Name: El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprende a usar el sistema WinCF para estudiar la microbiología pulmonar en fibrosis quística. Este método simula bronquios obstruidos por moco y permite manipular condiciones químicas para investigar comunidades microbianas en enfermedades respiratorias crónicas.

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Los autores desean agradecer a Vertex Pharmaceuticals y al Premio a la Innovación en Investigación de la Fibrosis Quística por financiar a R. Quinn y al NIH / NIAID por la subvención 1 U01 AI124316-01, un enfoque de biología de sistemas para el tratamiento de patógenos resistentes a múltiples fármacos. También queremos agradecer al Departamento de Ingeniería Mecánica y Aeroespacial del curso de diseño superior de ingeniería mecánica de UCSD para facilitar la colaboración con los aspectos de ingeniería de este trabajo.

1. Preparación de existencias para el medio de esputo artificial <ol><li> Crear una solución de mucina al 5%. Añadir 1,0 g de mucina estomacal deshidratada de cerdo a 20 ml de agua desionizada. Autoclave la solución resultante. NOTA: La esterilización de la mucina destruirá su estructura inherente; Otros métodos para esterilizar la mucina en su forma seca incluyen esterilización UV e irradiación. Sin embargo, estos métodos no se han utilizado ampliamente para el sistema WinCF. </li><li> Añadir 2,2 g de KCl a 50 ml de agua desionizada y permitir la disolución. Añadir 5,0 g de NaCl a 50 ml de agua desionizada y permitir la disolución. Autoclave estas dos soluciones. </li><li> Añadir 100 mg de ADN de esperma de salmón a 10 ml de agua estéril desionizada. Calentar esta solución a unos 85 ° C en un baño de agua durante unas horas para asegurar la disolución. </li><li> Añadir 5,0 mg de ferritina a 5,0 ml de agua desionizada estéril. </li></ol> 2. Preparación del medio de esputo artificial <ol><li> CombinarLos siguientes componentes: 16 ml de solución madre de mucina, 2,0 ml de solución madre de KCl, 2,0 ml de solución madre de NaCl, 200 μl de emulsión de yema de huevo, 5,6 ml de solución madre de ADN, 120 μl de solución madre de ferritina, 5,78 ml de solución madre esencial Aminoácido, 5,78 ml de solución de aminoácidos no esenciales y 2,44 ml de agua estéril. <ol><li> Si aparecen pequeñas cantidades de sedimento, agite suavemente para mezclar. </li><li> Pipetee 5,0 mL de medio en ocho tubos de centrifugación estériles de 15 mL. NOTA: Las condiciones químicas de cada tubo pueden ser manipuladas como se desee. Por ejemplo, se pueden añadir soluciones tampón e indicadores de pH a cada tubo con el fin de comparar el comportamiento microbiano a distintos niveles de pH. Una demostración de esto se muestra en la sección de resultados representativos con 8 niveles de pH distintos, de 5,0 a 8,5 en 0,5 incrementos de pH. </li></ol></li><li> Una vez que las condiciones químicas de los medios se manipulan con éxito, congelar para su uso posterior. Los medios permanecerán establesZen a -20 ° C durante varios meses. Vórtice al descongelar. </li></ol> 3. Preparación de un recorrido de control de los tubos capilares <ol><li> En una biopsia estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles con 250 μl de medio cada uno. </li><li> Adquiera ocho tubos de centrífuga más estériles de 15 ml, correspondiendo cada tubo a un tubo de microcentrífuga mencionado en el paso 3.1. <ol><li> Esterilizar una toalla de papel con solución de etanol al 70% y dejar secar. Una vez seco, lágrima la toalla en pedazos alrededor de cuatro pulgadas cuadradas cada uno, y arrugue cada pieza en el fondo de un tubo de centrífuga de 15 ml. Para tubos adicionales, rocíe y seque las toallas de papel adicionales según sea necesario. </li><li> Con un manojo de papel en la parte inferior de cada tubo de centrífuga, humedezca ligeramente cada capa de papel con aproximadamente 1,0 ml de agua estéril para crear un ambiente húmedo. </li></ol></li><li> Obtener tres tubos capilares de vidrio para cada tubo de microcentrífuga preparado en el paso 3.1 y un bloque de tubo capilar seala sealaNuevo Testamento. </li><li> Para cada tubo de microcentrífuga, llene tres tubos capilares con medios a unos 5 mm del marcador azul cerca de la parte superior del tubo. <ol><li> Llene con un extremo del tubo en el tubo de microcentrífuga e inclínelo hacia la orientación