Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

El objetivo general de este cribado es identificar inhibidores de proteínas cinasas de moléculas pequeñas que modulen la pluripotencia de las células madre embrionarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de células madre embrionarias mediante la identificación de nuevas vías de señalización de proteínas quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que el cribado es relativamente fácil de realizar utilizando equipos de laboratorio estándar y reactivos fácilmente disponibles.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que la mayoría de las investigaciones sobre las vías de señalización de pluripotencia habían ignorado por completo las grandes ondas del kinoma. Prepare platos de 10 centímetros recubiertos de gelatina agregando cinco mililitros de gelatina al 0,1% en platos de 10 centímetros. Después de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos, aspire la gelatina y deje que la placa se seque durante dos minutos.

A continuación, coloque cualquier línea de células madre embrionarias de ratón estándar en las placas recubiertas en un medio de células madre embrionarias de ratón estándar que contenga 100 nanogramos por mililitro de LIF marcado con GST, 10 % de suero fetal de ternero y 5 % de reemplazo de suero knockout. Cultive las células a 37 grados centígrados, 5% de CO2 y reemplace los medios todos los días. Pase las células madre embrionarias del ratón a una confluencia de alrededor del 80% cada dos días aspirando el medio y lavando con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato por placa.

A continuación, se añade un mililitro de tripsina EDTA por placa de células madre embrionarias de ratón e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, vuelva a suspender las células tripsinizadas en cuatro mililitros de medio y centrifugue las células a 1200 RPM durante cinco minutos. Vuelva a suspender completamente el pellet de celda resultante en cinco mililitros de medio, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión de una sola celda.

Cuente las células combinando una suspensión de celdas de 10 microlitros y 10 microlitros de azul de tripán. Coloque la mezcla en una cámara de conteo de células o use un hemocitómetro y un microscopio óptico. A continuación, siembre 3000 células madre embrionarias de ratón en placas de 96 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% en un volumen final de 100 microlitros de medio utilizando una pipeta multicanal.

A continuación, aplique los inhibidores de la cinasa en una dilución de uno a 100 utilizando una pipeta multicanal. Pipetear suavemente el medio para mezclar el inhibidor y la suspensión celular. A continuación, deje que las células se asienten en una campana de cultivo de tejidos durante una hora para garantizar una distribución uniforme en la superficie de la placa.

Cultive las células durante 48 horas sin cambiar el medio. Para comenzar el análisis de cribado, lave placas de células madre embrionarias de ratón de 96 pocillos en 200 microlitros de PBS utilizando un aspirador multicanal y pipetas. Después del lavado, mezcle los extractos celulares en 150 microlitros de tampón de lisis.

Clariclar los extractos por centrifugación a 1500 veces G durante 30 minutos en placas de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, inmovilice 100 microlitros de sobrenadantes en una membrana de nitrocelulosa utilizando un colector de diagrama de puntos de vacío de 96 pocillos. Seque la membrana y el tinte con 40 mililitros de Ponceau S para garantizar una transferencia consistente.

Después de lavar la membrana con TBST, bloquéela en TBST más 3% de leche. A continuación, incubar la membrana en anticuerpos Nanog y Dnmt3b a una dilución de uno a 1000 en el tampón de bloqueo durante la noche. Al día siguiente, lave la membrana tres veces durante 10 minutos en TBST.

A continuación, incubarlo en 30 mililitros de anticuerpos secundarios a una dilución de uno a 10.000 en tampón de bloqueo. Desarrollar la membrana utilizando un sistema digital de imágenes de inmunotransferencia. Es fundamental validar los inhibidores de cinasas identificados en el cribado mediante inmunotransferencia convencional antes de proceder.

Esto ayuda a eliminar los falsos positivos antes de un análisis posterior. Analice los datos de la pantalla y valide los inhibidores como reguladores de pluripotencia de buena fe, tal como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestra un gráfico de puntos Nanog representativo de la pantalla realizada.

Se destacan los inhibidores de control positivo que impulsan la pluripotencia cebada o ingenua. También se muestra un diagrama de puntos Dnmt3b representativo de la pantalla realizada. Se vuelven a destacar los inhibidores de control positivo que impulsan la pluripotencia cebada o ingenua.

En este gráfico, los inhibidores se clasificaron para la proporción de Nanog a Dnmt3b. Se establece un umbral de proporción doble de Nanog a Dnmt3b para identificar los inhibidores que estabilizan la pluripotencia ingenua o cebada. También se proporcionan señales Nanog y Dnmt3b sumadas.

Además, se anotan los inhibidores de cinasas seleccionados para su posterior validación. Aquí se muestra una validación de inmunotransferencia convencional de inhibidores de cinasas seleccionados, inmunoblots Nanog y Dnmt3b, así como se proporciona la relación Nanog a Dnmt3b y la señal total. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los inhibidores de quinasas de moléculas pequeñas que modulan la pluripotencia de las células madre embrionarias.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 72 horas si se realiza correctamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre las vías de señalización de la quinasa que controlan la pluripotencia, también se puede aplicar a la diferenciación de células madre embrionarias y otros sistemas reguladores como los modificadores epigenéticos. Siguiendo el procedimiento, se pueden utilizar otras bibliotecas de inhibidores de moléculas pequeñas, como las dirigidas a modificadores epigenéticos, para identificar nuevos actores en la regulación de la pluripotencia.

Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que nuestro grupo de investigación pudiera dilucidar nuevas vías de señalización de pluripotencia. Utilizamos esta técnica para identificar un nuevo papel de la vía amplificada en la regulación de la pluripotencia.