Name: La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Aprende a detectar la internalización de receptores GPCR en células HEK293 mediante microscopía confocal. Este protocolo eficiente permite visualizar la localización subcelular y dinámica de proteínas.

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Los autores de este artículo desean agradecer al Prof. Jiayan Xie por la asistencia técnica y el uso del equipo. Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41406137).

1. Preparación de células <ol><li> La recuperación celular <ol><li> Transferencia de las 293 células criopreservadas de riñón embrionario humano (HEK293) a partir de un tanque de nitrógeno líquido a un baño de agua C 37 ° y agitar continuamente durante 1 - 2 min. </li><li> Añadir 10 ml de medio de crecimiento completo equilibrado (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% de solución de penicilina-estreptomicina suero bovino (FBS) y 1% fetal) a una placa de cultivo celular de 10 cm. añadir con cuidado las células descongeladas al medio de crecimiento equilibrado. </li><li> Se incuban las células en una camisa de agua CO 2 incubadora a 37 ° C con una atmósfera humidificada que contiene 95% de aire y 5% de CO2 durante 2 - 4 h. </li><li> Después de 2 - 4 h, comprobar que las células se adjuntan. Reemplazar el medio de crecimiento equilibrado y de cultivo por otro 24 - 48 h. NOTA: Cambiar el medio de crecimiento equilibrado es útil porque elimina sulfóxido de dimetilo (DMSO) y protege contra el daño celular. </li></ol></li><li> &lt;strong&gt; paso Celular <ol><li> Después de 24 - 48 h, cuando las células han crecido hasta cerca de la confluencia, desechar el medio de crecimiento equilibrado y lavar las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agitar el plato suavemente. </li><li> Desechar el PBS y añadir 1 ml de tripsina-EDTA (solución salina, 0,25% de tripsina y 0,02% de EDTA). Para digerir completamente las células, agitar el plato cuidadosamente y aspirar fuera de la solución de tripsina-EDTA. Ponga el plato en el 37 ° C con camisa de agua de CO2 durante 3 min. NOTA: Durante este período, preparar tres nuevos 10 cm placas de cultivo celular y añadir 10 ml de medio de crecimiento equilibrado a cada uno. </li><li> El uso de un microscopio de luz, determinar si las células se han levantado de la parte inferior del plato. Añadir 2 ml de medio de crecimiento equilibrado al plato. Mezclar mediante pipeteo y pipetear inmediatamente 0,6 ml de la suspensión celular a cada uno de los nuevos platos. Se mezclan suavemente mediante pipeteado y permiten que las células se incuban a 37 ° C y 5% de CO2. </li></ol></li&gt; </ol> Siembra 2. Cell <ol><li> Después de 24 - 48 h, cuando las células a pases han crecido hasta cerca de la confluencia, desechar el medio de crecimiento equilibrado y lavar las células con 2 ml de PBS. Agitar el plato suavemente. </li><li> Desechar el PBS y añadir 1 ml de tripsina-EDTA. Para digerir completamente las células, agitar el plato cuidadosamente y aspirar fuera de la tripsina-EDTA. Ponga el plato en el 37 ° C con camisa de agua de CO2 durante 3 min. NOTA: Durante este período, preparar una placa de 6 pocillos mediante la adición de 2 ml de medio de crecimiento equilibrado a cada pocillo. </li><li> Añadir 1 ml de medio de crecimiento equilibrado al plato, si, bajo la observación microscópica, las células que han levantado de la parte inferior del plato. Mezclar mediante pipeteo y de inmediato pipetear 0,1 ml de suspensión de células (el volumen se ajusta