Name: Un método versátil de Patterning proteínas y células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a patronar células y sustratos en microcanales microfluídicos utilizando vacío de baja presión y herramientas de laboratorio simples. Este método facilita el estudio de interacciones célula-célula y célula-proteína.

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Los fondos para esta investigación fue proporcionado por la Comisión de New Jersey en la médula espinal de Investigación (NJCSCR) (a FHK), otorgar CSCR14IRG005 (a BLF), NIH subvención R15NS087501 (a CHC), y la Fundación FM Kirby (a ETA).

NOTA: Por favor, consulte a todas las hojas de datos de seguridad de materiales pertinentes (MSDS) antes de usar. Algunos de los productos químicos utilizados en este protocolo son tóxicos y cancerígenos. Por favor, use todas las prácticas de seguridad apropiadas (campana de humos, guantera) y equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados) cuando se utilizan materiales tóxicos o ácido / base. 1. La fabricación de moldes maestros para litografía blanda usando fotolitografía <ol><li> Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo de diseño asistido por ordenador (CAD). </li><li> Imprimir el diseño en una placa de máscara en blanco utilizando el escritor máscara láser. </li><li> Enjuagar una oblea de silicio de 4 pulgadas con acetona seguido por isopropanol y secar con una pistola de aire de nitrógeno para asegurar que ningún disolvente se deja en la oblea. </li><li> Deshidratar la oblea por cocción en una placa caliente a 200 ° C durante 5 min. </li><li> Seleccionar un fotorresistente negativo diseñado para la altura deseada de los microcanales. Fo ejemplo, utilizar fotoprotector negativo SU-8 50 para obtener microcanales con una altura de 50 m. </li><li> Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente, y luego alinear la oblea en el plato de una recubridora de rotación. </li><li> Dispensar 4 ml (1 ml de diámetro / pulgada de la oblea) de resina fotosensible negativa sobre el centro de la oblea. </li><li> Girar la capa de la oblea con un ciclo de centrifugado en dos fases utilizando una ruleta. En primer lugar, aplicar un ciclo de propagación de 500 rpm con una aceleración de 100 rpm / s durante 10 s. A continuación, aplicar un ciclo de centrifugado de 2000 rpm con una aceleración de 300 rpm / s 2 durante 30 s para obtener un revestimiento 50 micras de material fotorresistente sobre una oblea. </li><li> hornear la oblea suave en dos pasos en un plato caliente de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 6 minutos y luego la rampa inmediatamente la temperatura de la placa caliente a la post-hornear la oblea a 95 ° C durante 20 minutos. </li><li> Deje que la oblea se enfríe a temperatura ambiente y después cargue ella oblea en el escenario litografía. </li><li> Alinear la máscara sobre la oblea usando alineador de máscara y exponer la oblea a la luz UV (según las instrucciones del fabricante) a una intensidad de 1,5 mW / cm 2 para 146 s para aplicar la dosis total de UV de 220 mJ / cm 2 requerida para una 50 m de espesor de capa de resina fotosensible. </li><li> Aplicar horneado posterior a la exposición a la oblea en dos pasos sobre una placa caliente. Para un recubrimiento de 50 micras de resina fotosensible, primera pre-hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min e inmediatamente la rampa encima de la temperatura de la placa caliente a la post-hornear a 95 ° C durante 5 min. </li><li> Desarrollar la oblea en sumergiendo la oblea en el SU-8 desarrollador y agitando suavemente hasta que las funciones se aclaran en la oblea. Desarrollar la oblea de ~ 6 min para la fotoprotección de espesor de 50 