horizontal, permitiendo que la acción capilar guíe el medio dentro del tubo (ver Figura 1 ). </li><li> Detenga el relleno colocando suavemente un dedo enguantado sobre el extremo abierto del tubo y, a continuación, cierre el otro extremo del tubo presionándolo hacia abajo en el bloque de sellador. </li></ol></li><li></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig1.jpg" /> Figura 1: Ejemplo de gradiente de pH, tubo capilar de relleno con medio de esputo artificial. El medio se añade insertando un extremo del tubo en el líquido e inclinándolo para facilitar la acción capilar. La coloración media en este ejemplo se debe al indicador de pH añadido para ayudar al demonioLos cambios potenciales en la acidez después de la incubación. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="5"><li> Coloque cada conjunto de tres tubos capilares en tubos de centrífuga de 15 mL llenos de toallas de papel completamente humedecidas con agua estéril, con el lado sellado con masilla. Tape el tubo y la etiqueta. Estos tres tubos capilares son para la replicación de cada condición de control. </li><li> Cuando todos los tubos de centrífuga de 15 mL se llenen con sus tubos capilares designados, coloque los tubos en un soporte. Coloque la rejilla de manera que los tubos se incuban horizontalmente (para atrapar las burbujas de gas) (ver Figura 2 ). Incubar los tubos capilares en el interior de los tubos de centrífuga (que contienen los trozos de papel humedecidos) a 37 ° C durante 48 h. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig2.jpg" /> Figura 2: Ejemplo de Gradiente de pH, Tubos Capilares Listo para Incubación. Una vez que se han llenado y sellado tres tubos capilares, se colocan en un tubo de centrífuga con una toalla de papel húmeda en la parte inferior. Este tubo se tapa y se coloca en un estante. La rejilla debe estar orientada lateralmente durante la incubación, como se muestra en la imagen, de modo que se puede observar la producción de gas una vez que se ha completado la incubación. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> 4. Imágenes de los tubos capilares de control después de la incubación <ol><li> Retire la rejilla de los tubos de centrífuga de la incubadora, asegurándose de mantener los tubos horizontales. Deslice cuidadosamente los tubos capilares de los tubos de centrífuga, manteniendo cada conjunto de tres separados de otros conjuntos. </li><li> Coloque los tubos capilares uno junto al otro sobre una caja de luz, todos alineados de modo que el contenido de los tubos sean visIluminado. Deje un hueco cada tres tubos para separar diferentes condiciones químicas. </li><li> Con los tubos alineados y la caja de luz encendida, fotografíe directamente desde arriba. (Ver Figura 3 ) </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig3.jpg" /> Figura 3: Ejemplo de gradiente de pH, ensayo de control, preincubación, no se añadió esputo. Medio de esputo artificial después de ser añadido a los tubos capilares en grupos de tres, aumentando el pH de izquierda a derecha. La combinación de indicadores añadidos al medio dan como resultado que los tubos más ácidos aparezcan más amarillos, mientras que los tubos menos ácidos se vuelven más morados. Los tubos están dispuestos horizontalmente y están iluminados desde abajo, fotografiados desde arriba. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="4"><li> Deshágase delControl de materiales en residuos biológicos peligrosos. </li></ol> 5. Inoculación de los tubos capilares WinCF con una muestra de esputo <ol><li> En una biofunción estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles con 225 μl de medio cada uno. </li><li> Homogeneizar la muestra de esputo retirando y expulsando el esputo repetidamente con una jeringa de 3 ml (una jeringa de plástico sin la aguja). Haga esto hasta que el esputo sea de consistencia lisa. </li><li> Añadir 25 μl de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (dilución 1/10 en medio ASM) preparado en el paso 5.1. A continuación, vórtice los tubos durante 30 s para mezclar lo suficiente. </li><li> Añada el medio a los tubos capilares siguiendo el mismo procedimiento descrito en los pasos 3.2 a 3.5. </li></ol> 6. Imágenes de tubos capilares de muestra después de la incubación <ol><li> Después del tiempo de incubación de 48 h, retirar e imitar los tubos capilares siguiendo el mismo procedimiento