de acuerdo a la densidad de crecimiento de las células) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos preparado (placa de células menos de 6 pocillos con 2 ml de medio de crecimiento equilibrado). Mezclar suavemente pipeteando y permitir que las célulasincubar a 37 ° C y 5% de CO2. </li></ol> Transfección 3. Cell <ol><li> Método de transfección 1, con formulaciones de liposomas NOTA: Por favor, véase la Tabla de Materiales para el reactivo de transfección 1. <ol><li> Al día siguiente, asegurar que las células deben ser del 85 - 95% confluentes. </li><li> Añadir 3 g de ADN plásmido (500 ng / l) y 100 l de medio de suero reducido a un tubo de microcentrífuga estéril, y mezclar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Preparar 9 l de Reactivo 1 y 100 l de medio de suero reducido en otro tubo de microcentrífuga, y mezclar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Combinar la mezcla de plásmido se diluyó con diluido Reactivo 1 (volumen total = 215 l). Mezclar suavemente y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente. </li><li> medio Aspirar placa de células cultivadas, y añadir 1,5 ml de DMEM fresco sin FBS. </li><li> Añadir 215! L de DNA-transfección mezcla de reactivos a cada gota a gota bien, y mezclar suavemente por agitación de la placa. </li><li> Incubar a 37 ° C y 5% de CO2 durante 4 - 8 h. Reemplazar con DMEM fresco con 10% de FBS. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO 2 durante otras 24 - 48 h antes de ejecutar cualquier experimentos. </li></ol></li><li> Método de transfección 2, con las formulaciones de liposomas NOTA: Por favor, véase la Tabla de Materiales para el reactivo de transfección 2. <ol><li> Añadir medio de suero 2 g de ADN plásmido (500 ng / l), 4 l de Reactivo 2, y 100! L redujeron en un tubo estéril de microcentrífuga. Mezclar suavemente y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente. </li><li> Añadir la mezcla de transfección a las células de una manera gota a gota. </li><li> Después de la transfección, se incuban las células durante 24 - 48 h a 37 ° C y CO 2 al 5%, antes de ejecutar cualquier experimentos. </li></ol></li></ol> 4. Cultivo de células en cubreobjetos <ol><li> Remover el medio de crecimiento de la placa de 6 pocillos de cultivo. </li><li> Lavar la monocapa de células con 1 ml de PBS sin calcio y magnesio. </li><li> Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA. Agitar el plato con cuidado y aspirar fuera de tripsina-EDTA. Incubar la placa de cultivo durante 3 min a 37 ° C y 5% de CO2. El tiempo de incubación real varía con la línea celular utilizada. NOTA: Durante este período, preparar una nueva placa de 12 pocillos y añadir 15 mm de diámetro cubierta estéril se desliza a cada pocillo. Los cubreobjetos recubiertos con lisina, la laminina, o colágeno pueden mejorar la unión de las células para las células HEK293 que se desprenden fácilmente. </li><li> Cuando se separan las células, se añade medio de crecimiento completo 1 ml pre-calentado a cada pocillo. Mezclar mediante pipeteo y transferir inmediatamente el número requerido de células a la placa de 12 pocillos con cubreobjetos. Añadir medio de cultivo completo fresco a cada pocillo para ajustar el volumen total a 1 ml </li><li> Se incuban las células durante 16 - 24 h a 37 ° C y CO 2 al 5%. NOTA: Después de 30 -60 min, la mayoría de las células se han adherido a los cubreobjetos estériles. </li></ol> 5. Confocal Microscopy Detección <ol><li> localización celular <ol><li> Después de 16 - 24 h, cuando las células han