micras. </li><li> Enjuague el exceso de revelador con isopropanol y etanol, y luego secar la oblea con una pistola de aire de nitrógeno. </li><li> Duro hornear la oblea de silicio sobre una placa caliente a 150 ° C durante 15 min. </li><li> Colocar eloblea en un desecador con 25 l de agente de silanización tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl-1-triclorosilano. NOTA: El agente de silanización es corrosivo, por lo tanto se debe utilizar en una campana de extracción ácido / base, con el equipo de protección personal (gafas de seguridad, guantes, bata de laboratorio, pantalones largos, cerrado-dedo del pie zapatos). </li><li> Aplicar el vacío durante 5 min y exponer la oblea a los vapores de silano durante 30 min sin liberar el vacío. </li><li> La transferencia de la oblea en una placa de Petri de tamaño adecuado. </li></ol> 2. La fabricación de moldes maestros para litografía suave con cinta adhesiva <ol><li> Dibuje el trazado de los microcanales utilizando una herramienta de dibujo CAD e imprimir el dibujo sobre papel blanco. </li><li> Limpiar un portaobjetos de vidrio lo suficientemente grande para acomodar el diseño con isopropanol y luego secar el portaobjetos con una pistola de aire. </li><li> Pegue cinta adhesiva sobre el portaobjetos de vidrio limpia. Tenga cuidado no para atrapar las burbujas de aire. </li><li> Cinta de los lados de la glass deslice sobre el papel con el diseño, con la cinta hacia arriba. </li><li> Utilizar un bisturí para cortar la cinta en el portaobjetos de vidrio utilizando el diseño de papel como referencia y luego pelar la cinta de áreas no deseadas de la lámina de vidrio. </li><li> Enjuague el portaobjetos de vidrio con isopropanol y luego se seca con una pistola de aire. Hornear el portaobjetos de vidrio en un horno a 65 ° C durante 30 min. </li><li> rodar suavemente sobre la cinta con un rodillo de goma para eliminar las burbujas de aire y permitir que la corredera se enfríe a temperatura ambiente. </li></ol> 3. Fabricación suave Litografía de los dispositivos PDMS <ol><li> Mezclar PDMS elastómero y su agente de curado en una relación de 10: 1 (w: w), se agita la mezcla vigorosamente, y luego desgasificar la mezcla colocándolo en una cámara de vacío hasta que no aparecen burbujas de aire en la mezcla. </li><li> Verter la mezcla en un molde de silicona del molde silanizado o cinta adhesiva en una placa de Petri para obtener un ~ 2 gruesa capa de PDMS y desgasificar mm hasta que todo el aire de las burbujas desaparecen. </li><li> Curar el PDMS en un hornoa 65 ° C durante 2 h. </li><li> Utilizar un bisturí para cortar la capa de PDMS al menos 5 mm de distancia de las características y luego pelar el PDMS curado fuera del molde usando pinzas. </li><li> Perforar un único orificio de entrada con una biopsia de 1 mm está en cualquier parte del microcanal, preferiblemente en el extremo de una red de microcanales como se ve en la Figura 2a y 4b. </li><li> Limpiar el PDMS emitidos con cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo adsorbidos en el dispositivo. Esterilizar el dispositivo de microcanales PDMS (PDMS fundido) de un enjuague con una solución de etanol al 70% seguido de agua desionizada estéril (DI), y exponer a los rayos UV durante 30 min. </li><li> Mantenga el dispositivo PDMS estéril en una placa de Petri estéril hasta su uso. </li></ol> 4. Sustrato Patrones <ol><li> Coloque el PDMS estériles emitidos con unas pinzas sobre un cubreobjetos de vidrio estéril o placa de Petri y aplicar una suave presión con la punta de las pinzas. NOTA: El molde de PDMS realiza una conformación sello pero reversible con el glcubreobjetos culo o placa de Petri que forma microcanales sin el uso de ningún adhesivo. </li><li> Colocar