La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

El objetivo general de este experimento es proporcionar un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización e internalización subcelular de las proteínas de fusión GPCR expresadas en células de mamíferos. Este método puede ayudar a responder a las preguntas clave en el campo de la localización de proteínas subcelulares, como la internalización y el reciclaje de receptores. La principal ventaja de esta técnica es que se puede utilizar de forma fácil y eficaz.

Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre el monitoreo y la localización de GPCR. Y también puede aplicarse a otros sistemas, como el citoplasmático y el nuclear de proteínas. Después de recuperar y pasar las células HEK293 de acuerdo con el protocolo de texto, cuando las células hayan crecido hasta casi la confluencia, deseche el medio de crecimiento equilibrado, agregue dos mililitros de PBS y agite el plato para lavar las células.

Deseche el PBS y agregue un mililitro de tripsina EDTA. Para digerir completamente las células, agite con cuidado el plato y aspire la solución. Luego, coloque el plato en esta incubadora de C02 con camisa de agua a 37 grados centígrados durante tres minutos.

Mientras las células se incuban, prepare una placa de seis pocillos agregando dos mililitros de medio de crecimiento equilibrado a cada pocillo. Luego, cuando las células se hayan levantado del fondo del plato, agregue un mililitro de medio de crecimiento equilibrado al plato. Mezcle por pipeteo e inmediatamente transfiera 0,1 mililitros de suspensión celular a cada pocillo de la placa de seis pocillos preparada.

Pipetear suavemente la suspensión en los pocillos e incubar las células a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Al día siguiente, asegúrese de que las células tengan un 85-95% de confluentes. Luego, a dos tubos de microcentrífuga estériles, agregue tres microgramos de ADN plasmídico y 100 microlitros de medio sérico reducido a un tubo.

Mientras tanto, agregue nueve microlitros de reactivo uno y 100 microlitros de medio sérico reducido a otro tubo. Incuba los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. Combine la mezcla de plásmidos diluidos con el reactivo diluido uno.

Luego, mezcle suavemente la solución e incube a temperatura ambiente durante 20 minutos. Aspirar el medio de las células y añadir 1,5 mililitros de DMEM fresco sin FBS. A continuación, añada gota a gota 215 microlitros de mezcla de reactivos de transfección de ADN a cada pocillo y mezcle suavemente girando la placa.

Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante cuatro a ocho horas. Luego, reemplace el medio con DMEM nuevo con 10% FBS. Incuba las células durante otras 24 a 48 horas antes de realizar cualquier experimento.

La eficiencia de la transfección puede variar mucho en diferentes líneas celulares. Por lo tanto, puede ser necesaria la optimización de la deposición de sentado y puñalada dependiendo del tipo de célula particular utilizado. Retire el medio de crecimiento de la placa de cultivo de seis pocillos.

Luego, use un mililitro de PBS para lavar la monocapa celular. Agregue 0,5 mililitros de tripsina EDTA, agite el plato y aspire la solución. Luego, incube la placa de cultivo a 37 grados centígrados durante tres minutos.

Durante la incubación, inserte cubreobjetos estériles de 15 milímetros de diámetro en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Vuelva a suspender las células en un pequeño volumen de medio de crecimiento completo fresco y transfiera el número requerido de células a la placa de 12 pocillos con cubreobjetos. Luego, incuba las células durante 16 a 24 horas.

Después de 16 a 24 horas de incubación, cuando las células hayan crecido hasta casi la confluencia, agregue cinco micromolares de eneldo de sonda de membrana a cada pocillo y vuelva a colocar las células en la incubadora durante 30 minutos. Retire el medio de crecimiento equilibrado y use PBS frío para lavar las células dos veces. Luego, agregue un mililitro de PFA al 4% a cada pocillo y agite las celdas durante 15 minutos para fijar las celdas.

Con PBS, lave las celdas fijas dos veces, luego agregue de 200 a 300 microlitros de DAPI a cada pocillo e incube la placa durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las celdas con PBS dos veces, retire con cuidado los cubreobjetos de la placa y absorba el exceso de tampón. Invierta los cubreobjetos en portaobjetos de microscopio cargados con una gota de medio de montaje.

A continuación, retire el exceso de medio de montaje de las correderas. Usando células que hayan crecido hasta casi la confluencia, retire el medio de crecimiento equilibrado y agregue DMEM fresco calentado. Incuba las células durante una hora.

Tratar las células con diferentes concentraciones de ligando durante 30 minutos. Y trate las células con 10 al ligando molar negativo de seis para los diferentes tiempos que se muestran aquí. Use PBS frío para lavar las celdas dos veces, luego agregue un mililitro de 4% de PFA en PBS a cada pocillo, antes de agitar suavemente las celdas durante 15 minutos.

Después de lavar las celdas dos veces en PBS, retire con cuidado los cubreobjetos de los pocillos de la placa y móntelos como se demostró anteriormente en este video. Para llevar a cabo la microscopía confocal, encienda el hardware del microscopio confocal, incluida la potencia de la lámpara de mercurio, el microscopio PC, el escáner y el láser. Inicie el software, luego verifique la configuración y seleccione el láser.

Encienda las diferentes unidades del sistema de microscopía confocal de acuerdo con las instrucciones. Coloque un portaobjetos preparado en la platina del microscopio y utilice el controlador de platina para colocar la muestra sobre la lente del objetivo. Para una lente de inmersión en aceite, agregue una gota de aceite de cedro en el cubreobjetos y oriente el portaobjetos con un cubreobjetos hacia el lente.

En fluorescencia, encuentre las celdas de interés, luego cambie al modo de escaneo y elija la potencia del láser y el rango espectral del fluoróforo de emisión. Capture imágenes de alta calidad ajustando la intensidad del láser y otros parámetros. Esta figura ilustra la expresión de pEGFP-N1 en células HEK293.

La señal GFP se detectó en el citoplasma y en el núcleo. Aquí se muestra la localización subcelular en las células HEK293 de los receptores de la hormona liberadora de gonadotropina de S-Japonica, o SjGnRHR. Los receptores de EGFP están en verde, y la tinción de Dil, que resalta la membrana celular, está en rojo.

Se observa que los receptores se localizan en la membrana plasmática. Para visualizar la internalización de las SjGnRHRs, las células se trataron con hormona liberadora de gonadotropina a diferentes concentraciones. Como se ve aquí, la internalización de los receptores procedió de una manera dependiente de la dosis, y el receptor se internalizó completamente desde la superficie de la célula con el ligando molar de 10 a menos seis.

Cuando se trataron con ligando molar de 10 a menos seis molares durante diferentes períodos de tiempo, las SjGnRHR internalizadas fueron detectables 10 minutos después de la simulación con agonistas, y la internalización extrema ocurrió a los 60 minutos. Como se demostró en las células HEK293, en ambos experimentos, la proteína de fusión fluorescente SjGnRHR EGFP se localizó principalmente en la membrana plasmática y se internalizó dramática y rápidamente en las células. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las células en las condiciones adecuadas sin contaminación por bacterias, hongos y micoplasmas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos como la comprobación celular y la inmovilización para responder a preguntas adicionales como la segunda en el paso V de los receptores de proteínas. Después de cada desarrollo, la tecnología allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biología celular y la bioquímica exploraran la localización y la internalización de los receptores transmembrana en varias líneas celulares.