crecido hasta cerca de la confluencia en los cubreobjetos estériles en la placa de 12 pocillos, añadir la sonda de membrana, DiI, a cada pocillo, dando una concentración final de 5? M. Permitir que las células se incuban durante 30 min a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Después de 30 min, eliminar el medio de crecimiento equilibrado y lavar las células dos veces en PBS frío (2 - 8 ° C). </li><li> Fijar las células mediante la adición de 1 ml de una solución de paraformaldehído al 4% (en PBS) a cada pocillo. Agitar suavemente durante 15 min. Precaución: El paraformaldehído es moderadamente tóxico por contacto con la piel o por inhalación, y se designa como un carcinógeno humano probable. Productos químicos humos capuchas, recintos de balance de ventilación u otras medidas de protección debe utilizarse durante el manejo de pesaje y de paraformaldehído. &lt;/ Li&gt; <li> Lavar las células fijadas dos veces en PBS. Añadir 200-300 l de DAPI (4&#39; , 6-diamidino-2-fenilindol) solución (0,5 mg / ml) a cada pocillo y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. </li><li> Lavar las células dos veces con PBS. Retire cuidadosamente la cubierta se desliza de la placa y la mecha el exceso de PBS. Invertir en portaobjetos de microscopio cargados con una gota de medio de montaje (50% v / v de glicerol / agua). Eliminar el exceso de medio de montaje de los portaobjetos. </li></ol></li><li> internalización celular <ol><li> Después de 16 - 24 h, cuando las células han crecido hasta cerca de la confluencia en los cubreobjetos estériles en la placa de 12 pocillos, quitar el medio de crecimiento equilibrado y añadir fresco, calentado medio DMEM (37 ° C). Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C y 5% de CO2. </li><li> Tratar las células con diferentes concentraciones (0, 10 -12, 10 -9, y 10 -6 M) de ligando para 30 min y tratarlos con 10 -6 M ligando para diferentes momentos (0,10, 30 y 60 min). </li><li> Lavar las células dos veces en PBS frío (2 - 8 ° C). Fijar las células mediante la adición de 1 ml de una solución de paraformaldehído al 4% (en PBS) a cada pocillo. Agitar suavemente durante 15 min. </li><li> Lavar las células dos veces en PBS. Retire cuidadosamente la cubierta se desliza de la placa y la mecha el exceso de PBS. Invertir en portaobjetos de microscopio cargados con una gota de medio de montaje (50% v / v de glicerol / agua). Eliminar el exceso de medio de montaje de los portaobjetos. </li></ol></li><li> Microscopia confocal <ol><li> A su vez en el hardware del microscopio confocal, incluyendo la potencia de la lámpara de mercurio, microscopio PC, escáner, y el láser. Accede a la cuenta del sistema operativo, iniciar el software, compruebe la configuración y seleccione láser. A su vez en las diferentes unidades del sistema de microscopía confocal en el orden según las instrucciones. </li><li> Colocar los portaobjetos preparados sobre la platina del microscopio. Coloque la muestra sobre la lente del objetivo utilizando el controlador de etapa. Añadir una gota de aceite de cedro ena cubreobjetos cuando se selecciona la lente de inmersión en aceite. Coloque la cubierta se desliza en las diapositivas que se enfrenta la lente. </li><li> Encuentra las células de interés bajo el microscopio de fluorescencia. </li><li> Cambiar al modo de escaneo. Elegir la potencia del láser y el rango espectral de la emisión del fluoróforo. Capturar las imágenes confocal de alta calidad por la intensidad del láser afinación y otros parámetros. </li></ol></li></ol>