que los pasos 4.1 a 4.3. </li><li> Si las burbujas están presentes en los tubos,de que las fotografías tomadas claramente representan la delimitación entre las burbujas y los medios de comunicación en los tubos. Si biopelícula está presente, asegúrese de que las fotografías pueden mostrar claramente su presencia también. </li></ol> 7. La eliminación de los medios de comunicación para aplicaciones posteriores <ol><li> Para facilitar el análisis de aguas abajo, eliminar los medios de comunicación de los tubos capilares después de formación de imágenes. Las aplicaciones potenciales incluyen el cultivo y el ADN / ARN secuenciación y perfilado metabolomic. Precaución: Los tubos capilares de vidrio llenas de agentes patógenos son un peligro biológico significativo, por lo tanto, estas medidas debe hacerse con mucho cuidado con el equipo específico. Si tubos capilares se rompen, disponer en un recipiente adecuado de riesgo biológico de objetos punzantes. </li><li> Utilice agujas extremos romos de calibre 25 y de 0,5 pulgadas de longitud para eliminar los medios de comunicación. Insertar la aguja de extremo romo en el extremo enchufado del tubo para romper el sello. </li><li> Después de romper el sello, gire el tubo capilar al revés y los medios de comunicación gotear desde la parte superior. yoSi el medio no se escurre fácilmente, use una pipeta con una punta de 200 μL y expulsar el medio del tubo presionando el émbolo de la pipeta cuando se inserta en el extremo del tubo capilar. Recoja el medio del tubo expulsado en un recipiente apropiado (tubo de centrífuga de 1,5 ml). NOTA: Para el análisis transcriptómico u otro análisis de ARN, los medios pueden ser expulsados ​​directamente a tampones estabilizadores de ARN. </li></ol> 8. El sistema WinCF FLUD NOTA: El sistema de dispositivo de carga de fluidos WinCF (FLUD) es un conjunto opcional de dispositivos complementarios diseñados para optimizar el rendimiento del sistema WinCF. El sistema WinCF FLUD se compone principalmente de materiales imprimibles en 3D. La fabricación impresa 3D permite el reemplazo rápido y fácil de los materiales para asegurar el tiempo de inactividad mínimo para los investigadores así como requisitos mínimos de la fabricación. Diseños, archivos stl, instrucciones de impresión en 3D y el manual WinCF FLUD están disponibles en el suplemento en líneaNuevo Testamento. <ol><li> Preparación de medios para la carga de tubos capilares <ol><li> En una biofundidad estéril, llenar ocho tubos de microcentrífuga estériles de 2 mL con 900 μl de medio cada uno. </li><li> Homogeneizar cualquier muestra de esputo retirando y expulsando el esputo repetidamente con una jeringa de 3 ml (una jeringa de plástico sin la aguja). Haga esto hasta que el esputo sea de consistencia lisa. </li><li> Añadir 100 μl de esputo homogeneizado a cada tubo de microcentrífuga (dilución 1/10 en medio) preparado en el paso 8.1.1. A continuación, vórtice los tubos durante 30 s para mezclar lo suficiente. </li><li> Introduzca los tubos de microcentrífuga llenos y abiertos en el soporte del tubo rotatorio orientado de modo que los tubos sean verticales. </li></ol></li><li> Colocación de tubos capilares <ol><li> Recuperar tres tubos capilares para cada tubo de microcentrífuga en el paso 8.1. </li><li> Introduzca tres tubos en el soporte de goma para que se alineen con los tubos de microcentrífuga en el otro extremo del aparato.Asegúrese de que los extremos marcados de los tubos estén afuera de los tubos de microcentrífuga. Coloque los tres orificios en la parte inferior de la cuna correctamente sobre los tres pernos en el soporte de la cuna. </li><li> Con los tubos capilares colocados que descansan en sus canales de guía en el aparato, coloque el tampón de goma sobre sus midsections con seguridad para evitar el cambio. (Ver Figura 4 ) </li></ol></li></ol><img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig4.jpg" /> Figura 4: El sistema FLUD completamente cargado con tubos capilares asegurados por el caucho Tamp sobre su Midsections. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="3"><li> Carga de medios en los tubos capilares <ol><li> Con cuidado use una mano para agarrar el extremo del aparato donde están los tubos capilaresADED, y utilizar la otra mano para sostener el bastidor de los rotadores en el que se cargan los tubos de microcentrífuga. </li><li> Delicadamente girar el bastidor de microcentrífuga de modo que los tubos de microcentrífuga son casi horizontal y proceden a empujar lentamente la cremallera hacia los tubos capilares. (Ver Figura 5) </li><li> Cuando los extremos de los tubos capilares hacen contacto con los medios de comunicación en los tubos de microcentrífuga, garantizar que la acción capilar comienza inmediatamente el llenado de los tubos capilares. Para ajustar la tasa de relleno y el nivel de llenado, gire suavemente el aparato como un todo. Mientras hace esto, tenga cuidado de no derramar el material fuera de los tubos de microcentrífuga. (Ver Figura 6) </li><li> Cuando los tubos capilares se llenan a los niveles deseados, colocar el nivel de aparato sobre una superficie y cuidadosamente todavía tirar rápidamente el bastidor de tubos de microcentrífuga de los extremos de los tubos capilares para cesar el llenado. Los tubos de microcentrífuga ahora se pueden retraer todo el camino de vuelta a la posición vertical y se cerraron. </li><li> Sellar los extremos salientes de los tubos capilares pulsando un bloque sellante en cada conjunto por triplicado, sellando un conjunto a la vez hasta que todos los conjuntos están sellados. Para reducir el riesgo de contaminación, pulse una parte diferente del bloque sellante en cada conjunto por triplicado (Ver Figura 7). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig5.jpg" /> Figura 5: El Sistema Flud con medio Tubos desplegado en una orientación horizontal, listo para entrar en contacto con tubos capilares. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig6.jpg" /> Figura 6: El sistema de Flud con capilar tubos de carga con los medios de comunicación a través de la acción capilar. </strOng&gt; <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig7.jpg" /> Figura 7: Sellado de tubos capilares llenos en el sistema FLUD Un conjunto de triplicado a la vez usando un bloque de sellador. Este bloque sellante tenía plástico a lo largo de los bordes que se cortó para evitar el contacto con conjuntos triplicados vecinos durante el sellado. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="4"><li> Incubación <ol><li> Retire el tapón de goma sobre las secciones del tubo y levante la base de goma del aparato principal. Esto debe tomar todos los tubos capilares con él. Ahora coloque la cuna y los tubos en el bastidor de imágenes. Esta raCk tiene tres talones que caben en la cuna, así como pequeños canales de guía para colocar los tubos en. </li><li> Coloque el bastidor de imágenes en su totalidad en la caja de incubación de plástico transparente. Sumerja pequeñas cantidades de toallas de papel estériles en agua estéril y colóquelas a lo largo de los dos lados más cortos de la caja para proporcionar humedad durante la incubación. (Ver Figura 8 ) </li><li> Cierre la caja completamente y colóquela en una incubadora a 37 ° C, asegurándose de mantener los tubos horizontales. Incubar durante 48 h. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55532/55532fig8.jpg" /> Figura 8: Tubos capilares en la cuna de goma transferida del sistema FLUD a un estante de imagen, que se ha colocado en una caja de incubación transparente junto a las toallas de papel húmedas para proporcionar humedad. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55532/55532fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de</a>es figura. <ol start="5"><li> De imágenes y extracción <ol><li> Retire la rejilla de imágenes que sostiene los tubos de la caja de incubación y la puso en una caja de luz, iluminada desde abajo. Con ya los tubos en el bastidor de formación de imágenes, los conjuntos por triplicado estarán debidamente espaciados y dispuestos a imagen inmediatamente. </li><li> Enfoque la cámara en los tubos de tal manera que todos son visibles en el campo de visión y la luz de la caja de luz proporciona un contraste suficiente y visualización del color en los tintes de tubo. Fotografía directamente desde arriba. </li><li> Para extraer los contenidos de los tubos, retirar los tubos capilares de la goma base un conjunto de triplicados a la vez. levante suavemente los tubos hacia arriba y fuera de la cuna o deslice hacia fuera. </li><li> Para cada conjunto de triplicados, siga el procedimiento de extracción se detalla en los pasos 7.1 a 7.3. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

