Name: Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Descubre un método de cribado de alto rendimiento para identificar quinasas que regulan la pluripotencia en células madre embrionarias de ratón mediante inhibidores de pequeñas moléculas y análisis por inmunotransferencia.

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El CACW cuenta con el apoyo de una beca de doctorado del Consejo de Investigación Médica. GMF es apoyado en parte por un Consejo de Investigación Médica Nuevo Premio Investigador (MR / N000609 / 1) y una beca de investigación Tenovus Escocia.

1. Colocación de Bibliotecas de Inhibidores de Quinasa de Pequeña Molécula <ol><li> Agrupar las librerías inhibidoras de las colecciones de inhibidores de quinasa accesibles al público, por ejemplo , la Biblioteca de Redes Integradas de Firmas Celulares (LINCS) de Harvard Medical School, una colección selectiva de 228 potentes y selectivos inhibidores de quinasa (http://lincs.hms.harvard.edu) , Y el conjunto de inhibidores de la proteína quinasa (PKIS), una colección de compuestos 376 reunida por investigadores industriales (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . Alternativamente, ensamble una colección inhibidora de quinasa a medida de compuestos comercialmente disponibles. NOTA: En nuestro laboratorio, hemos reunido una colección de 72 inhibidores potentes y selectivos de quinasas de herramientas que cubren 51 cinasas objetivo primarias, todas las cuales están disponibles de fuentes comerciales. </li><li> Ensamble los inhibidores de quinasas en placas de 96 pocillos para un procesamiento óptimo de alto rendimiento en concentraciones múltiples (use 1, 0.1 aNd 0,01 mM). Incluya en cada placa pocillos de control que contengan sólo DMSO e inhibidores de control de referencia PD173074 (FGFRi) y Ruxolitinib (JAKi), que se sabe que promueven los estados pluripotentes naïve y cebado respectivamente. Anotar en una hoja de cálculo o software similar. </li></ol> 2. Condiciones y procedimientos de cultivo de la mESC para la preparación de la pantalla <ol><li> Preparar platos de 10 cm revestidos con gelatina al 0,1% mediante la adición de 5 ml de gelatina al 0,1% (p / v) a placas de 10 cm e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar la gelatina y dejar secar la placa durante 2 min. </li><li> Cultivo de cualquier línea estándar de mESC a 37 ° C 5% de CO 2 sobre placas de 10 cm revestidas con gelatina al 0,1% en medio MESC estándar (véase Tabla de Materiales) que contiene 100 ng / ml de GST-LIF, 10% de Suero fetal de ternera y 5% Reemplazo. Reemplazar los medios de comunicación todos los días y pasar los mESCs a alrededor del 80% de confluencia cada segundo día a una dilución de 1: 5-1: 10. </li><li> Al paso mESCs, aspirar los medios y lavar con 5 mL oF de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por placa. </li><li> Añadir 1 ml de tripsina-EDTA (tripsina al 0,05%, EDTA al 0,02%) por placa de mESCs e incubar a 37 ° C durante 10 min. </li><li> Resuspender las células tripsinizadas en 4 ml de medio de mESC y centrifugar a 1.200 rpm durante 5 min. </li><li> Resuspender completamente el sedimento celular en 5 ml de medio mESC, pipetear hacia arriba y hacia abajo para generar una única suspensión celular. </li><li> Contar las células mediante la combinación de una suspensión de 10 μL de células y 10 μ l de azul Trypan (0,4%). Coloque en una cámara de recuento de células o utilice un hemocitómetro y un microscopio óptico. </li><li> Se sembró 3 x 10 3 mESCs en placas de 96 pocillos revestidas con gelatina al 0,1%, volumen final 100 μl de medio, usando una pipeta multicanal. </li><li> Aplique inhibidores de quinasa a una dilución de 1: 100 (1 μl de inhibidor añadido a 100 μl de medio) usando una pipeta multicanal. Pipetar suavemente los medios para mezclar el inhibidor y la suspensión celular, luego dejar que las células se asienten en una campana de cultivo de tejidos durante 1 h para asegurar una distribución igual de acroSs la superficie de la galjanoplastia. Células de cultivo durante 48 h sin cambiar los