Un método versátil de Patterning proteínas y células

El objetivo general de este procedimiento es modelar células o sustratos distribuyéndolos en microcanales complejos, largos y cerrados utilizando herramientas simples de sobremesa disponibles en la mayoría de los laboratorios biológicos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología con respecto a las interacciones de célula a célula y de célula a proteína. La principal ventaja de esta técnica es que es fácil de realizar y solo requiere herramientas que están disponibles en la mayoría de los laboratorios biológicos.

Por lo general, los individuos nuevos en este método tendrán dificultades porque requiere la optimización de las condiciones de incubación de las células y sustratos elegidos por el investigador. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la colocación adecuada del sello y la solución PDMS mejora significativamente la reproducibilidad del experimento. Comience dibujando el diseño del microcanal con una herramienta de dibujo CAD.

Luego, imprime el dibujo en papel blanco. A continuación, use isopropanol para limpiar un portaobjetos de vidrio que sea lo suficientemente grande como para acomodar el diseño. Y luego secar el portaobjetos con una pistola de aire comprimido.

Coloque cinta adhesiva en el portaobjetos de vidrio limpio, teniendo cuidado de no atrapar burbujas de aire. Luego, pega los lados de la corredera de vidrio sobre el papel con el diseño, de modo que el lado de la cinta quede hacia arriba. Usa un bisturí para cortar la cinta en el portaobjetos de vidrio, usando el diseño del papel como referencia.

Una vez cortado, retire la cinta de las áreas no deseadas del portaobjetos de vidrio. A continuación, enjuague el portaobjetos de vidrio con isopropanol para eliminar cualquier residuo de adhesivo. Y luego use una pistola de aire para secar la superficie.

Una vez estampado y limpio, hornee el portaobjetos de vidrio en un horno a 65 grados centígrados durante 30 minutos. Luego, enrolle suavemente la cinta con un rodillo de goma para eliminar las burbujas de aire y deje que el portaobjetos se enfríe a temperatura ambiente en una placa de Petri. Comience mezclando 10 partes de un elastómero PDMS con 1 parte de su agente de curado y revuelva la mezcla vigorosamente.

Luego, coloque la mezcla en una cámara de vacío para desgasificar la mezcla hasta que no queden burbujas de aire. Vierta una capa de 2 mm de espesor de la mezcla sobre el molde de cinta adhesiva y desgasifique el molde hasta que desaparezcan todas las burbujas de aire. Una vez enfriado, utilice un bisturí para cortar la capa de PDMS al menos a 5 mm de distancia de las características.

Y luego, despegue el PDMS curado del molde con un par de pinzas. Perfore un solo orificio de entrada con un punzón de biopsia de 1 mm, preferiblemente al final de una red de microcanales. A continuación, limpie el molde de PDMS con cinta adhesiva para eliminar las partículas de polvo del dispositivo.

Esterilice el dispositivo de microcanal PDMS enjuagándolo con una solución de etanol al 70 %, seguido de agua desionizada estéril, y expóngalo a la luz ultravioleta durante 30 minutos. Use pinzas para colocar el molde de PDMS estéril en un cubreobjetos de vidrio estéril y aplique una presión suave con la punta de las pinzas. A continuación, coloque una gota de poli d lisina en tampón de tetraborato de sodio en la entrada de los microcanales.

Coloque la placa de Petri al vacío durante 10 minutos. Durante este tiempo, observe el aire que sale del canal en forma de burbujas. Libere el vacío y observe la solución de sustrato que fluye hacia el microcanal Incubar el plato a 37 grados centígrados durante una hora.

Luego, despegue con cuidado el sello PDMS con pinzas estériles y lave el patrón tres veces con agua desionizada. Agregue una solución de BSA al 1% al cubreobjetos de vidrio, para reducir la adherencia inespecífica, e incube la muestra durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, aspire la solución BSA.

Para iniciar el modelado indirecto de las células, prepare una suspensión celular en medio de cultivo libre de suero como se describe en el protocolo de texto adjunto. Agregue la suspensión de la célula a la placa de Petri con patrón, sumergiendo completamente la región con patrón en la suspensión de la célula. Luego, incuba la placa de Petri a 37 grados Celsius en una incubadora durante 15 minutos para permitir que las células se adhieran al sustrato modelado.

Después de la incubación, aspire el exceso de suspensión celular de la placa de Petri y lave las células con patrón tres veces con PBS, mientras agita suavemente durante diez segundos para eliminar las células no adheridas. A continuación, añada el medio de cultivo adecuado a los cultivos celulares con patrones e incube las células con patrones a 37 grados centígrados en una incubadora tamponada con dióxido de carbono. Para el modelado directo de las células, primero, esterilice el dispositivo microfluídico enjuagándolo con una solución de etanol al 70% seguida de agua desionizada.

A continuación, sumerja el dispositivo durante la noche en una solución de BSA al 1 % para evitar la adhesión celular inespecífica al PDMS. Seque el dispositivo a temperatura ambiente y luego colóquelo en la parte inferior de la placa de Petri tratada con cultivo de tejido. Coloque de 4 a 8 microlitros de la suspensión celular, suficiente para llenar los microcanales, en la entrada, cubriendo completamente el orificio.

Luego, coloque la placa de Petri en una cámara de vacío durante 10 minutos. Libere el vacío y observe la suspensión celular que fluye hacia el microcanal. Incube la placa de Petri a 37 grados centígrados en una incubadora tamponada con dióxido de carbono, durante un máximo de una hora.

Luego, retire el plato de la incubadora y use un par de pinzas para despegar con cuidado el PDMS del plato. Lave el patrón con PBS y, a continuación, añada los medios de cultivo celular a la placa de Petri. Cuando termine, vuelva a colocar las células en la incubadora.

Aquí se muestran neuronas corticales embrionarias de rata modeladas en superficies de poli d lisina y laminina. La ubicación de las células demuestra una adherencia general a las áreas con patrones y crecimiento a lo largo de las franjas de PDL y laminina. Aquí se muestran, con un aumento mayor, los mioblastos C2C12.

Este tipo de célula también se adhiere a las áreas modeladas y demuestra la fusión en miotubos multinucleados. Esta técnica también se ha adaptado para el modelado celular directo, como se muestra aquí con fibroblastos. Este método de modelado celular directo no tiene ningún efecto adverso sobre la supervivencia celular.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la microscopía fluorescente, para responder a preguntas adicionales relacionadas con la localización de proteínas o las interacciones célula-sustrato. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la colocación adecuada de la gota de células o la solución de sustrato para cubrir toda la incrustación es fundamental para el éxito. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la guía de los axones de los fotorreceptores en la biología de la retina.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo modelar celdas y sustratos con dispositivos microfluídicos PDMS permeables al gas utilizando presión negativa. Gracias por mirar y buena suerte con tu experimento.