Los protocolos para la investigación de la distribución original de los tejidos, modo de transmisión, y el efecto sobre la aptitud de un anfitrión Densovirus en el gusano de la cápsula del algodón

El objetivo general de este protocolo es estudiar el efecto de un densovirus, HaDV2, sobre su huésped, el gusano del algodón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la interacción entre el virus y el huésped, como el efecto de los virus en sus huéspedes. La principal ventaja de esta técnica que utilizan las larvas para construir cepas positivas y negativas del virus se deriva de los mismos par-ne-co-huéspedes, lo que garantiza el mismo fondo genético.

Para comenzar el experimento, ocho parejas de polillas recién encerradas se aparearon mediante el uso de una jaula de plástico por pareja cubierta con gasa de algodón para garantizar una buena ventilación y servir como sustrato de posición del óvulo. Para aumentar la probabilidad de obtener una colonia libre de virus, utilice al menos 30 pares de apareamientos de un solo par. Alimente a las polillas adultas con una bola de algodón empapada en una solución con un 10% de azúcar y un 2% de vitaminas, y reponga la solución diariamente.

El post-apareamiento de hoy, cuando las hembras adultas ponen sus huevos en la gasa de algodón, comienzan a cambiar la gasa a diario. Recoja y mantenga los huevos que contienen gasa en la misma sala de crecimiento que las polillas adultas hasta que los huevos eclosionen. Transfiera inmediatamente las larvas recién eclosionadas a nuevas placas de 24 pocillos con un individuo por pocillo.

Cinco días después de la primera fecha de puesta de huevos, recoja las polillas progenitoras y guárdelas en nitrógeno líquido. Compruebe la presencia de HaDV2 de los padres mediante PCR con cebadores específicos, y mantenga a los individuos libres de HaDV2 como la cepa no infectada libre de HaDV2. Recoja las polillas adultas individualmente y guárdelas inmediatamente en nitrógeno líquido.

Muele completamente las polillas individuales recolectadas en nitrógeno líquido usando un mortero esterilizado. Transfiera alrededor de 10 microgramos de desechos a un tubo limpio de 1.5 mililitros. Luego, transfiera los desechos restantes a un nuevo tubo y luego guárdelos inmediatamente a 80 grados centígrados.

Extraiga el ADN de los 10 microgramos de escombros siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante. Una vez que se haya aislado el ADN de la polilla, verifique si hay HaDV2 usando el protocolo. De acuerdo con los resultados, divida los residuos restantes en dos grupos: HaDV2 positivo y HaDV2 negativo.

Agregue un mililitro de solución salina tamponada con fosfato, o PBS, a cada individuo para disolver completamente los restos larvales restantes. Enfríe previamente la centrífuga cuatro grados centígrados, luego gire el homogeneizado. En hielo, filtre el sobrenadante líquido con el filtro de membrana de 0,22 micras.

Recoja 200 microlitros por tubo de los líquidos filtrados y guárdelos inmediatamente a 80 grados centígrados. Determinar la eficacia de la infección oral con líquidos filtrados infectados con HaDV2 de diferente concentración diluyendo el fluido que contiene HaDV2. En una campana extractora, distribuya uniformemente 200 microlitros de HaDV2 que contengan líquidos filtrados para cada concentración en la superficie de la dieta artificial sólida.

A continuación, comience a transferir 100 larvas recién eclosionadas a la dieta artificial que contiene HaDV2 en una placa de Petri. Golpee suavemente la gasa de algodón, incluidas las larvas recién eclosionadas, para transferir las larvas de la gasa a una hoja de papel blanco. Golpea el papel suavemente para que las larvas hilen la seda y se hinchen del papel.

Use pinzas esterilizadas para tocar la seda y mover las larvas a una placa de Petri. Después de 48 horas, transfiera una larva individual por pocillo en la dieta artificial a placas de 24 pocillos. Volver a colocar las larvas inoculadas con HaDV2, utilizando las mismas concentraciones que en la etapa adulta.

Verifique el estado de infección por HaDV2 de los adultos utilizando el protocolo. Los adultos inoculados con un número de 10 a la octava copia por microlitro de HaDV2 produjeron el 100% de la infección y se mantienen como cepa HaDV2 positiva. Para evitar la contaminación, esterilice las pinzas y las tijeras en etanol al 75% tres veces y luego caliéntelas en la llama de una lámpara de alcohol.

Utilizando una balanza analítica, pesa los tubos vacíos que se van a utilizar para almacenar los tejidos. A continuación, coloque las larvas y las polillas adultas de la cepa infectada en hielo durante aproximadamente cinco minutos. Fije las larvas congeladas en el cistosepimento usando dos alfileres de insectos insertados en las membranas intersegmentales cerca de la cabeza y el último segmento del abdomen.