una gota (20 - 40 l) de la solución de sustrato en la entrada que cubre completamente el orificio de entrada. Modelo de poli-D-lisina (PDL) mediante la colocación de una gota de 20 l de PDL en tampón de tetraborato de sodio en la entrada de los microcanales. </li><li> Poner la placa de Petri en un vacío de ~ 254 mmHgA (equivalente a vacío de la casa en laboratorios biológicos) durante 10 min, y observar aire que sale del canal en forma de burbujas. </li><li> Liberar el vacío y observar la solución de sustrato que fluye en el microcanal. </li><li> Incubar el plato en las condiciones apropiadas para la adhesión sustrato. Ver las Tablas 1 y 2 para las condiciones de incubación (estos varían dependiendo del sustrato). Para PDL patrón, se incuba durante 1 hora a 37 ° C. </li><li> cuidadosamente retire el sello de PDMS con unas pinzas estériles y se lava el patrón sobre cubreobjetos tres veces con agua DI. </li&gt; <li> Añadir una solución de 1% de albúmina de suero bovino (BSA) a la placa de Petri para cubrir el plato o el cubreobjetos de vidrio y se incuba durante la noche a 37 ° C. NOTA: Esto reducirá la adherencia no específica en las regiones no recubiertas. </li><li> Aspirar la solución de BSA al 1%, y el sustrato modelado ya está listo para usar. </li></ol> 5. Patrones indirecta de células <ol><li> Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 1. </li><li> Añadir la suspensión de células a la placa de Petri con dibujos y sumergir completamente la región modelada en suspensión de células. </li><li> Incubar la placa de Petri a 37 ° C en una incubadora durante 15 minutos para permitir que las células se unan al sustrato modelado. </li><li> Aspirar el exceso de suspensión de células de la placa de Petri y se lavan las células con dibujos tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS), mientras agitando suavemente durante 10 s para eliminar las células no unidas. </li><li> Añadir la unamedio de cultivo apropiadas, con a los cultivos celulares con dibujos y se incuban las células con dibujos a 37 ° C en una incubadora de CO 2. </li></ol> 6. Patrones directa de las células NOTA: Esta técnica es una alternativa a los patrones de células indirecto descrito en la etapa 5. Sin embargo, a diferencia de en el paso 5, en esta técnica las células se modelan en las superficies de cultivo de tejidos con o sin recubrimiento de sustrato. <ol><li> Esterilizar el dispositivo microfluídico de un enjuague con una solución de 70% de etanol seguido de agua DI. </li><li> Remojar el dispositivo durante la noche en una solución de 1% de BSA para evitar la adhesión celular a los PDMS. </li><li> Secar el dispositivo a temperatura ambiente y adjuntarlo a la parte inferior de la placa de Petri tratada con cultivo de tejidos. </li><li> Preparar la suspensión de células en medio de cultivo libre de suero. El tipo de célula y la densidad celular se enumeran en la Tabla 2. </li><li> Colocar una gota (4-8 l) de la suspensión celular, suficiente para llenar elmicrocanales, en la entrada que cubre por completo el orificio de entrada. </li><li> Poner la placa de Petri en un vacío de 10 min y observar aire que sale del canal en forma de burbujas. Liberar el vacío y observar la suspensión de células que fluye en el microcanal. </li><li> Incubar la placa de Petri en una incubadora para promover la adhesión de células como por las condiciones de incubación (dependerá de tipo de célula de modelado) mencionados en la Tabla 2. Añadir PBS a la placa de Petri sumergir el dispositivo de PDMS. </li><li> Pelar el PDMS con cuidado la placa de Petri con pinzas y lavar el patrón con PBS. Añadir medio de cultivo celular a la placa de Petri y colocar el cultivo de células en la incubadora. </li></ol>