medios. NOTA: Las placas de reserva de 1 / 0.1 / 0.01 mM darán una concentración de inhibidor final de 10/1 / 0.1 μM, respectivamente. Se recomienda iniciar la pantalla a una concentración final de 1 μM para asegurar la inhibición efectiva de las quinasas diana primarias, al mismo tiempo que se minimizan los efectos fuera de destino. </li></ol> 3. Análisis de detección de inhibidores de quinasa <ol><li> Lavar las placas mESC de 96 pocillos en 200 μl de PBS usando un aspirador multicanal y pipetas. </li><li> Hacer extractos celulares en 150 μl de tampón de lisis (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 al 1% (v / v), desoxicolato de sodio al 0,5% (p / v), β-glicerofosfato 10 mM , Pirofosfato sódico 10 mM, NaF 1 mM, Na _ { 3 } VO _ {4} 2 mM, Comprimidos completos para cocteleros con inhibidores de proteasas). </li><li> Aclarar los extractos por centrifugación a 1.500 xg durante 30 min en placas de 96 pocillos de fondo en V. </li><li> Inmovilizar 100 μL de sobrenadantes en un nitrocelDe membrana de lulosa utilizando un colector de puntos de vacío de 96 pocillos. </li><li> Seque la membrana y se mancha con 40 mL de Ponceau S para asegurar una transferencia consistente. </li><li> Lavar la membrana con TBST y bloquear en TBST / 3% (p / v) de leche. </li><li> Incubar en anticuerpos Nanog y Dnmt3b a una dilución de 1: 1.000 (v / v) en TBST / 3% (p / v) de leche en polvo durante la noche. </li><li> Lavar las membranas en 3 x 10 min en TBST e incubar en 30 ml de anticuerpos secundarios a una dilución de 1: 10.000 (v / v) en TBST / 3% (p / v) de leche. </li><li> Desarrollar utilizando un sistema de imagen inmunoblotting digital. NOTA: Si es posible, utilice inmunoblotting de fluorescencia cuantitativa para detectar Nanog y Dnmt3b. Sin embargo, la señal de fondo para Dnmt3b por inmunotransferencia de fluorescencia es demasiado alta. Por lo tanto, se utilizan anticuerpos secundarios de fluorescencia anti-conejo (Nanog) y anti-ratón-HRP (Dnmt3b) de 800 nm. </li></ol> 4. Análisis de datos de pantalla y validación de inhibidores como reguladores de pluripotencia de buena fe <p class="jove_content"&gt; NOTA: Este es un paso crítico para asegurar que sólo se identifiquen moduladores de pluripotencia de buena fe. Es esencial triar inhibidores basados ​​tanto en la relación Nanog: Dnmt3b como en la señal global, para asegurar que los inhibidores de quinasa que afectan negativamente a la supervivencia de mESC no se seleccionan para un análisis posterior. <ol><li> Cuantificar la señal de Nanog y Dnmt3b utilizando el software de análisis de inmunotransferencia e importar valores en una hoja de cálculo o software similar. Calcular la relación Nanog: Dnmt3b para todas las muestras en comparación con el control de DMSO. Además, determinar la señal total de Nanog y Dnmt3b para asegurar que los inhibidores de la quinasa no afectan a la relación Nanog: Dnmt3b alterando la viabilidad del mESC. </li><li> Utilizar relaciones Nanog: Dnmt3b para identificar inhibidores que promuevan la pluripotencia ingenua (relación Nanog: Dnmt3b mayor que el control) y pluripotencia (Nanog: Dnmt3b ratio inferior al control). Ajustar el corte a una desviación de 2x de los valores de control, y filtrar los inhibidores de quinasa que producen una señal Nanog + Dnmt3b total de menos que50% del valor de control de DMSO para generar una lista de confianza alta de inhibidores de quinasa que estabilizan los estados pluripotentes naïve (alto Nanog: Dnmt3b ratio) y primado (bajo Nanog: Dnmt3b ratio). </li><li> Validar los inhibidores de la quinasa mediante la siembra de mESCs a 2 x 10 5 células por 6 pocillos en 2 ml de medio y añadir inhibidores de quinasa a 1 μM durante 48 h, sin cambiar los medios. </li><li> Lyse mESCs en tampón de lisis y analizar la expresión de Nanog y Dnmt3b por inmunotransferencia SDS-PAGE convencional. </li><li> Además validar hits por SDS-PAGE immunoblotting para naïve pluripotencia marcadores Klf2 y Klf4, y Oct4 para garantizar que la pluripotencia se mantiene después de 48 h de tratamiento con inhibidores. </li></ol>