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<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+activation+of+the+G+protein-coupled+receptor+BNGR-A21+by+the+neuropeptide+corazonin+from+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%2C+dually+couples+to+the+G%28q%29+and+G%28s%29+signaling+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades.</a> J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).</li>
<li>Lu, Z. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning%2C+Characterization%2C+and+Expression+Profile+of+Estrogen+Receptor+in+Common+Chinese+Cuttlefish%2C+Sepiella+japonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Zool+A+Ecol+Genet+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica.</a> J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

El protocolo presentado aquí proporciona un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización subcelular y la internalización de la proteína de fusión GPCR expresado en células HEK293. La técnica se puede adaptar fácilmente para muchos genes diferentes y tipos de células, tales como para la localización celular y la internalización del receptor corazonin de Bombyx mori en células HEK293 y BMN 16. La aplicación exitosa de este poderoso ...

Las células poseen la maquinaria tráfico de carga para el transporte de materiales -tales como ligandos, microorganismos, nutrientes y proteínas de transmembrana en la célula de información, la energía y otros fines 1, 2 extracelular. Es crítico para la homeostasis celular, la función del tejido, y la supervivencia celular en general. La expresión basada en células de proteínas de fusión fluorescentes es una forma poderosa para estudiar la localización y la internalización de los receptores transmembrana, tales como G receptores acoplados a proteínas (GPCR), en las vías de señalización 3. La expresión de proteínas de fusión etiquetadas con proteína verde fluorescente (GFP) de medusa Aequorea victoria, combinada con técnicas de detección de fluorescencia directa, ha ganado amplia aceptación en proteínas de metas de investigación 4, 5, 6. detecti basada en GFPOn tiene la ventaja de permitir la obtención de imágenes en tiempo real de las células vivas y evitar artefactos de fijación 7. Una serie de vectores de clonación versátiles se ha construido para facilitar la expresión de fusiones de proteínas a GFP en diversas células 8, 9. El vector pEGFP-N1 es un vector plásmido ampliamente utilizado y comercializado que codifica una proteína verde fluorescente (EGFP), que ha sido optimizado de GFP de tipo salvaje para más brillante de fluorescencia y mayor expresión en células de mamífero. Para observar la señal fluorescente de EGFP expresa en células de mamífero, la microscopía de fluorescencia debe llevarse a cabo con la excitación a 488 nm y la emisión a 507 nm, preferiblemente con microscopía confocal. Control de la localización subcelular y la internalización mediada por ligando de los receptores es una técnica común para investigar la transducción de la señal y la función de los GPCR 10 </shasta&gt; 11. En la mayoría de los casos, la internalización conduce a la desensibilización de los GPCRs (la atenuación de la respuesta de estímulo a pesar de la presencia de agonistas) 12, 13. Los receptores internalizados pueden ser incorporados en el lisosoma y degradado, o pueden ser reciclados de nuevo a la superficie celular, dependiendo de la naturaleza de los receptores y las líneas celulares utilizadas en los experimentos. Los receptores de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHRs) pertenecen a la familia GPCR y tienen una estructura típica de proteínas GPCR, con un terminal amino extracelular, un terminal -COOH intracelular, y siete transmembrana (TM) Dominios 14. La transfección del plásmido recombinante Sj GnRHR-EGFP (con el gen GnRHR de Sepiella japonica) y la detección la microscopía confocal de GnRHR Sj EGFP-etiquetados (expresado en células HEK293) se informó Previouastuto, y la fluorescencia de GFP se estableció como un reportero para los ensayos de localización de la proteína transmembrana 15. Ahora, la internalización de Sj GnRHR, activado por S. japonica hormona liberadora de gonadotropina (GnRH Sj), se demostró en modales tiempo- y dependientes de la dosis por microscopía confocal.

<table><tbody><tr><td>Línea celular HEK293&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/Hidrocona de glucosa alta</td><td></td><td>SH30022.01</td><td>L-glutamina de glucosa alta 4.0 mM</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>PuFei</td><td>1101-100</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Genom</td><td>GNM10010</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Genom</td><td>GNM15140</td><td></td></tr><tr><td>0.25% de tripsina y 0.02% EDTA</td><td>Genom</td><td></td><td></td>GNM25200</tr><tr><td>Opti-MEM (1x)</td><td>GIBCO, de Life Technologies</td><td>31985-062</td> medios <td>de suero reducidos</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>11668027 Reactivo 1</td></tr><tr><td>X-tremeGENE HP DNA Reactivo de transfección</td><td>Roche</td><td></td><td>6366236001 Reactivo 2</td></tr><tr><td>DAPI Solución de tinción</td><td>Beyotime</td><td>C1006</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Beyotime</td><td>C1036</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje antidecoloración</td><td>Beyotime</td><td>P0126</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)</td><td>80096618</td><td></td></tr><tr><td>Cultivo celular de 100 mm</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 pocillos&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0092</td><td></td></tr><tr><td>placa de 12 pocillos&nbsp;</td><td>ExCell Bio</td><td>CS016-0093</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>de</td><td></td> microscopio NEST 801007 <td></td></tr><tr><td></td><td>Citoglas</td><td>10127105P-G</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Forma CO2 Incubadora</td><td>Thermo</td><td>3111</td><td></td></tr><tr><td>TCS SP5II microscopio confocal de barrido láser</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td>5100001311</tr></tbody></table>

la detección de activados por ligando g receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

Detection of Ligand-activated G Protein-coupled Receptor Internalization by Confocal Microscopy