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<li>Suchodolskis, A., et al. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/sia.3763/abstract">Elastic properties of chemically modified baker's yeast cells studied by AFM.</a> Surf Interface Anal. 43 (13), 1636-1640 (2011).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Mientras que la fotolitografía convencional es una técnica bien establecida para la realización de moldes de litografía blanda, el equipo, los materiales y las habilidades necesarias para utilizar la fotolitografía convencional no están fácilmente disponibles para la mayoría de los laboratorios. Para los laboratorios que no tienen acceso a estos recursos, hemos presentado la fabricación de cinta adhesiva como un método de creación de moldes con características relativamente simples para dispositivos de microfluidos. Est...

En la ingeniería de tejidos y biosensores, la capacidad de controlar la organización espacial de las proteínas y células en una escala de micras, se ha convertido cada vez más importante en los últimos cuatro décadas 1, 2, 3. Organización espacial precisa de las proteínas y células ha permitido a los investigadores examinar la interacción entre las células y sustratos que contienen tipos similares o diferentes de células, para guiar el crecimiento celular, y para inmovilizar biomoléculas para la fabricación de biosensores 4, 5, 6, 7, 8, 9. Los métodos actuales de proteínas de modelado incluyen photopatterning y la impresión por microcontacto. Photopatterning utiliza material sensible a la luz que se entrecruza con la exposición a ultruna violeta (UV). Luz UV dirigida a una fotomáscara (que consta de zonas transparentes con regiones más oscuras para prevenir la transmisión de luz UV) provoca reticulación en regiones específicas que luego se pueden utilizar para la unión subsiguiente de los biomateriales o células 10, 11. Aunque este esquema es muy precisa y permite un control preciso de la topografía de la superficie de cultivo, que se limita a biomoléculas sensibles a UV que pueden ser modeladas por la radiación UV 12. La impresión por microcontacto es otro método popular de proteínas específicas modelando 13, 14. En este método, un siloxano (PDMS) sello de poli-dimetil se trata con una variedad de reactivos de modificación de la superficie antes de ser sumergida en una solución del sustrato biomolecular elegido. A continuación, se presiona suavemente sobre un cubreobjetos de vidrio u otra superficie de este modo el &quot;sacrificio&quot; de la biomolécula sobre la superficie de cultivo. HoWever, estampado se limita al tipo de material que puede ser transferida, así como la humectabilidad de las biomoléculas a la superficie de los PDMS sello 15. Patrón directa de las células puede ser más difícil y se basa en métodos complejos tales como sustratos conmutables, métodos basados en la plantilla, o patrones con las moléculas de adhesión celular específicos 16, 17. Estos métodos están limitados en su capacidad de células de patrón debido a la falta de sustratos de adhesión celular compatibles, incompatibilidad de que el proceso funcione con células sensibles biológicos y limitaciones, la inconsistencia en la reproducción del patrón, y la complejidad del procedimiento. Por ejemplo, con sustratos conmutables, sustratos personalizados necesitan ser diseñadas para cada tipo de célula, para cambiar su adhesión a tipos celulares específicos sin la degradación a la exposición a la luz UV y calor usado en proceso 17, &lt;<html> SUP = &quot;xref&quot;&gt; 18, 19, 20. procedimientos de modelado en base de la plantilla son versátiles en su capacidad de células de patrón; sin embargo, es difícil de fabricar plantillas de PDMS en los espesores adecuados para uso 16, 21. La inyección directa de células en los canales de microfluidos PDMS tiene algunas ventajas, tales como: 1) la facilidad de fabricación de canales de microfluidos y 2) de idoneidad para muchas células y sustratos diferentes. Sin embargo, el problema frecuente de la captura de burbujas de aire durante el proceso de inyección debido a la hidrofobicidad de PDMS sin el uso de limpieza de plasma, u otros métodos para reducir las burbujas de aire, hace que sea difícil crear consistentemente células modelados en el vidrio o de plástico superficies 21. Este trabajo amplía micromoldeo capilar 22, 23,lass = &quot;xref&quot;&gt; 24, 25, 26 y reporta un método para inyectar proteínas celulares y suspensiones en microcanales. El método utilizado aquí demuestra el patrón de sustratos y ambos patrones directa e indirecta de determinados tipos de células. Esta técnica supera la alta hidrofobicidad de PDMS y elimina la presencia de burbujas durante la inyección de cualquiera de los sustratos o las células mediante el aprovechamiento de la permeabilidad al gas de PDMS 27. Este documento muestra el uso de la técnica con varios sustratos diferentes y tipos de células. El artículo también destaca la fabricación de moldes para la litografía blanda usando fotolitografía convencional, así como un adhesivo simple y de bajo costo método de la cinta útil en entornos con recursos limitados 28, 29.