<ol><li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li>
<li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+and+primed+pluripotent+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li>
<li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li>
<li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li>
<li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li>
<li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li>
<li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li>
<li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li>
<li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li>
<li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+domains+of+Sos1%2FGrb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li>
<li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li>
<li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li>
</ol>

Los autores no declaran ningún conflicto de interés derivado de este estudio.

Aquí demostramos una metodología ampliamente accesible para investigar el papel de las vías de señalización de la quinasa en la regulación de la transición pluripotente primitiva. Esto aborda una pregunta clave en el campo ESC. Aunque los enfoques de genómica y transcriptómica de alto rendimiento se usan rutinariamente para identificar reguladores transcripcionales clave de estados pluripotentes ingenuos e iniciados, la dilucidación de las redes de señalización de pluripotencia ha demostrado ser un desafío. Ahora proporcionamos una estrategia flexible que emplea inhibidores químicos para identificar quinasas que controlan la transición pluripotente primitiva en mESCs. Esto se basa en equipos simples, reactivos y materiales que están disponibles para la mayoría de los laboratorios que estudian la señalización celular y ESC biología. Crítico para el éxito de esta plataforma es nuestro desarrollo de un ensayo robusto para cuantificar la transición entre ingenuo y primado estados pluripotentes. El establecimiento de este ensayo requirió modificaciones iterativas significativas a las células platDensidad, tiempo de incubación del inhibidor y condiciones de inmunotransferencia. Los enfoques de moléculas pequeñas están ganando terreno para el uso racional en aplicaciones terapéuticas ESC 15 , 16 . Una ventaja importante de la selección de moléculas pequeñas es que los compuestos de herramienta están diseñados y / o modificados para una captación celular eficiente. La eficacia de la transfección no es limitante y no es necesario el uso de sistemas de administración peligrosos como el lentivirus. Además, los inhibidores frecuentemente inhiben múltiples isoformas dentro de una familia de quinasas ( por ejemplo Fgfr1-4, Jak1-3), que supera la redundancia funcional que impide las técnicas de interferencia genética / genómica como RNAi y CRISPR / Cas9. A medida que los compuestos de herramientas más potentes y selectivos se hagan disponibles a partir de programas de descubrimiento de fármacos tanto académicos como farmacéuticos, las quinasas poco estudiadas y mal entendidas serán empujadas a la vanguardia de la investigación de ESC. Por lo tanto, proponemos que este altoEl enfoque de selección desfasada abrirá nuevas vías de investigación en las redes de regulación del CES. Una limitación menor de esta tecnología es que incluso los inhibidores de moléculas pequeñas más potentes y selectivos se implican e inhiben múltiples quinasas no relacionadas in vivo . Sin embargo, los datos de perfiles de inhibidores de quinasa cada vez más completos permiten identificar fácilmente los objetivos funcionales de los inhibidores de quinasa (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibidores). Finalmente, en principio, nuestra plataforma puede aplicarse para interrogar cualquier recolección de moléculas pequeñas o ensayos celulares para los que se disponga de anticuerpos de inmunotransferencia de alta calidad. Esto permitirá el estudio de múltiples sistemas reguladores en la regulación de la pluripotencia y facilitar la identificación de los inhibidores de moléculas pequeñas que modifican diversos procesos celulares. Especıficamente, se prevé que la aplicación de colecciones de moléculas peque~nas emergentes tales como el epıgenoTic sondas que está siendo desarrollado por el Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemicalprobes/epigenetics) tiene el potencial de descubrir más nuevos reguladores de las transiciones pluripotentes.