La composición microbiológica de un pulmón con CF contiene una gran variedad de organismos, pero las condiciones dentro del pulmón probablemente tienen una influencia significativa sobre qué tipos de microbios pueden sobrevivir y prosperar [ 13 , 15] . Los mecanismos específicos a través de los cuales estas condiciones cambian y los efectos exactos que tienen en el microbioma pulmonar son generalmente poco claros en la actualidad. En este método experimental, se...

El método descrito en este manuscrito se llama el sistema WinCF 1. El objetivo general de WinCF es proporcionar un montaje experimental capaz de simular el ambiente de un bronquiolo de pulmón lleno de moco. Esto permitirá un sistema tratable para estudiar los patógenos microbianos de las enfermedades pulmonares con un fenotipo hipersecreción mucosa incluyendo la fibrosis quística (FQ), la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma y otros. El procedimiento fue diseñado específicamente para el estudio de CF, que se caracteriza por mutaciones que causan las secreciones pulmonares a convertirse espeso y difícil de limpiar, con el tiempo de llenado bronquiolos y otros pasos de pequeñas con mucosidad 2. Tales bloqueos en el pulmón inhiben el intercambio de gas, porque el aire inhalado ya no es capaz de alcanzar muchas alvéolos y también proporcionar un hábitat para la colonización bacteriana 3, 4. La incapacidad para prevenir el crecimiento microbiano en elExcesivo moco pulmonar eventualmente conduce al desarrollo de complejas infecciones crónicas de las vías respiratorias. Estas comunidades contienen una variedad de organismos, incluyendo virus, hongos y bacterias como Pseudomonas aeruginosa , que interactúan entre sí 5 , 6 , 7 , 8 . Se cree que la actividad del microbioma pulmonar de la FQ está implicada en brotes de síntomas llamados exacerbaciones pulmonares 1 , 9 , 10 , 11 . WinCF permite estudiar el comportamiento de la comunidad microbiana en torno a estas exacerbaciones y ahora se está expandiendo para actuar como un sistema experimental base para estudiar la ecología microbiana pulmonar. Tradicionalmente, las exacerbaciones se han estudiado a través del análisis directo de muestras tomadas del pulmón. Muchos factores de confusión hacen que el análisis directo de microbios bEl comportamiento en los pulmones desafiante, con el sistema WinCF, muchos de estos factores se eliminan y el comportamiento del microbioma pulmonar se puede estudiar más directamente, lo que permite un análisis más fino de la actividad bacteriana en un mucosidad taponada bronquiolos. El sistema WinCF proporciona un método para crecer y analizar las bacterias de una manera que imita eficazmente el ambiente pulmonar. Los métodos tradicionales para el cultivo de bacterias pulmonares a menudo implicaban el cultivo de muestras en placas de agar tradicionales. Estos métodos dejan las muestras abiertas al oxígeno atmosférico, dejando de lado las condiciones hipóxicas ya menudo anóxicas encontradas en los bronquiolos pulmonares taponados con moco 12 , 13 . El cultivo en agar bajo condiciones aeróbicas no es nada como el ambiente del pulmón de la FQ y puede inducir a error a los clínicos e investigadores sobre el comportamiento de los patógenos que tratan de tratar. Además, los nutrientes disponibles para las bacterias en placas de agarSon disímiles a los disponibles en el esputo real, que se explica en WinCF utilizando medios de esputo artificiales (ASM). Como se muestra por los cultivos de Pseudomonas en Sriramulu et al. 14 , ASM incluye un conjunto específico de componentes que imita los recursos disponibles para los microbios de esputo y también reproduce la consistencia física del esputo. Debido a que un pulmón enfermo tiene un microbioma específico, el estudio de tales microorganismos debería tener lugar idealmente en las condiciones específicas del pulmón también. El sistema WinCF permite un análisis rápido y una fácil manipulación de las condiciones experimentales para observar cambios microbianos similares a cómo ocurrirían en un bronquio pulmonar real. Esta técnica permite la inoculación de una miríada de tipos de muestras relacionadas incluyendo esputo, saliva, otras secreciones corporales y cultivos bacterianos puros o mixtos. La naturaleza de la configuración experimental permite la interpretación visual inmediata deel comportamiento de la comunidad microbiana y está diseñado para permitir una fácil aplicación aguas abajo de una multitud de procedimientos microbiológicos y ómicas. Tales estudios son importantes porque bacterianas cambios en la composición de la comunidad basados ​​en las condiciones fisicoquímicas de su entorno. Con WinCF las condiciones químicas de los medios de comunicación pueden ser manipulados para analizar los efectos sobre la actividad bacteriana. Por ejemplo, la acidez de los medios de comunicación puede ser alterada antes de la inoculación con una muestra. Después de la incubación, la actividad bacteriana en cada una de estas condiciones puede ser comparado directamente, y se pueden sacar conclusiones acerca de cómo las bacterias en las muestras de esputo se comportan en respuesta a la variación del pH. A continuación, describimos los procedimientos de aplicación del sistema de WinCF y ejemplos de cómo la química de los medios puede ser manipulado para estudiar los efectos sobre el microbioma de pulmón.