Luego, en la parte posterior del abdomen, corte la pata de las larvas para que la hemolinfa fluya. Utilice una pipeta para pipetear unos 10 microlitros de hemolinfa larvaria en unos 10 segundos para evitar el pardeamiento y la coagulación de la hemolinfa. Con unas tijeras haz una incisión en la cutícula que va desde la última membrana intersegmentaria hasta la cabeza.

Con dos pinzas, diseccione el intestino anterior, el intestino medio, el intestino posterior, el cuerpo graso y los túbulos de Malpighi. Para evitar la contaminación de los tejidos restantes con la hemolinfa durante la disección, lave los tejidos disecados con tampón PBS. Mezcle muestras de tejido de tres individuos como un replicante.

Transfiera inmediatamente cada tejido a los tubos en nitrógeno líquido. En una placa de Petri limpia que contenga tampón PBS, diseccione los tejidos de los adultos femeninos y masculinos e transfiera inmediatamente cada tejido a los tubos en nitrógeno líquido. Pese los tubos y los tejidos anteriores juntos por separado y calcule la masa de los tejidos.

Extraiga el ADN de estos tejidos y realice una kPCR para cuantificar el título viral de cada tejido. Coloque al menos 100 pupas o polillas adultas recién emergidas derivadas de la cepa no infectada en una jaula de malla de alambre de 5 litros cubierta con gasa de algodón. Después de dos días, las hembras adultas apareadas comenzarán a poner huevos en la gasa de algodón.

Recoja y mantenga la gasa de algodón que contiene los huevos. Se procede a la inoculación de las larvas neonatales transfiriendo las larvas neonatas de la cepa no infectada a la dieta artificial que contiene HaDV2 para establecer la cepa infectada. Del mismo modo, transfiera las larvas neonatas a la dieta artificial cubierta con líquido filtrado libre de HaDV2 para establecer los grupos de control, la cepa no infectada.

Incluya al menos 240 larvas en cada tratamiento. Después de 48 horas, transfiera una larva individual por pocillo a placas de 24 pocillos. Numere secuencialmente cada larva en cada pozo y registre diariamente la etapa del estadio y el estado de supervivencia.

Unos cinco días después, cuando la dieta artificial se deteriora, transfiera simultáneamente a estos individuos a una nueva placa de 24 pocillos que contenga dieta artificial fresca. Pesar las larvas desde el día siete hasta el día 11 utilizando una balanza analítica. Después de pesar, devuelva individualmente las larvas a la placa de 24 pocillos.

Al mudar al quinto estadio, alrededor de diez días después de la eclosión, transfiera las larvas a tubos de vidrio. Transfiera los individuos al tubo de vidrio a la misma hora todos los días. Las larvas del quinto estadio también se pueden identificar por el ancho de la cápsula de la cabeza.

A continuación, codifique cada larva con su número de referencia original en el tubo de vidrio con pintura o marcadores. Registre diariamente el estado de las larvas. Registre las pupas y la fecha de eclosión de cada individuo en el tubo de vidrio, y registre la masa de las pupas de tres días de edad.

Después de la eclosión, coloque una hembra y un macho en una sola jaula con una solución de 10% de sacarosa y 2% de vitaminas. Reponga la solución de sacarosa todos los días. Anota la fecha de muerte de cada polilla.

Cuando se pongan los huevos, cambie la gasa de algodón todos los días. Cuente el número de huevos inmediatamente. Por último, cuente las crías recién eclosionadas mientras eclosionan.

Se ejecutaron tri-ales para asegurar la calidad de los especímenes utilizados en el experimento. Las progenies de los padres macho y hembra libres de HaDV2 se criaron como la cepa no infectada. Amplificamos con éxito el gen de la actina en los padres y la progenie utilizando la misma plantilla de ADN, lo que sugiere que las plantillas de ADN eran de buena calidad.

Las ocho progenies seleccionadas al azar también estaban libres de HaDV2, HaNPV y Wolbachia. Una curva estándar que define la relación entre el logaritmo de la calidad del material de partida y los valores de CT obtenidos muestra una fuerte correlación lineal entre los valores de CT y el logaritmo del número inicial de copias del gen HaDV2. El número de copias de HaDV2 se calculó por microgramo de cada tejido, y el porcentaje del título total de HaDV2 para el tejido específico reveló que HaDV2 se distribuía principalmente en el cuerpo graso.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar manipular las delicadas larvas durante los primeros cinco días después de que eclosionen durante el procedimiento en el neumático.