Las células madre embrionarias (ESC) tienen la capacidad de auto-renovarse o diferenciarse en cualquier tipo celular en el cuerpo adulto, un fenómeno conocido como pluripotencia 1 . Evidencia reciente indica que existen estados pluripotentes distintos del desarrollo, denominados pluripotencia &quot;naïve&quot; y &quot;cebada&quot; 2 . Naïve CES representan un estado de desarrollo similar a la que se encuentra en el embrión preimplantación [ 3] . Por el contrario, los CES pluripotentes preparados están preparados para salir de la pluripotencia y diferenciarse en linajes embrionarios especializados 4 , 5 . Los estados pluripotentes naïve y priming están marcados por redes reguladoras de genes distintas. La pluripotencia naïve se caracteriza por la expresión de factores clave de transcripción de pluripotencia tales como Nanog, factores de transcripción tipo Krueppel (Klfs), Rex1 2 y Esrrb <supClass = &quot;xref&quot;&gt; 6. En los CES de ratón (mESCs), la pluripotencia primada se caracteriza por una expresión reducida de marcadores ingenuos y una firma de expresión génica específica que incluye la ADN metiltransferasa de novo Dnmt3b 7 . Las células madre epiblasas pluripotentes pluripotentes primitivas (EpiSCs) 4 , 5 expresan adicionalmente el marcador de Epiblast Fgf5 y marcadores de cebado de linaje tales como Brachyury 8 . Los mESCs proporcionan un modelo manejable para sondar los mecanismos que controlan las transiciones pluripotentes iniciadas por ingenuo in vitro . Cuando se cultivan en factor inhibidor de leucemia (LIF) y suero bovino fetal (FBS), los MESC experimentan una transición dinámica entre estados pluripotentes naïve e iniciados 9 , 10 . Funciones de señalización LIF-Jak-Stat3 para promover una ingenua red reguladora de genes 11 </Sup&gt;, mientras que la señalización autocrina a través de la vía Erk1 / 2 del factor de crecimiento de fibroblastos 4 (Fgf4) conduce la transición al estado iniciado 12 . Sin embargo, sigue siendo un desafío para evaluar sistemáticamente el papel de las proteínas quinasas en la especificación de distintos estados pluripotentes. Aquí, describimos una plataforma cuantitativa y escalable para realizar pantallas de moléculas pequeñas dirigidas a los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva. Utilizamos condiciones simples de cultivo de mESC y reactivos estándar, materiales y equipos para descubrir y validar inhibidores de quinasas con capacidad hasta ahora no apreciada para estabilizar la pluripotencia ingenua. Además, se discuten potenciales aplicaciones extendidas para esta tecnología, incluso para el cribado de otras colecciones de moléculas pequeñas tales como bibliotecas de inhibidores emergentes dirigidas a reguladores epigenéticos.

