En Vitro Imágenes y cuantificación de la eficiencia de la focalización de Drogas de los análogos de GnRH marcado con fluorescencia

El objetivo general de este procedimiento es investigar y predecir la eficacia de los sistemas de administración de fármacos basados en GnRH en cultivos celulares de cáncer humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la terapia anti-cáncer dirigida, como la eficiencia con la que las células de diferentes tipos de cáncer humano captan fármacos anti-cáncer dirigidos con GnRH. La principal ventaja de este método es que utiliza nuevos análogos de GnRH marcados con fluorescencia que permiten el uso simultáneo de microscopía confocal y análisis de citometría de flujo.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia contra el cáncer porque los receptores de GnRH se expresan altamente en varios tipos de células cancerosas, lo que permite su targeting selectivo. Bianka Gurbi, una estudiante de doctorado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Para comenzar, retire el medio cultivado de cada uno de los siete pozos de una laminilla microscópica sembrada.

Luego, agregue 250 microlitros del medio completo precalentado al pocillo del control negativo y 250 microlitros del medio de tratamiento con semillas de GnRH ajustado a cada uno de los seis pocillos restantes. Incube la placa en un incubador a 37 grados Celsius, cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco horas. Después de cinco horas de incubación, aspire el medio de cada pocillo y lave las células con 250 microlitros de PBS.

A continuación, agregue 250 microlitros de solución fijadora en cada pocillo e incube la lámina a temperatura ambiente durante 10 minutos. Una vez que las células estén fijadas, deseche la solución fijadora y lave las células con 250 microlitros de PBS. Agregue 250 microlitros de solución de sonda fluorescente de cinco micromoles por litro preparada en PBS en cada pocillo e incube la lámina a temperatura ambiente durante 10 minutos.

Después de eliminar la solución del marcador fluorescente, lave cuidadosamente las células dos veces con 250 microlitros de PBS. Finalmente, agregue de tres a cuatro gotas de medio de montaje en cada pocillo. Mantenga el portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente hasta su observación bajo el microscopio.

Retire el medio cultivado de cada uno de los cinco pocillos de una placa microscópica sembrada. A continuación, agregue 250 microlitros del medio completo precalentado al pocillo del control negativo y al segundo pocillo con células no tratadas. Pretrate las células en los tres pocillos restantes con los medios de tratamiento precalentados que contienen 10 micromoles de GnRH marcado con FITC.

Incube el portaobjetos en una incubadora a 37 grados Celsius, cinco por ciento de dióxido de carbono durante una hora. Posteriormente, retire solo el medio de las células tratadas y lave las células con 250 microlitros del medio completo precalentado. A continuación, retire el medio de lavado.

Luego, agregue 250 microlitros del medio completo precalentado en cada uno de los tres pozos. Incube la placa en una incubadora a 37 grados Celsius, cinco por ciento de dióxido de carbono durante una hora. Después de la incubación, deseche el medio de los cinco pozos y lave las células con 250 microlitros de PBS.

A continuación, retire el PBS y fije las células con 250 microlitros de solución fijadora a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, deseche la solución fijadora y lave las células con 250 microlitros de PBS. Añada 250 microlitros de solución bloqueante a cada pocillo e incube la preparación a temperatura ambiente durante una hora.

Aspire la solución bloqueante de cada pozo excepto del control negativo. Después de lavar las células con 250 microlitros de PBS, agregue 250 microlitros de solución de anticuerpo primario a cada pozo. Incube la preparación a temperatura ambiente durante una hora en un lugar oscuro.

Retire las soluciones de cada uno de los cinco pocillos y lave las células con 250 microlitros de PBS. Luego, retire el PBS y agregue 250 microlitros de solución de anticuerpo secundario. Incube el portaobjetos a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad.