<table><tbody><tr><td>Herramientas de dibujo CAD CorelDRAW X4 Corel</td><td>Corporation, Canadá</td><td>X4 versión 14.0.0.701</td><td>Herramienta CAD utilizada para dibujar el diseño del dispositivo microfluídico</td></tr><tr><td>Impresora láser HP</td><td>Hewlett Packard, CA</td><td>1739629</td><td>Se utiliza para imprimir el diseño de un dispositivo microfluídico para la técnica de cinta adhesiva</td></tr><tr><td>Bel-Art Dessicator</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-594-16B</td><td>Se utiliza para desgasificar la mezcla</td></tr> <tr><td>de PDMSCinta adhesiva adhesiva Scotch</td><td>Producto 3M, MN</td><td>Cinta 600</td><td>Utilizada para fabricar cinta adhesiva Master</td></tr><tr><td>PDMS Sylgard 184</td><td>Dow Corning, MI</td><td>1064291</td><td>Polímero de fundición</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>08-772-23</td><td>Se utiliza para mantener el molde para fundir con PDMS</td></tr><tr><td>Bisturí de acero inoxidable con cuchilla (# 11)</td><td>Feather Safety Razor Co. Ltd. Japón</td><td>2976 # 11</td><td>Utilizado para cortar el PDMS</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td>Ted Pella, CA</td><td>5627-07</td><td>Se utilizan para manipular el molde de PDMS durante el pelado</td></tr><tr><td>de portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-546-2</td><td>Se utilizan como superficie para modelar el sustrato</td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>12-544-4</td><td>Se utilizan como superficie para modelar el</td></tr><tr><td>sustrato Rodillo de goma</td><td>Dick Blick Art Materials, IL</td><td>40104-1004</td><td>Se utiliza para fijar cinta adhesiva en el vidrio sin atrapar burbujas de aire</td></tr><tr><td>Escritor de máscaras láser</td><td>Heidelberg Instruments, Alemania</td><td>DWL66fs</td><td>Se utiliza para fabricar una máscara de cuarzo utilizada en el proceso de fabricación de fotolitografía</td></tr><tr><td>EVG Mask Aligner (herramienta de exposición UV de fotolitografía)</td><td>EV Group, Alemania</td><td>EVG 620T(B)</td><td>Se utiliza para exponer la fotorresistencia a la luz ultravioleta</td></tr><tr><td>Spin Coater Headway</td><td>Headway Research Inc, TX</td><td>PWM32-PS-CB15PL</td><td>Se utiliza para recubrir la fotorresistencia en la oblea de silicio</td></tr><tr><td>Fotorresistias SU-8 50</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y131269</td><td>Fotorresistencia negativa utilizada para la fabricación de moldes</td></tr><tr><td>SU-8 Devloper</td><td>MicroChem, MA</td><td>Y020100</td><td>Revelador fotorresistente</td></tr><tr><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-Tetrahidrooctil-1-Triclorosilano</td><td>UCT Especialidades, PA</td><td>T2492-KG</td><td>Recubre el molde para evitar la adhesión de PDMS</td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>190764</td><td>Solvente de limpieza</td></tr><tr><td></td><td>Etanol Sigma-Aldrich, MO</td><td>24102</td><td>Solvente de esterilización Bromuro</td></tr><tr><td>de poli-D-lisina (PDL)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P0899-10MG</td><td>La solución de PDL se hace a 0,1 mg / mL en tampón de tetraborato de sodio</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>L2020</td><td>Laminina alícuota en 10 &micro; L alícuotas y diluido a 20 &micro; g/&micro; L en PBS antes de usar</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>BP1605100</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>C2C12 Línea celular de mioblastos</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1722</td><td>Se utiliza para demostrar el patrón de C2C12</td></tr><tr><td>Línea celular PC12</td><td>ATCC, VA</td><td>CRL-1721</td><td>Se utiliza para demostrar el patrón de PC12</td></tr><tr><td>Colágeno tipo 1, cola de rata</td><td>BD Biosciences</td><td>40236</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, MA</td><td>11965-084</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero de caballo, inactivado por calor</td><td>Fisher Scientific, MA</td><td>26050-070</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>Isotiocianato de faloidina-tetrametilrodamina B (TRITC)</td><td>Sigma-Aldrich, MO</td><td>P1951</td><td>Para marcar células</td></tr><tr><td>Calceína-AM Kit de ensayo de células muertas vivas</td><td>Invitrogen, MA</td><td>L-3224 Ensayo de</td><td>viabilidad celular</td></tr><tr><td>Biopsia Perforadora de orificio</td><td>Ted Pella, CA</td><td>15110-10</td><td>Agujero perforado en PDMS</td></tr></tbody></table>