<table><tbody><tr><td>mESC media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&nbsp; SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Final: 2 mM</td></tr><tr><td>de Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Final: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Final: 0,1 mM</td></tr><tr><td>Factor Inhibidor de la Leucemia (fusión GST)</td><td>Reactivos y servicios</td><td></td> de MRC-PPU <td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Factor Inhibidor de la Leucemia</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>de Aminoácidos No Esenciales</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Final: 0,1 mM</td></tr><tr><td>de Piruvato de Sodio</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Final: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: 5%</td></tr><tr><td>Definido Suero Fetal Bovino</td><td>Fisher 10703464</td><td></td><td>Final: 10%</td></tr><tr><td>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>TC materiales</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), rojo fenol</td><td>Thermo</td><td>25300054&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatina de piel porcina</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Plate</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, sin calcio, sin magnesio</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 pocillos</td> placas <td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Lysis Buffer</td>Tris tampón VWR <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Desoxicolato</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerofosfato</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Pirofosfato de sodio</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Fluoruro de sodio</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Ortovanadato de sodio</td><td>Sigma 450243</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roche Inhibidor de Proteasa Completo Tabletas de Cóctel Sigma</td><td></td><td>CO-RO</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Químicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Leche en polvo</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Western Blotting</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocelulosa 0.45 &micor; M&nbsp; Tamaño de poro (20 cm x 20 cm Hojas) (25 Hojas)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Compañía</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Equipo de laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I Sistema</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc</td> generador de imágenes <td>BioRad</td><td>1708280&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Burro anti-Conejo</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Tecnología de Señalización Celular</td><td>Anti-Ratón-HRP</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R& D Sistemas</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Las células madre embrionarias (ESC) pueden auto-renovarse o diferenciarse en todos los tipos de células, un fenómeno conocido como pluripotencia. Distintos estados pluripotentes han sido descritos, denominados pluripotencia &quot;naïve&quot; y &quot;primada&quot;. Los mecanismos que controlan la transición ingenua-primed son mal entendidos. En particular, seguimos siendo mal informados sobre las proteínas quinasas que especifican naïve y primado pluripotentes estados, a pesar de la creciente disponibilidad de alta calidad de los compuestos de la herramienta de sonda quinasa función. Aquí, describimos una plataforma escalable para llevar a cabo pantallas de moléculas pequeñas dirigidas a los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva-cebada en CES de ratón. Este enfoque utiliza condiciones sencillas de cultivo celular y reactivos estándar, materiales y equipos para descubrir y validar inhibidores de quinasas con efectos hasta ahora no apreciados sobre la pluripotencia. Discutimos aplicaciones potenciales para esta tecnología, incluyendo cribado de otras moléculas pequeñasColecciones tales como inhibidores de quinasa cada vez más sofisticados y bibliotecas emergentes de compuestos de herramientas epigenéticos.