<table><tbody><tr><td>Tubos capilares codificados por colores</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-260943</td><td></td></tr><tr><td>Compuesto de sellado de tubos Cha-seal</td><td>Kimble-Chase</td><td>43510</td><td></td></tr><tr><td>Mucina de estómago porcino</td><td>Sigma</td><td>M1778</td><td></td></tr><tr><td>Ferritina, catiónica de bazo de caballo</td><td>Sigma</td><td>F7879</td><td></td></tr><tr><td>ADN de esperma de salmón Sal de sodio (sonificada)</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A2159</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos No Esenciales</td><td>Corning cellgro</td><td>25-025-CI</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos</td><td>Cellgro</td><td>25-030-CI</td><td></td></tr><tr><td>Emulsión de yema de huevo, 50%</td><td>Dalynn Biologicals</td><td>VE30-100</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2157500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Fisher</td><td>S271500</td><td></td></tr> <tr><td>ScientificTubos de centrífuga de 15 mL con graduaciones impresas y tapas planas</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga de 50 mL con graduaciones impresas y tapas planas</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>Corning</td><td>MCT-150-R</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 2,0 mL</td><td>Corning</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr></tbody></table>

el modelo de wincf - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Muchas enfermedades crónicas de las vías respiratorias resultan en el taponamiento de moco de las vías respiratorias. Los pulmones de un individuo con fibrosis quística son un caso ejemplar en el que sus bronquiolos taponados con moco crean un hábitat favorable para la colonización microbiana. Varios patógenos prosperan en este entorno interactuando entre sí y conduciendo muchos de los síntomas asociados con la enfermedad de los FQ. Como cualquier comunidad microbiana, las condiciones químicas de su hábitat tienen un impacto significativo en la estructura y dinámica de la comunidad. Por ejemplo, diferentes microorganismos prosperan en diferentes niveles de oxígeno u otras concentraciones de soluto. Esto también es cierto en el pulmón de la FQ, donde se cree que las concentraciones de oxígeno impulsan la fisiología y la estructura de la comunidad. Los métodos descritos aquí están diseñados para imitar el entorno pulmonar y producir patógenos de una manera más similar a la de la que causan la enfermedad. La manipulación del entorno químico de estos microbios se utiliza entonces para estudiar cómo el chemistry de infecciones pulmonares gobierna su ecología microbiana. El método, llamado el sistema WinCF, se basa en medio esputo artificial y tubos capilares estrechos destinados a proporcionar un gradiente de oxígeno similar a la que existe en los bronquiolos moco enchufado. La manipulación de las condiciones químicas, tales como el pH del medio del esputo o antibióticos presión, permite la visualización de las diferencias microbiológicos en estas muestras usando indicadores de color, en busca de la producción de gas o biofilm, o de la extracción y secuenciación de los contenidos de ácido nucleico de cada muestra.

crecimiento microbiológico a través de las diversas condiciones químicas inducidas dentro de las muestras varió dramáticamente en algunos casos y de manera más sutil en otros. Muchos cambios en la actividad fueron visual en la naturaleza, siendo fácilmente evidentes tan pronto como el período de incubación terminó. En el ejemplo de la manipulación del pH, las muestras de todo el espectro pH variaron en gran medida como se muestra por múltiples factores que se hicieron evidentes después d...

El moco enchufado vías respiratorias de la fibrosis quística (FQ) son un ambiente ideal para los patógenos microbianos para prosperar. El manuscrito describe un nuevo método para el estudio de la microbioma CF pulmón en un entorno que imita donde causan enfermedad y cómo alteraciones de condiciones químicas pueden conducir dinámica microbianas.

El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...