un método versátil de patterning proteínas y células

A Versatile Method of Patterning Proteins and Cells

Las técnicas de sustrato y modelado celular se utilizan ampliamente en biología celular para estudiar las interacciones célula a célula y célula a sustrato. Las técnicas convencionales de modelado funcionan bien solo con formas simples, áreas pequeñas y biomateriales seleccionados. Este artículo describe un método para distribuir suspensiones celulares, así como soluciones de sustrato, en microcanales complejos, largos, cerrados (sin salida) de polidimetilsiloxano (PDMS) utilizando presión negativa. Este método permite a los investigadores modelar múltiples sustratos, como fibronectina, colágeno, anticuerpos (Sal-1), poli-D-lisina (PDL) y laminina. El modelado de sustratos permite modelar indirectamente una variedad de células. Hemos probado mioblastos C2C12, la línea celular neuronal PC12, neuronas corticales embrionarias de rata y neuronas retinianas de anfibios. Además, demostramos que esta técnica puede modelar directamente fibroblastos en canales microfluídicos mediante la aplicación breve de un bajo vacío en suspensiones celulares. El bajo vacío no disminuye significativamente la viabilidad celular como lo demuestran los ensayos de viabilidad celular. Se discuten las modificaciones para la aplicación del método a diferentes tipos de células y sustratos. Esta técnica permite a los investigadores modelar células y proteínas en patrones específicos sin la necesidad de materiales o equipos exóticos y se puede realizar en cualquier laboratorio con vacío.

Este método permite que el patrón de proteínas y patrones indirecta de células usando sin salida canales de microfluidos con dimensiones tan pequeñas como 10 micras y equipo disponible en casi todos los laboratorios biológicos una vez que se hizo el molde maestro. Esta técnica se puede utilizar con los canales de microfluidos PDMS creados usando fotolitografía tradicional suave, o con canales de microfluidos PDMS creadas con cinta adhesiva de fabricación (Figura 1) <sup ...

Este informe describe una técnica simple y fácil de realizar, utilizando vacío a baja presión, para llenar canales microfluídicos con células y sustratos para la investigación biológica.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

Substrate and cell patterning techniques are widely used in cell biology to study cell-to-cell and cell-to-substrate interactions. Conventional patterning ...