Utilizando el procedimiento presentado aquí ( Figura 1 ), se selecciona la biblioteca LINCS de 228 potentes y selectivos inhibidores de quinasa para identificar los que modulan mESC pluripotencia. La biblioteca se prepara a una concentración de 0,1 mM para una dilución 1: 100 y concentración final de selección de 1 μM en mESCs. 48 h después, los mESCs se lisaron y se prepararon extractos para el análisis cuantitativo dot blot de la expresión de Nanog y Dnmt3b ( Figura 2 , parte superior). Los resultados de otras concentraciones de cribado no se representan aquí por brevedad. Se determina la relación Nanog: Dnmt3b para cada inhibidor de quinasa y se clasifican los compuestos y se aplica un corte 2x ( Figura 2 , parte inferior). La señal total de Nanog y Dnmt3b relativa al control se superpone a la clasificación de inhibidores y se somete a un corte de 0,5x, para permitir la selección de inhibidores que muestren una toxicidad significativa de mESC. Los inhibidores selectivos de la quinasa que estabilizan a los naïve staTe se validan usando inmunotransferencia Nanog / Dnmt3b convencional ( Figura 3 ). Los objetivos de cinasa primaria de estos inhibidores se presentan en la Tabla 1 . También demostrar la aplicabilidad de esta pantalla para identificar los inhibidores que estabilizar el estado de cebado [ 14] . <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de trabajo para el cribado de inhibidores de quinasa que modulan la transición primitiva. MESC se trataron con una biblioteca de inhibidor de quinasa compuesto 228 a una concentración final de 1 μM. Los lisados ​​se prepararon y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa para análisis por inmunotransferencia, y se determinaron los niveles de Nanog y Dnmt3b (Figura adaptada de Williams et al., 14 ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver</a><html> Arger de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> Figura 2: Análisis de pantalla de pluripotencia con cebado naïve e identificación del inhibidor. (Superior) Representante Nanog y Dnmt3b immuno dot-blot imágenes. (Parte inferior) Se determinaron los valores de Nanog y Dnmt3b para cada inhibidor de quinasa en relación con el control de DMSO, y se determinaron las relaciones de Nanog: Dnmt3b y la señal relativa total de Nanog + Dnmt3b y los inhibidores se clasificaron en comparación con el control de DMSO. Se identificaron inhibidores que alteraban la relación de Nanog: Dnmt3b más allá de un umbral de 2 veces superior o inferior al control de DMSO como conductores de pluripotencia inocua o cebada. Se fijó un umbral de 2x por debajo del control de DMSO a inhibidores de triaje que comprometieron la supervivencia de mESC. Se destacan los inhibidores seleccionados para su posterior validación. (Figura adaptada de Williams et al., 14 ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> Figura 3: Validación de los compuestos de éxito seleccionados identificados. MESCs fueron tratados con 1 μ M AZD4547 (un inhibidor selectivo FGFR) o los inhibidores indicados identificados a partir de la pantalla en la Figura 2. Nanog: Dnmt3b niveles determinados por SDS-PAGE estándar y análisis de inmunotransferencia. Los valores numéricos de Nanog relativo: Dnmt3b y Nanog + Dnmt3b se indican en la tabla a continuación, e inhibidores que estabilizan el estado pluripotente naïve resaltado en verde. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Compuesto </td><td colspan="2"> Objetivos primarios </td><td> Otras metas </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R, DDR1, FGFR y TAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2, VEGFR3 &amp;# 160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabla 1: Compuestos de impacto seleccionados y su (s) diana (s) de cinasa primaria.

Aquí, presentamos un protocolo cuantitativo y escalable para llevar a cabo pantallas de moléculas pequeñas dirigidas para los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva.

Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

El objetivo general de este cribado es identificar inhibidores de proteínas cinasas de moléculas pequeñas que modulen la pluripotencia de las células madre embrionarias. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la señalización de células madre embrionarias mediante la identificación de nuevas vías de señalización de proteínas quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que el cribado es relativamente fácil de realizar utilizando equipos de laboratorio estándar y reactivos fácilmente disponibles.La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que la mayoría de las investigaciones sobre las vías de señalización de pluripotencia habían ignorado por completo las grandes ondas del kinoma. Prepare platos de 10 centímetros recubiertos de gelatina agregando cinco mililitros de gelatina al 0,1% en platos de 10 centímetros. Después de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos, aspire la gelatina y deje que la placa se seque durante dos minutos.A continuación, coloque cualquier línea de células madre embrionarias de ratón estándar en las placas recubiertas en un medio de células madre embrionarias de ratón estándar que contenga 100 nanogramos por mililitro de LIF marcado con GST, 10 % de suero fetal de ternero y 5 % de reemplazo de suero knockout. Cultive las células a 37 grados centígrados, 5% de CO2 y reemplace los medios todos los días. Pase las células madre embrionarias del ratón a una confluencia de alrededor del 80% cada dos días aspirando el medio y lavando con cinco mililitros de solución salina tamponada con fosfato por placa.A continuación, se añade un mililitro de tripsina EDTA por placa de células madre embrionarias de ratón e incubar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. Después de la incubación, vuelva a suspender las células tripsinizadas en cuatro mililitros de medio y centrifugue las células a 1200 RPM durante cinco minutos. Vuelva a suspender completamente el pellet de celda resultante en cinco mililitros de medio, pipeteando hacia arriba y hacia abajo para generar una suspensión de una sola celda.Cuente las células combinando una suspensión de celdas de 10 microlitros y 10 microlitros de azul de tripán. Coloque la mezcla en una cámara de conteo de células o use un hemocitómetro y un microscopio óptico. A continuación, siembre 3000 células madre embrionarias de ratón en placas de 96 pocillos recubiertas de gelatina al 0,1% en un volumen final de 100 microlitros de medio utilizando una pipeta multicanal.A continuación, aplique los inhibidores de la cinasa en una dilución de uno a 100 utilizando una pipeta multicanal. Pipetear suavemente el medio para mezclar el inhibidor y la suspensión celular. A continuación, deje que las células se asienten en una campana de cultivo de tejidos durante una hora para garantizar una distribución uniforme en la superficie de la placa.Cultive las células durante 48 horas sin cambiar el medio. Para comenzar el análisis de cribado, lave placas de células madre embrionarias de ratón de 96 pocillos en 200 microlitros de PBS utilizando un aspirador multicanal y pipetas. Después del lavado, mezcle los extractos celulares en 150 microlitros de tampón de lisis.Clariclar los extractos por centrifugación a 1500 veces G durante 30 minutos en placas de 96 pocillos con fondo en V. A continuación, inmovilice 100 microlitros de sobrenadantes en una membrana de nitrocelulosa utilizando un colector de diagrama de puntos de vacío de 96 pocillos. Seque la membrana y el tinte con 40 mililitros de Ponceau S para garantizar una transferencia consistente.Después de lavar la membrana con TBST, bloquéela en TBST más 3% de leche. A continuación, incubar la membrana en anticuerpos Nanog y Dnmt3b a una dilución de uno a 1000 en el tampón de bloqueo durante la noche. Al día siguiente, lave la membrana tres veces durante 10 minutos en TBST.A continuación, incubarlo en 30 mililitros de anticuerpos secundarios a una dilución de uno a 10.000 en tampón de bloqueo. Desarrollar la membrana utilizando un sistema digital de imágenes de inmunotransferencia. Es fundamental validar los inhibidores de cinasas identificados en el cribado mediante inmunotransferencia convencional antes de proceder.Esto ayuda a eliminar los falsos positivos antes de un análisis posterior. Analice los datos de la pantalla y valide los inhibidores como reguladores de pluripotencia de buena fe, tal como se describe en el protocolo de texto. Aquí se muestra un gráfico de puntos Nanog representativo de la pantalla realizada.Se destacan los inhibidores de control positivo que impulsan la pluripotencia cebada o ingenua. También se muestra un diagrama de puntos Dnmt3b representativo de la pantalla realizada. Se vuelven a destacar los inhibidores de control positivo que impulsan la pluripotencia cebada o ingenua.En este gráfico, los inhibidores se clasificaron para la proporción de Nanog a Dnmt3b. Se establece un umbral de proporción doble de Nanog a Dnmt3b para identificar los inhibidores que estabilizan la pluripotencia ingenua o cebada. También se proporcionan señales Nanog y Dnmt3b sumadas.Además, se anotan los inhibidores de cinasas seleccionados para su posterior validación. Aquí se muestra una validación de inmunotransferencia convencional de inhibidores de cinasas seleccionados, inmunoblots Nanog y Dnmt3b, así como se proporciona la relación Nanog a Dnmt3b y la señal total. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo identificar los inhibidores de quinasas de moléculas pequeñas que modulan la pluripotencia de las células madre embrionarias.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 72 horas si se realiza correctamente. Aunque este método puede proporcionar información sobre las vías de señalización de la quinasa que controlan la pluripotencia, también se puede aplicar a la diferenciación de células madre embrionarias y otros sistemas reguladores como los modificadores epigenéticos. Siguiendo el procedimiento, se pueden utilizar otras bibliotecas de inhibidores de moléculas pequeñas, como las dirigidas a modificadores epigenéticos, para identificar nuevos actores en la regulación de la pluripotencia.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que nuestro grupo de investigación pudiera dilucidar nuevas vías de señalización de pluripotencia. Utilizamos esta técnica para identificar un nuevo papel de la vía amplificada en la regulación de la pluripotencia.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Se describe el uso de un ensayo basado en células ES de ratón para identificar ventanas de tiempo crítico para la Wnt / β-catenina y la activación de la señal de BMP durante la inducción cardiogénico. El método ofrece una plataforma estandarizada que cuantifica la eficiencia de forma fiable cardiogénico, y es aplicable al estudio de los linajes de células.