El objetivo general de este procedimiento es imitar el entorno pulmonar y cultivar patógenos de una manera más similar a aquella en la que causan enfermedad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología de las vías respiratorias, como, por ejemplo, cómo interactúan patógenos bacterianos diversos en un pulmón con fibrosis quística. La principal ventaja de esta técnica es que permite una manipulación sencilla de las condiciones experimentales.Para observar respuestas microbianas similares a las que ocurrirían en un bronquio pulmonar real. Quien demostrará el procedimiento será Will Comstock de nuestro laboratorio. Para preparar el medio artificial de esputo, combine 16 mililitros de solución stock de muceína previamente preparada, dos mililitros de solución stock de cloruro de potasio, dos mililitros de solución stock de cloruro de sodio, 200 microlitros de emulsión de yema de huevo, 5,6 mililitros de solución stock de ADN, 120 microlitros de solución stock de ferritina, 5,78 mililitros de solución de aminoácidos esenciales, 5,78 mililitros de solución de aminoácidos no esenciales y 2,44 mililitros de agua estéril.La creación cuidadosa de un medio artificial estéril de esputo es extremadamente importante. Dado que cualquier contaminación puede alterar la actividad bacteriana en los tubos capilares incubados, más adelante. Después de agitar suavemente para mezclar, pipetee cinco mililitros del medio en ocho tubos estériles de centrífuga de 15 mililitros.El medio puede modificarse ahora para lograr las condiciones químicas deseadas. Por ejemplo, a los medios mostrados aquí se les ha alterado el pH y se les han añadido colorantes para reflejar sus diferentes acididades. A continuación, bajo una campana de flujo laminar estéril, añada 900 microlitros de medio a cada uno de ocho tubos estériles de microcentrifugado de 1,5 mililitros.Homogenice las muestras de esputo previamente obtenidas utilizando una jeringa de tres mililitros para extraer y expulsar repetidamente el esputo hasta que adquiera una consistencia uniforme. Añada 100 microlitros del esputo homogeneizado a cada uno de los ocho tubos de microcentrifugado. Luego, vortexe los tubos para mezclarlos adecuadamente.Etiquete ocho tubos estériles más de centrífuga de 15 mililitros según los tubos microcentrífuga con medio previamente preparados. Estos serán los tubos de incubación. Utilice solución de etanol al 70 % para esterilizar una toalla de papel y déjela secar.Rompa la toalla en trozos de aproximadamente cuatro pulgadas cuadradas cada uno. Luego, desmenuce un trozo en el fondo de cada tubo de incubación. Con un mechón de papel en el fondo de cada tubo de incubación, use 1 mililitro de agua estéril para humedecer ligeramente cada mechón y crear un ambiente húmedo dentro del tubo.Para cada tubo de medio, llene tres tubos capilares de vidrio con medio sosteniendo un extremo del tubo en el medio y colocándolo horizontalmente para inclinarlo. Permita que la acción capilar guíe el medio hacia el interior del tubo. Detenga el llenado colocando suavemente un dedo enguantado sobre el extremo abierto del tubo, y luego selle el otro extremo del tubo presionándolo contra un bloque de masilla selladora capilar.Coloque cada conjunto de tres tubos capilares en tubos de incubación de 15 mililitros, con el extremo sellado con masilla hacia abajo. Luego, tape los tubos y asegúrese de que estén etiquetados. Estos tres tubos capilares son para la replicación de cada condición de control.Cuando todos los tubos de incubación estén llenos con sus tubos capilares designados, coloque las rejillas a 37 grados Celsius de manera que los tubos se incuben en posición horizontal para que cualquier gas generado no escape por el extremo abierto. Incube los tubos durante 48 horas.Retire los tubos del incubador asegurándose de mantenerlos horizontales. Saque cuidadosamente los tubos capilares de los tubos de incubación, manteniendo cada conjunto de tres separado de los demás conjuntos. Coloque los tubos capilares uno al lado del otro sobre una caja luminosa, alineándolos de manera que el contenido de los tubos sea visible e iluminado desde abajo.Tejer un espacio cada tres tubos para separar diferentes condiciones químicas. A continuación, enfoque la cámara directamente sobre los tubos de manera que todos los tubos sean visibles en el campo de visión y la luz procedente de la caja de luz proporcione un contraste suficiente y una visualización clara del color de los colorantes en los tubos. Para extraer el contenido de los tubos para análisis posteriores, retire un conjunto de capilares triplicados de la caja de luz a la vez. Introduzca una aguja roma de calibre 25 y 0,5 pulgadas en el extremo tapado del tubo capilar para romper el sello.Luego, invierta el tubo capilar para permitir que el medio gotee desde la parte superior hacia un tubo microcentrífugo de 1.5 mililitros. Si el medio no gotea, utilice una pipeta de 200 microlitros para expulsar el medio del tubo presionando el émbolo de la pipeta cuando esté insertado en el extremo del tubo capilar. Como se muestra aquí, cuando no se agregaron muestras de esputo al medio, el único cambio observado a lo largo del espectro de pH después de 48 horas de incubación fue una ligera disminución del volumen del medio debido a una evaporación mínima.Los tubos capilares inoculados mostraron cambios en el volumen, aparición de burbujas de gas, alteración del color y formación de depósitos opacos. Estos resultados indican que las bacterias y otros microorganismos presentes en el esputo agregado son capaces de crecer y cambiar dentro del medio artificial. Tras la incubación, se pueden realizar otros métodos como metabolómica y secuenciación de ADN para responder preguntas adicionales sobre el comportamiento de los microorganismos que crecen en los tubos capilares.El sistema winCF es un método novedoso para estudiar la actividad del microbioma pulmonar; importante para muchas enfermedades, incluidas la fibrosis quística, la EPOC, el asma y otras.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Nielsen, T. B., et al., Modelo de aspiración orofaríngea murina de neumonía bacteriana asociada a ventiladores y adquirida en hospital. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo muestra el procedimiento de introducir bacterias a través de la orofaringe hasta los pulmones de un ratón anestesiado para inducir una infección pulmonar y desencadenar una respuesta inmune.

Preparación de un modelo de aspiración orofaríngea murina para establecer infecciones bacterianas pulmonares

Source: Montefusco-Pereira, C. V. et al. P. aeruginosa Infected 3D Co-Culture of Bronchial Epithelial Cells and Macrophages at Air-Liquid Interface for Preclinical Evaluation of Anti-Infectives. J. Vis. Exp.(2020)This video demonstrates a co-culture model of bronchial epithelial cells and macrophage-like cells at the air-liquid interface to study host-pathogen interactions. Pathogenic bacterial infection compromises epithelial membrane integrity, triggering macrophage-like cell activation and...