El objetivo general de este procedimiento es crear patrones de células o sustratos distribuyéndolos en microcanales complejos, largos y cerrados, utilizando herramientas sencillas disponibles en la mayoría de los laboratorios biológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología relacionadas con las interacciones entre célula y célula, y entre célula y proteína. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar y solo requiere herramientas que están fácilmente disponibles en la mayoría de los laboratorios biológicos.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque requiere la optimización de las condiciones de incubación para las células y los sustratos elegidos por el investigador. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la colocación adecuada del sello de PDMS y de la solución mejora significativamente la reproducibilidad del experimento. Comience dibujando el diseño del microcanal utilizando una herramienta de dibujo asistido por computadora (CAD).Luego, imprima el dibujo en papel blanco. A continuación, utilice isopropanol para limpiar un portaobjetos de vidrio lo suficientemente grande como para albergar el diseño. Después, seque el portaobjetos con una pistola de aire.Coloque cinta adhesiva en la portaobjetos limpia, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire. A continuación, pegue los lados de la portaobjetos en el papel con el diseño, de modo que el lado con cinta quede hacia arriba. Utilice un escalpelo para cortar la cinta sobre la portaobjetos, usando el diseño del papel como referencia.Una vez cortado, retire la cinta de las áreas no deseadas del portaobjetos de vidrio. A continuación, enjuague el portaobjetos con isopropanol para eliminar cualquier adhesivo residual. Luego, use una pistola de aire para secar la superficie.Una vez que la portaobjetos haya sido estructurada y limpiada, colóquela en un horno a 65 grados Celsius durante 30 minutos. Luego, pase suavemente un rodillo de goma sobre la cinta para eliminar las burbujas de aire y permita que la portaobjetos se enfríe a temperatura ambiente dentro de una placa de Petri. Comience mezclando 10 partes de un elastómero de PDMS con 1 parte de su agente de curado y agite vigorosamente la mezcla.Luego, coloque la mezcla en una cámara de vacío para desgasificarla hasta que no queden burbujas de aire. Vierta una capa de 2 mm de espesor de la mezcla sobre el molde de cinta adhesiva y desgasifique el molde hasta que desaparezcan todas las burbujas de aire. Una vez enfriado, use un escalpelo para cortar la capa de PDMS a al menos 5 mm de distancia de las estructuras.Luego, retire el PDMS curado del molde utilizando un par de pinzas. Haga un orificio de entrada con un punzón de biopsia de 1 mm, preferiblemente en el extremo de una red de microcanales. A continuación, limpie el molde de PDMS con cinta adhesiva para eliminar partículas de polvo del dispositivo.Sterilice el dispositivo de microcanales de PDMS enjuagándolo con una solución de etanol al 70 %, seguido de agua desionizada estéril, y expóngalo a luz ultravioleta durante 30 minutos. Utilice pinzas para colocar el molde de PDMS estéril sobre un cubreobjetivo de vidrio estéril y aplique una presión suave usando la punta de las pinzas. A continuación, coloque una gota de poli-d-lisina en tampón de tetraborato de sodio en la entrada de los microcanales.Coloque la placa de Petri bajo vacío durante 10 minutos. Durante este tiempo, observe la salida de aire del canal en forma de burbujas. Libere el vacío y observe cómo la solución de sustrato fluye hacia el microcanal. Incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora.Luego, retire cuidadosamente el sello de PDMS utilizando pinzas estériles y lave el patrón tres veces con agua desionizada. Añada una solución de BSA al 1 % al cubreobjetos de vidrio para reducir la adhesión no específica e incube la muestra durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, aspire la solución de BSA.Para comenzar el patrón indirecto de células, prepare una suspensión celular en medio de cultivo sin suero según se describe en el protocolo de texto adjunto. Añada la suspensión celular a la placa de Petri patroneada, sumergiendo completamente la región patroneada en la suspensión celular. A continuación, incube la placa de Petri a 37 grados Celsius en una incubadora durante 15 minutos para permitir que las células se adhieran al sustrato patroneado.Después de la incubación, aspire la suspensión celular excesiva de la placa de Petri y lave las células impresas tres veces con PBS, agitando suavemente durante diez segundos para eliminar las células no adheridas. Luego, agregue el medio de cultivo adecuado a los cultivos celulares impresos e incube las células impresas a 37 grados Celsius en un incubador con amortiguador de dióxido de carbono. Para la impresión directa de células, primero esterilice el dispositivo microfluídico enjuagándolo con una solución de etanol al 70 % seguida de agua desionizada.Luego, sumerja el dispositivo durante toda la noche en una solución de BSA al 1 % para evitar la adhesión celular no específica al PDMS. Seque el dispositivo a temperatura ambiente y luego fíjelo en el fondo de la placa de cultivo de tejidos tratada. Coloque de 4 a 8 microlitros de la suspensión celular, suficiente para llenar los microcanales, en la entrada, cubriendo completamente el orificio.Luego, coloque la placa de Petri en una cámara de vacío durante 10 minutos. Libere el vacío y observe la suspensión celular fluyendo hacia el microcanal. Incube la placa de Petri a 37 grados Celsius en un incubador con dióxido de carbono tamponado, durante hasta una hora.Luego, retire el recipiente del incubador y use un par de pinzas para desprender cuidadosamente el PDMS del recipiente. Lave el patrón con PBS y luego agregue medio de cultivo celular al recipiente de Petri. Una vez finalizado, coloque las células de nuevo en el incubador.Se muestran aquí neuronas corticales embrionarias de rata dispuestas sobre superficies de poli-d-lisina y laminina. La ubicación de las células demuestra una adherencia general a las áreas dispuestas y crecimiento a lo largo de las franjas de PDL y laminina. Se muestran aquí, con mayor aumento, los mioblastos C2C12.Este tipo celular también se adhiere a las áreas patrones y demuestra fusión en miotubos multinucleados. Esta técnica también se ha adaptado para el patroneado directo de células, mostrado aquí con fibroblastos. Este método de patroneado celular directo no tiene efecto adverso sobre la supervivencia celular.Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de fluorescencia para responder preguntas adicionales relacionadas con la localización de proteínas o las interacciones entre células y sustrato. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la colocación adecuada de la gota de células o de la solución de sustrato para cubrir completamente el inserto es fundamental para el éxito. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la guía de los axones de los fotorreceptores en la biología retiniana.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo distribuir células y sustrato con dispositivos microfluídicos de PDMS permeables a los gases utilizando presión negativa. Gracias por verlo y buena suerte con su experimento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Demostramos un método sencillo para colocar las células en los puntos deseados en un substrato. Este método de los patrones de las células al lanzar un chip de silicona que contiene micropocillos llena de células en el sustrato. Este método ofrece una nueva forma de modular la señalización difusibles y juxtacrine entre las células.