La microscopía de barrido láser confocal (CLSM) es una técnica de imagen óptica para imágenes de alto contraste. Es un enfoque poderoso para visualizar proteínas de fusión fluorescentes, como la proteína fluorescente verde (GFP), para determinar su expresión, localización y función. La localización subcelular de las proteínas diana es importante para la identificación, caracterización y análisis funcional. La internalización es uno de los mecanismos predominantes que controlan la señalización del receptor acoplado a proteína G (GPCR) para garantizar las respuestas celulares adecuadas a los estímulos. En este trabajo describimos un método experimental para detectar la localización e internalización subcelular de GPCR en células HEK293 con microscopía confocal. Además, este experimento proporciona algunos detalles sobre el cultivo celular y la transfección. Este protocolo es compatible con una variedad de marcadores fluorescentes ampliamente disponibles y es aplicable a la visualización de la localización subcelular de la mayoría de las proteínas, así como de la internalización de GPCR. Esta técnica debería permitir a los investigadores manipular de manera eficiente la expresión génica de GPCR en líneas celulares de mamíferos y debería facilitar los estudios sobre la localización e internalización subcelular de GPCR.

La Figura 1 muestra un ejemplo de un sistema de microscopio confocal. La Figura 2 presenta la expresión de pEGFP-N1 en células HEK293. Se detectó la señal de GFP en el citoplasma y núcleo. La Figura 3 muestra la localización subcelular de GnRHR de S. japonica en células HEK293, consistentes con nuestros resultados publicados previamente 15. La proteína de fusión con la etiqueta de EGFP en el extremo C-ter...

Este protocolo describe la detección de microscopía confocal de receptor acoplado a proteína G internalización (GPCR) en células de mamífero. Incluye la cultura básica celular, transfección, y el procedimiento de microscopía confocal y proporciona un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización subcelular y la internalización de GPCR de fusión expresada.

La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) is an optical imaging technique for high-contrast imaging. It is a powerful approach to visualize fluorescent ...

El objetivo general de este experimento es proporcionar un método eficiente y fácil de interpretar para detectar la localización subcelular y la internalización de proteínas de fusión de RCPG expresadas en células de mamífero. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la localización proteica subcelular, como la internalización y reciclaje de receptores. La principal ventaja de esta técnica es que puede utilizarse de forma sencilla y eficiente.Por lo tanto, este método puede proporcionar información útil para monitorear y localizar los receptores acoplados a proteínas G (GPCR). Además, también puede aplicarse a otros sistemas, como las proteínas citoplasmáticas y nucleares. Después de recuperar y pasar las células HEK293 según el protocolo descrito, cuando las células hayan alcanzado un crecimiento casi confluyente, deseche el medio de crecimiento equilibrado, agregue dos mililitros de PBS y agite suavemente la placa para lavar las células.Descarte el PBS y agregue un mililitro de tripsina-EDTA. Para digerir completamente las células, agite suavemente la placa y aspire la solución. Luego, coloque la placa en este incubador de CO₂ con camisa de agua a 37 gr

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Research

Investigación

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Biology

Biología

A continuación, describimos los métodos detallados en vivo de imágenes de células para la investigación de la quimiotaxis. Se presenta fluorescencia microscópica métodos para controlar la dinámica espacio-temporal de los eventos de señalización en las células que migran. La medición de la señalización de eventos nos permite entender mejor cómo una red de señalización de GPCR logra gradiente de detección de factores quimiotácticos y los controles de la migración direccional de las células...

Receptor de imagen acoplados a proteína G (GPCR) mediada por eventos de señalización que la quimiotaxis de control de Dictyostelium discoideum</em

Nos genéticamente-codificar el aminoácido no natural, p-azido-L-fenilalanina en varias posiciones específicas en los GPCR y mostrar la versatilidad del grupo azido en diferentes aplicaciones. Estos incluyen una tecnología fotorreticulación dirigido a identificar los residuos en el bolsillo de unión a ligando de un GPCR, y la modificación bioorthogonal específica de sitio de los GPCR con una etiqueta de epítopo de péptido o de la sonda fluorescente.

Codificados genéticamente-sondas moleculares para Estudiar G receptores acoplados a proteínas

Se describe un método para etiquetar proteína en la superficie de neuronas vivas usando un anticuerpo policlonal específico para epítopos extracelulares. La proteína unida por el anticuerpo en la superficie celular y, posteriormente, internalizado a través de la endocitosis se puede distinguir de la proteína restante en, o de trata a, la superficie durante la incubación.