Establishing a Co-Culture Model to Study Host-Pathogen Interactions at the Air-Liquid Interface

Este video describe el protocolo para desarrollar un modelo de pulmón de cerdo ex vivo de biofilm bacteriano en tejido bronquiolar infectado. Las biopelículas son agregados bacterianos incrustados en una matriz adherida a una superficie. Este modelo se utiliza para estudiar la susceptibilidad antibiótica de las bacterias en diferentes etapas de la formación de la biopelícula.

Modelo de biopelícula pulmonar de cerdo ex vivo: una técnica para desarrollar un modelo pulmonar para estudiar biopelículas bacterianas en tejido bronquiolar de cerdo

Mientras que el estudio in vitro de las interacciones huésped-patógeno permite la caracterización de respuestas inmunes específicas, se requieren modelos in vivo para observar los efectos de respuestas complejas. Utilizando la exposición a Candida albicans seguida de una infección pulmonar mediada por Pseudomonas aeruginosa, establecimos un modelo murino de interacciones microbianas implicadas en la patogenicidad de la neumonía asociada a la ventilación.

El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Se utilizó la litografía blanda para producir un modelo representativo a escala real de las vías respiratorias alveoladas pulmonares que se expanden y contraen periódicamente, imitando el movimiento fisiológico de la respiración. Esta plataforma recrea los flujos de acinares respiratorios en un chip, y se prevé que facilite la investigación experimental de la dinámica de los aerosoles inhalados y la deposición en el acino pulmonar.

Un modelo de microfluidos de biomiméticamente respiración pulmonar acinar Airways

Neumonía infecciosa está entre las infecciones más comunes en humanos. Un modelo apropiado en vivo es fundamental para entender la patogénesis de la enfermedad y prueba la eficacia de la terapéutica de la novela. Con este modelo de neumonía murina aspiración orofaríngea, uno puede examinar la patogenesia y nuevos tratamientos contra las infecciones mortales.

Modelo murino de aspiración orofaríngea de neumonía bacteriana asociada a la ventilación y adquirida en el Hospital

Describimos un protocolo para un modelo de co-cultivo tridimensional de vías respiratorias infectadas, utilizando CFBE41o- células, macrófagos THP-1, y Pseudomonas aeruginosa, establecido en la interfaz aire-líquido. Este modelo proporciona una nueva plataforma para probar simultáneamente la eficacia de los antibióticos, la función de barrera epitelial y los marcadores inflamatorios.

P. aeruginosa Co-cultivo 3D infectado de células epiteliales bronquiales y macrófagos en la interfaz aire-líquido para la evaluación preclínica de los antiinfecciosos

Este manuscrito describe el establecimiento de un modelo infeccioso de neumonía en ratones y la respectiva caracterización de la resolución de lesiones junto con métodos para el crecimiento de bacterias y la instilación intratraqueal. También se describe un enfoque novedoso que utiliza citometría de flujo de alta dimensión para evaluar el panorama inmunitario.

Modelo experimental para evaluar la resolución de la neumonía

Los modelos de pulmón en chip superan a los cultivos 2D tradicionales al imitar la interfaz aire-líquido y la perfusión de células endoteliales, simulando el flujo sanguíneo y el intercambio de nutrientes cruciales para los estudios de fisiología pulmonar. Esto aumenta la relevancia de la investigación pulmonar, ya que ofrece un entorno dinámico y fisiológicamente preciso para avanzar en la comprensión y el tratamiento de las infecciones respiratorias.

Modelo de alvéolo en chip inmunocompetente para el estudio de las respuestas inmunitarias de la mucosa alveolar

Este protocolo describe un modelo de biopelícula polimicrobiana de cuatro especies relevante para los pulmones con fibrosis quística (FQ) que se puede utilizar para explorar el impacto de las interacciones bacterianas entre especies.

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Esta metodología permite el establecimiento de un modelo de biofilm polimicrobiano en fibrosis quística para pruebas de sensibilidad antimicrobiana en laboratorios clínicos y de investigación. Este modelo proporciona resultados precisos y fiables en una amplia gama de salidas.

Desarrollo de un modelo de biofilm de colonias polimicrobianas para probar antimicrobianos en la fibrosis quística

Aprende a usar el sistema WinCF para estudiar la microbiología pulmonar en fibrosis quística. Este método simula bronquios obstruidos por moco y permite manipular condiciones químicas para investigar comunidades microbianas en enfermedades respiratorias crónicas.

El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares (Video) | JoVE Journal

El modelo de WinCF - un microcosmos barato y tractable de un bronquio enchufado del moco para estudiar la microbiología de las infecciones pulmonares

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