Los patrones de las células madre embrionarias usando el Flip Chip Bio

Impresión por microcontacto se utiliza ampliamente a las proteínas de patrones y otras moléculas en las superficies de material. Se demuestra los pasos básicos de este proceso, los patrones de estampación de la fibronectina sobre el cristal.

Microcontacto de impresión de las proteínas de Biología Celular

Acuosos sistemas de dos fases se utiliza para poblaciones modelo simultáneamente múltiples de células. Este método rápido y fácil para el patrón celular se aprovecha de la separación de fases de las soluciones acuosas de glicol de polietileno y dextrano y la tensión interfacial que existe entre las dos soluciones de polímero.

Co-cultivo celular Patterning Uso acuoso de dos fases Sistemas

Este protocolo describe un método compatible con la microfabricación de patrón de células en SiO2. Un diseño parileno-C predefinido se fotolitográficamente impreso en SiO 2 obleas. Después de la incubación las células con suero (u otra solución de activación) se adhieren específicamente a (y crecen de acuerdo con la conformidad de) subyacente de parileno-C, mientras que siendo repelido por SiO 2 regiones.

Patrones celular en fotolitográficamente Definido Parylene-C: SiO<sub&gt; 2</sub&gt; Sustratos

En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .

Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

El método presentado aquí utiliza micropatrones junto con imágenes cuantitativas para revelar la organización espacial dentro de los cultivos de mamíferos. La técnica es fácil de establecer en un laboratorio de biología celular estándar y ofrece un sistema manejable para estudiar el patrón in vitro.

Mapeo de la Organización Espacial Emergente de Células De mamíferos usando Micropatrones e Imágenes Cuantitativas

Nuestro objetivo general es entender cómo las células detectan señales extracelulares que conducen al crecimiento axonal dirigido. Aquí, describimos la metodología de la Adsorción Molecular Inducida por la Luz de Proteínas, utilizada para producir micropatrones definidos de componentes de matriz extracelular con el fin de estudiar eventos específicos que rigen el crecimiento de axón y la búsqueda de rutas.

Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas utilizando el sistema PRIMO para micro-patrones para estudiar las respuestas celulares a las proteínas de matriz extracelular

Aquí presentamos un protocolo para micropatrones de células a resolución unicelular utilizando adhesión programada por ADN. Este protocolo utiliza una plataforma de fotolitografía de sobremesa para crear patrones de oligonucleótidos de ADN en un portaobjetos de vidrio y luego etiqueta las membranas celulares con oligonucleótidos complementarios disponibles comercialmente. La hibridación de los oligos da como resultado la adhesión celularprogramada.

Patrones simples, asequibles y modulares de células utilizando ADN

El protocolo presentado aquí permite la fabricación automatizada de micropatrones que estandariza la forma celular para estudiar las estructuras citoesqueléticos dentro de las células de mamíferos. Esta técnica fácil de usar se puede configurar con sistemas de imágenes disponibles en el comercio y no requiere equipos especializados inaccesibles a los laboratorios de biología celular estándar.

Control de la geometría celular a través de micropatterning asistido por láser infrarrojo

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Tradicionalmente, el cultivo celular se realiza sobre sustratos planos que imitan mal el entorno natural de las células in vivo. Aquí describimos un método para producir sustratos de cultivo celular con geometrías curvas fisiológicamente relevantes y proteínas extracelulares micromodeladas, lo que permite investigaciones sistemáticas sobre la detección celular de estas señales extracelulares.

Generación de microambientes celulares multicue mediante fotopatronaje UV de sustratos de cultivo celular tridimensional

Aprende a patronar células y sustratos en microcanales microfluídicos utilizando vacío de baja presión y herramientas de laboratorio simples. Este método facilita el estudio de interacciones célula-célula y célula-proteína.

Un método versátil de Patterning proteínas y células

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