Etiquetado diferencial de la superficie celular e internalizado Proteínas después Antibody alimentación de vivo cultivadas neuronas

El ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia que aquí se describe es un sistema de cribado de la farmacología inversa medio de rendimiento para la identificación de ligando funcionalmente la activación (s) de G receptores acoplados a proteínas huérfanas (GPCRs).

Caracterización de G receptores acoplados a proteína por un ensayo de movilización de calcio basado en fluorescencia

Este protocolo describe cómo utilizar la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total para visualizar y rastrear receptores individuales en la superficie de las células vivas y, por lo tanto, analizar la movilidad lateral del receptor, el tamaño de los complejos de receptores, así como para visualizar las interacciones transitorias receptor-receptor. Este protocolo puede extenderse a otras proteínas de membrana.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Endocitosis mediada por clatrina, un proceso rápido y altamente dinámico internaliza muchas proteínas, incluidos los receptores de señalización. El protocolo descrito aquí visualiza directamente la cinética de los eventos endocíticos individuales. Esto es esencial para comprender cómo los miembros centrales de la maquinaria endocítica se coordinan entre sí y cómo la carga de proteínas influye en este proceso.

Visualización de endocitosis mediada por clatrina de G receptores acoplados a proteínas en la Resolución Individual de eventos a través de TIRF de Microscopía

El tráfico del receptor modula la señalización celular y la capacidad de respuesta a ligandos y es, en sí, que responda a las condiciones celulares, incluyendo la señalización inducida por ligando. A continuación, describimos una técnica poderosa y flexible para evaluar cuantitativamente el tráfico del receptor inducida por fármacos usando immunolabeling y análisis colocalizational.

Seguimiento de cambios inducidos por fármacos en los receptores post-internalización Trata de Análisis Colocalizational

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes de células que expresan receptores de proteína verde fluorescente con etiquetas de tipo 1a angiotensina durante la endocitosis iniciados por el tratamiento de la angiotensina II. Esta técnica incluye los lisosomas de etiquetado con un segundo marcador fluorescente, y luego utilizando software para analizar la co-localización de receptor y lisosoma en tres dimensiones con el tiempo.

Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

Un análisis simplista de la fluorescencia se presenta para evaluar la eficiencia de amino-acil-tRNA-sintetasa/tRNA pares no-canónico-aminoácidos (ncAAs) incorporar las proteínas expresadas en células de mamíferos. Se describe la aplicación de ncAAs estudiar receptores acoplado proteína G (GPCRs), incluida la asignación de foto-reticulación de enlace sitios bioorthogonal GPCR etiquetado en células vivas.

Optimizar la incorporación genética de química sondas en GPCRs para foto-reticulación asignación y la química de Bioorthogonal en células de mamífero vivo

Este protocolo utiliza la hinchazón de agarosa como una técnica poderosa y generalizable para incorporar proteínas de membrana integral (IMP) en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (GUV), como se describe aquí para la reconstitución de la proteína receptora de serotonina 1A humana (5-HT1AR), una de las clases de receptores acoplados a proteínas G farmacológicamente importantes.

Construcción de membranas lipídicas modelo que incorporan receptores acoplados a proteínas G (GPCR)

En este trabajo, se describe un ensayo de fluorescencia de calcio intracelular de alto rendimiento para placas de 384 pocillos para examinar bibliotecas de moléculas pequeñas en receptores acoplados a proteínas G recombinantes (GPCR). El objetivo, el receptor de cinina de la garrapata de la fiebre del ganado, Rhipicephalus microplus, se expresa en las células CHO-K1. Este ensayo identifica agonistas y antagonistas utilizando las mismas células en un ensayo de "doble adición".

Un ensayo de fluorescencia de calcio de "doble adición" para el cribado de alto rendimiento de receptores acoplados a proteínas G recombinantes

Aprende a detectar la internalización de receptores GPCR en células HEK293 mediante microscopía confocal. Este protocolo eficiente permite visualizar la localización subcelular y dinámica de proteínas.

La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

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