Modificado madre embrionarias de ratón basado en células para la cuantificación de la eficiencia de inducción cardiogénico

Se describe una metodología que combina el cultivo de células automatizadas con alto contenido de imágenes para visualizar y cuantificar múltiples procesos celulares y de las estructuras, de un modo de alto rendimiento. Estos métodos pueden ayudar en la anotación más funcional de los genomas, así como identificar las redes de genes de enfermedades y los posibles objetivos farmacológicos.

Filtrado de contenido de alta en las enfermedades neurodegenerativas

Se describe un reportero de ensayo de fluorescencia para identificar rápidamente y caracterizar los genes que regulan el mantenimiento de embriones de ratón con células madre y auto-renovación.

Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de células madre pluripotentes humanas (hPSC), basados en el crecimiento de células individuales disociadas de monocapa (NCM) de tipo no colonia. Este nuevo método, que utiliza inhibidores de la quinasa asociada a Rho o la isoforma de laminina 521 (LN-521), es adecuado para producir grandes cantidades de hPSC homogéneas, la manipulación genética y el descubrimiento de fármacos.

Culturas alternativas para Pluripotentes Stem Cell Production, mantenimiento y análisis genético

Los protocolos describen dos sistemas in vitro en las pruebas de toxicidad del desarrollo (UKK y UKN1) basado en células madre embrionarias humanas y estudios transcriptoma. Los sistemas de pruebas predicen riesgo de toxicidad para el desarrollo humano, y pueden contribuir a reducir los estudios en animales, los costos y el tiempo requerido para las pruebas de seguridad química.

Humano madre pluripotentes células Basado Toxicidad para el desarrollo de ensayos de la seguridad química Detección y biología de sistemas de generación de datos

La fosforilación de proteínas es una característica central de cómo las células interpretan y responden a la información en su entorno extracelular. Aquí, presentamos un protocolo de cribado de alto rendimiento que utiliza quinasas purificadas a partir de células de mamíferos para identificar rápidamente las quinasas que fosforilan un sustrato o sustratos de interés.

Identificación de los pares quinasa-sustrato Usando selección de alto rendimiento

El protocolo presentado en este estudio se describen métodos para la monitorización en tiempo real de la progresión de la reprogramación a través de la medición cinética de marcadores de células madre pluripotentes positivas y negativas utilizando citometría de flujo análisis. El protocolo también incluye la evaluación basada en la obtención de imágenes de la morfología y la expresión del indicador o marcador durante la generación de IPSC.

Cinética Medición y visualización en tiempo real de la reprogramación somática

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Identificación de mediadores del Receptor de células T de señalización a través de la proyección de las bibliotecas del inhibidor químico

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Identificación de los sustratos de quinasa CK2 novela utilizando un enfoque bioquímico versátil

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Detección de inhibidores de la quinasa en microarrays de proteínas humanas autoensamblados

Descubre un método de cribado de alto rendimiento para identificar quinasas que regulan la pluripotencia en células madre embrionarias de ratón mediante inhibidores de pequeñas moléculas y análisis por inmunotransferencia.

Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal

Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

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