Aspire la solución de cada pocillo y lave las células con 250 microlitros de PBS. Elimine el PBS de lavado y luego agregue 250 microlitros de PBS que contenga la sonda fluorescente a cinco micromoles por litro en cada pocillo. Incube el portaobjetos durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Retire la solución del marcador fluorescente de cada pocillo y lave cuidadosamente las células dos veces con 250 microlitros de PBS. Finalmente, agregue de tres a cuatro gotas de medio de montaje en cada pocillo. Mantenga el portaobjetos en la oscuridad a temperatura ambiente hasta su observación bajo el microscopio.

Obtenga imágenes de las células mediante un microscopio confocal láser invertido. Encienda los láseres de 488 nanómetros y de 633 nanómetros. Verifique la amplificación del láser y el tamaño del diafragma.

Imagene la muestra de control negativo. Optimice la señal observada para el núcleo y ajuste la señal de FITC y Alexa 546 para que esté cercana a cero. Luego, utilizando los mismos parámetros, obtenga imágenes de las muestras tratadas.

Deseche el medio completo de las siete hendiduras de una placa de cultivo sembrada. A continuación, agregue un mililitro de medio completo precalentado en la hendidura del control negativo y un mililitro de los medios de tratamiento precalentados en las seis hendiduras restantes. Incube la placa en una incubadora a 37 grados Celsius, cinco por ciento de dióxido de carbono durante cinco horas.

Después de desechar el medio de todos los pocillos, lave cuidadosamente las células dos veces con dos mililitros de PBS. Retire el PBS y luego agregue 500 microlitros de solución de tripsina-EDTA en cada pocillo. Incube la placa a 37 grados Celsius hasta que las células se desprendan, lo que tomará aproximadamente 10 minutos.

Neutralice la tripsina en cada pocillo utilizando un mililitro de medio completo y agite la placa. Posteriormente, suspenda las células mediante pipeteo suave. Transfiera las suspensiones a tubos FACS separados y centrifugue las muestras a 150 × g a cuatro grados Celsius durante cuatro minutos.

Decante cuidadosamente los sobrenadantes. Luego, agregue 500 microlitros de PBS frío con hielo en cada tubo FACS y resuspenda suavemente las células. Mantenga los tubos en hielo hasta que se analicen por FACS.

Se presenta aquí el análisis de la captación de GnRH en células de carcinoma de faringe. Un tratamiento de cinco horas con un micromolar del complejo fluorescente de GnRH resultó en una entrada leve, pero distinguible, manifestada como una señal fluorescente verde localizada en las células de cáncer de faringe. Un aumento adicional de la dosis del complejo condujo a una captación potenciada, demostrando la dependencia de la dosis en la captación de GnRH en células de carcinoma de faringe.

La absorción dependiente del receptor de GnRH y la distribución celular del ligando en su receptor en células de cáncer de pulmón se analizaron mediante tratamiento simultáneo con un complejo fluorescente de GnRH y tinción del receptor de GnRH tipo uno y los núcleos. Los resultados muestran que el receptor de GnRH tipo uno se asocia con la membrana celular, mientras que la proteína GnRH se internaliza en las células y permanece en su citoplasma. La absorción de GnRH en células de carcinoma de faringe también se estudió mediante análisis FACS.

Los resultados muestran que la absorción de GnRH observada cuando las células fueron tratadas con un micromolar de conjugado de GnRH se vio fuertemente potenciada cuando la dosis aplicada a las células aumentó a 10 micromolares. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en ocho horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar proteger las muestras tratadas y los colorantes fluorescentes de la luz directa.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como ensayos de viabilidad celular o de apoptosis para responder preguntas adicionales, tales como qué tan eficazmente el fármaco dirigido a la GnRH puede inhibir el crecimiento de un tipo determinado de cáncer. Tras este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia contra el cáncer exploraran la eficacia de los sistemas de administración de fármacos basados en GnRH en células cancerosas adheridas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar estos conjugados de GnRH marcados con fluorescencia para explorar la susceptibilidad de las células cancerosas frente a terapias dirigidas a la GnRH.