitará el acceso entre la base del cráneo y la primera vértebra cervical.Asegúrese de que la médula espinal esté completamente seccionada antes de realizar una extensión enérgica en la unión craneocervical para finalizar la decapitación. Apertura del cráneo. Realice una incisión longitudinal dorsal a través de la piel y los tejidos blandos subyacentes.Desde la parte posterior del hocico, pasando por el vértice de la cabeza y bajando a través de la parte posterior de la región occipital. Exponga la parte dorsal y posterior del cráneo eliminando el tejido blando situado lateralmente a la incisión inicial. Libere el músculo temporal del cráneo.Limpie el hueso occipital posterior del tejido blando. Utilice el borde posterior del foramen magno para retirar el hueso occipital con el fin de exponer el cerebelo cubierto por la duramadre. Regrese al lado anterior del cráneo y seleccione un punto de entrada en el hueso frontal, justo por delante de los ojos.En este momento, utilice un cincel óseo para penetrar el cráneo e ingresar al seno frontal. Utilice la extensión del seno frontal para la eliminación adicional de la otra lámina craneal. Se expone una lámina craneal interna delgada que cubre el cerebro.Abra suavemente esta lámina para exponer la duramadre que cubre la parte anterior del cerebro. Continúe la eliminación del hueso lateralmente, a través del hueso temporal y parietal. Con el fin de liberar la parte final del cráneo, ubicada entre las partes ya expuestas del cerebro y el cerebelo.Utilice el cincel para romper el hueso craneal posterior restante, desde un lado, tal como se abre una puerta. Extracción del cerebro. Levante la duramadre para realizar una incisión suave cerca del seno sagital.Utilice una apertura dural para la eliminación adicional de la bolsa dural que recubre el cerebro. Se debe tener especial cuidado al retirar la duramadre situada entre el cerebro y el cerebelo, ya que la preservación de esta lámina dural impedirá la extracción posterior del cerebro.Por último, se secciona la duramadre que recubre el cerebelo y el tronco encefálico inferior. Coloque la cabeza del cerdo en posición vertical y libere el cerebro mediante una disección roma de los bulbos olfatorios desde la base del cráneo cubierta por la duramadre. Seccione el quiasma óptico expuesto.Sigala con la exposición y sección del tallo pituitario y los nervios oculomotores. Libere el tronco encefálico mediante la sección de los nervios craneales inferiores. Utilice un cincel para separar el cerebro de la base del cráneo.Extracción de la hipófisis. En la base del cráneo, identifique el tallo hipofisario, con la hoja dural circundante. Corte la hoja dural lateralmente al tallo hipofisario.Utilice un disector para liberar la hipófisis y levántela de la fosa hipofisaria. Resultados y conclusión. La técnica descrita permite la extracción segura del cerebro y la hipófisis de cerdo post mortem en aproximadamente de 15 a 20 minutos.El tejido obtenido puede enviarse para análisis microscópico seguido de seccionado orientado en bloques cerebrales más pequeños. Los bloques son adecuados para análisis químico o para procesamiento histológico adicional.

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La exposición del cerdo del SNC para el análisis histológico: Un Manual para decapitación, Apertura cráneo, cerebro y Remoción

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