En Vitro Imágenes y cuantificación de la eficiencia de la focalización de Drogas de los análogos de GnRH marcado con fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es investigar y predecir la eficacia de los sistemas de administración de fármacos basados en GnRH en cultivos de células cancerosas humanas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia dirigida contra el cáncer, como la eficiencia con la que las células de diferentes tipos de cáncer humano absorben los medicamentos contra el cáncer dirigidos a la GnRH. La principal ventaja de este método es que utiliza nuevos análogos de GnRH marcados con fluorescencia que permiten el uso simultáneo de microscopía confocal y análisis de citometría de flujo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia contra el cáncer, ya que los receptores de GnRH están altamente expresados en varios tipos de células cancerosas, lo que permite su selección de ataques. La demostración del procedimiento estará a cargo de Bianka Gurbi, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, retire el medio cultivado de cada uno de los siete pocillos de un portaobjetos microscópico sembrado.

Luego, agregue 250 microlitros del medio completo precalentado al pocillo de control negativo y 250 microlitros del medio de tratamiento de semillas precalentado GnRH fit a cada uno de los seis pocillos restantes. Incubar el portaobjetos en una incubadora a 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco horas. Después de cinco horas de incubación, aspire el medio de cada pocillo y lave las células con 250 microlitros de PBS.

Posteriormente, agregue 250 microlitros de solución de fijación en cada pocillo e incube el portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Una vez fijadas las células, deseche la solución de fijación y lave las células con 250 microlitros de PBS. Agregue 250 microlitros de solución de sonda fluorescente de cinco micromolares preparada en PBS en cada pocillo e incube el portaobjetos a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Después de retirar la solución de sonda fluorescente, lave cuidadosamente las células dos veces con 250 microlitros de PBS. Finalmente, agregue de tres a cuatro gotas de medio de montaje en cada pocillo. Mantenga el portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se obtengan imágenes bajo un microscopio.

Retire el medio cultivado de cada uno de los cinco pocillos de un portaobjetos microscópico sembrado. A continuación, agregue 250 microlitros del medio completo precalentado al pocillo de control negativo y al segundo pocillo con las celdas sin tratar. Trate previamente las células en los tres pocillos restantes con el medio de tratamiento precalentado que contiene 10 micromolares de GnRH FITC.

Incubar el portaobjetos en una incubadora a 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono durante una hora. A continuación, retire los medios sólo de las células tratadas y lave las células con 250 microlitros del medio completo precalentado. A continuación, retire el medio de lavado.

Luego, agregue 250 microlitros del medio completo precalentado en cada uno de los tres pocillos. Incubar el portaobjetos en una incubadora a 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono durante una hora. Después de la incubación, deseche los medios de los cinco pocillos y lave las células con 250 microlitros de PBS.

A continuación, retire el PBS y fije las celdas con 250 microlitros de solución de fijación a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, deseche la solución de fijación y lave las celdas con 250 microlitros de PBS. Agregue 250 microlitros de solución de bloqueo en cada pocillo e incube el portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora.

Aspire la solución de bloqueo de cada pocillo excepto el control negativo. Después de lavar las células con 250 microlitros de PBS, agregue 250 microlitros de solución de anticuerpos primarios a cada pocillo. Incuba el portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora en un lugar oscuro.

Retire las soluciones de cada uno de los cinco pocillos y lave las celdas con 250 microlitros de PBS. A continuación, retire el PBS y añada 250 microlitros de solución de anticuerpos secundarios. Incuba el portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad.

Aspirar la solución de cada pocillo y lavar las células con 250 microlitros de PBS. Retire el PBS de lavado y luego agregue 250 microlitros de PBS que contengan cinco sondas fluorescentes micromolares en cada pocillo. Incuba el portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Retire la solución de sonda fluorescente de cada pocillo y lave cuidadosamente las celdas dos veces con 250 microlitros de PBS. Finalmente, agregue de tres a cuatro gotas de medio de montaje en cada pocillo. Mantenga el portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente hasta que se obtengan imágenes bajo un microscopio.

Obtenga imágenes de las células bajo un microscopio de escaneo láser confocal invertido. Encienda los láseres de 488 nanómetros y 633 nanómetros. Compruebe la amplificación del láser y el tamaño del orificio.

Imagine la muestra de control negativo. Optimice la señal observada para el núcleo y ajuste la señal de FITC y Alexa 546 para que esté cerca de cero. A continuación, utilizando los mismos parámetros, obtenga una imagen de las muestras tratadas.

Deseche el medio completo de los siete pocillos de una placa de cultivo sembrada. Luego, agregue un mililitro de medio completo precalentado en el pocillo de control negativo y un mililitro del medio de tratamiento precalentado en los seis pocillos restantes. Incubar la placa en una incubadora a 37 grados centígrados, cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco horas.

Después de desechar el medio de todos los pocillos, lave cuidadosamente las células dos veces con dos mililitros de PBS. Retire el PBS y luego agregue 500 microlitros de solución de tripsina EDTA en cada pocillo. Incuba la placa a 37 grados centígrados hasta que las células se desprendan, lo que tardará aproximadamente 10 minutos.

Usando un mililitro de medio completo, neutralice la tripsina en cada pocillo y agite el plato. A continuación, suspenda las células mediante un pipeteo suave. Transfiera las suspensiones a tubos FACS separados y centrifugue las muestras a 150 veces G a cuatro grados Celsius durante cuatro minutos.

Decanta los sobrenadantes cuidadosamente. Luego, agregue 500 microlitros de PBS helado en cada tubo FACS y vuelva a suspender suavemente las células. Mantenga los tubos en hielo hasta que los analice el FACS.

Se presenta el análisis de la captación de GnRH en células de carcinoma de faringe. El tratamiento de cinco horas con un micromolar de complejo fluorescente de GnRH dio como resultado una ingesta leve, pero distinguible, que se manifiesta como una señal fluorescente verde localizada en las células cancerosas de faringe. El aumento adicional de la dosis compleja condujo a una mayor absorción, lo que demuestra la dependencia de la dosis de la absorción de GnRH en las células de carcinoma de faringe.

La captación de GnRH dependiente del receptor y la distribución celular del ligando en su receptor en células de cáncer de pulmón se analizaron mediante tratamiento simultáneo con complejo fluorescente de GnRH y tinción del receptor y los núcleos de GnRH de tipo uno. Los resultados muestran que el receptor de GnRH tipo uno está asociado con la membrana celular, mientras que la proteína GnRH se internaliza en las células y permanece en su citoplasma. La captación de GnRH en células de carcinoma de faringe también se estudió mediante el análisis FACS.

Los resultados muestran que la absorción de GnRH observada cuando las células fueron tratadas con un micromolar de conjugado de GnRH aumentó fuertemente cuando la dosis aplicada a las células se incrementó a 10 micromolares. Una vez dominada, esta técnica se puede terminar en ocho horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar proteger las muestras tratadas y los tintes fluorescentes de la luz directa.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como los ensayos de viabilidad celular o de apoptosis, para responder a preguntas adicionales, como la eficacia con la que el fármaco dirigido a la GnRH puede inhibir el crecimiento de un determinado tipo de cáncer. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia contra el cáncer exploraran la eficacia de los sistemas de administración de fármacos basados en GnRH en la adherencia de las células cancerosas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar estos conjugados de GnRH marcados con fluorescencia para explorar la susceptibilidad de las células cancerosas a las terapias dirigidas de GnRH.