Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

El objetivo general de este experimento es evaluar los efectos de una infección bacteriana sobre la capacidad de las células hospederas para formar gránulos de estrés en respuesta a un estrés exógeno. Este método es una herramienta valiosa en el campo de la microbiología celular para determinar si un patógeno determinado es capaz de alterar o subvertir toda la vía de formación de gránulos de estrés. La principal ventaja de esta técnica es que los gránulos de estrés pueden analizarse de manera cualitativa y cuantitativa de forma rigurosa y automatizada utilizando programas gratuitos de análisis de imágenes.

Este método proporciona información sobre la dinámica de la formación y composición de los gránulos de estrés y sobre cómo estos parámetros se ven afectados por un patógeno específico. Gracias. Antes de comenzar el ensayo, inocule una colonia roja de bacterias S.flexneri M90T procedente de una placa de agar tripticasa soya al 1% con rojo de congo recién rayada en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga ocho mililitros de caldo tripticasa soya.

Después de ajustar la tapa, incubar la colonia durante la noche con agitación a 222 RPM y 30 grados Celsius. Al día siguiente, subcultivar 150 microlitros de las bacterias en ocho mililitros de caldo nutritivo tripticasa soya fresco durante aproximadamente dos horas a 37 grados Celsius y 222 RPM para iniciar la inducción en fase exponencial tardía de la expresión de genes de virulencia y para aumentar la infectividad bacteriana. Cuando la densidad óptica de la subcultura esté entre 0,6 y 0,9, transferir un mililitro de las bacterias a un tubo de 1,5 mililitros para su recolección mediante centrifugación.

Y resuspenda el precipitado en medio de infección con una densidad óptica de uno. A continuación, aspire los sobrenadantes de cada pocillo de un cultivo de cubreobjetos con células HeLa. Y lave cuidadosamente las células HeLa con 500 microlitros de medio fresco para células HeLa a temperatura ambiente por pocillo.

Sustituya el lavado con 500 microlitros de medio de infección por pocillo y centrifugue la placa de 24 pocillos para sedimentar las bacterias sobre las células. Transfiera las cocultivos bacterianos sedimentados a un incubador de cultivo celular a 37 grados Celsius durante 30 minutos para facilitar la infección de las células huésped. Al final de la incubación, elimine las bacterias exógenas de las células mediante tres lavados con un mililitro de medio de cultivo de HeLa fresco a 37 grados Celsius por cada lavado.

Luego, cubra las células infectadas con un mililitro de medio de cultivo fresco que contenga gentamicina y regrese la placa al incubador de cultivo celular. Al final de la incubación, reemplace el medio con 500 microlitros del medio de cultivo apropiado, suplementado con el agente de estrés de interés, y regrese las células al incubador de cultivo de tejidos. Después de una hora, aspire por completo el sobrenadante y fije las muestras en 0,5 mililitros de paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente en PBS durante 30 minutos.

A continuación, deseche el fijador en el recipiente de desecho adecuado y lave las laminillas con un mililitro de solución salina tamponada con tris durante dos minutos con agitación suave. Al final del lavado, aspire completamente el TBS y permeabilice las células en cada pocillo con 500 microlitros de Triton X-100 al 0,3 % en TBS. Después de 10 minutos, reemplace la solución permeabilizante con un mililitro de TBS, agite suavemente la placa y sustituya el TBS por un mililitro de solución bloqueante durante una hora a temperatura ambiente.

Para etiquetar las células con una mezcla de anticuerpos primarios de interés, coloque 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios por cubreobjetos sobre un trozo de Parafilm plástico firmemente adherido a la superficie de trabajo. Luego, use pinzas para tomar el primer cubreobjetos y seque el borde del cubreobjetos sobre un trozo de papel absorbente para eliminar el exceso de líquido.

Coloque cuidadosamente la laminilla sobre la gota e incube las laminillas bajo las condiciones adecuadas de etiquetado. Al finalizar la incubación con el anticuerpo primario, transfiera cada laminilla a un pocillo individual de una nueva placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de TBS por pocillo, y lave las células a temperatura ambiente en un agitador de placas durante cinco minutos, tres veces. Después del último lavado, marque las células de cada laminilla con la mezcla adecuada de cóctel de anticuerpos secundarios, tal como se acaba de demostrar.

Y incubar las laminillas en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación con el anticuerpo secundario, lavar las células con un mililitro de PBS tres veces en una nueva placa de 24 pocillos con agitación suave como se acaba de demostrar, pero protegido de la luz. Después del último lavado, sumergir brevemente cada laminilla en agua desionizada para eliminar la sal, secar los bordes de la laminilla sobre un papel absorbente y montar cuidadosamente las laminillas sobre cinco microlitros de medio de montaje fluorescente por portaobjetos de microscopio de vidrio sin formar burbujas.

Luego, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Y almacene las preparaciones de forma adecuada hasta la obtención de imágenes. Para obtener imágenes de las células mediante microscopía confocal de fluorescencia, comience seleccionando el objetivo adecuado y los canales fluorescentes apropiados para la adquisición de imágenes.

Luego, adquiera pilas de imágenes de las células utilizando el software de imagen adecuado. Cuando se hayan capturado todas las imágenes, utilice el software de análisis de imágenes adecuado para comprimir las pilas de imágenes y guarde las pilas como archivos TIFF. A continuación, cargue una imagen TIFF de control y una experimental en la plataforma de análisis de imágenes, y seleccione Tabla de búsqueda para abrir los parámetros del canal en la ventana de Secuencia.

Haga clic en todas las casillas de las pestañas de canal para desactivar todos los canales. Luego, haga clic en el canal cero y haga clic en la barra de color del canal cero para seleccionar el color preferido, aumentando la intensidad del canal según sea necesario para visualizar todas las estructuras. Después de seleccionar y ajustar cada uno de los canales de color apropiados para el análisis experimental, seleccione la pestaña de lienzo y ajuste la pestaña de zoom para visualizar aproximadamente 10 células por campo de visión.

Utilizando la herramienta de polígono, haga clic en la célula de interés y extienda la línea alrededor de la célula para delimitar el límite celular. Para nombrar esta región de interés, en la ventana de región de interés, haga clic con el botón derecho en la célula de interés y haga doble clic en el nombre de la región de interés para modificarlo. Después de seleccionar y nombrar todas las células de interés de la misma manera, abra la aplicación Detector de Puntos dentro de la pestaña de detección y seguimiento.

Abra la pestaña Preprocesamiento y seleccione el canal que se analizará. Dentro de la pestaña Detector, seleccione Detectar puntos brillantes sobre fondo oscuro y elija la escala y sensibilidad adecuadas. En la pestaña Región de interés, seleccione la región de interés sugerida a partir de la secuencia.

Bajo la pestaña Filtrado, seleccione SinFiltrado. En la pestaña Salida, seleccione la salida adecuada. Seleccione Eliminar puntos anteriores renderizados como regiones de interés y haga clic en ningún archivo seleccionado para seleccionar la carpeta donde se guardará el archivo.

Luego, en la pestaña Visualización, seleccione las opciones apropiadas de interés y haga clic en Iniciar Detección. Dentro del software de análisis de imágenes, se puede utilizar el detector de puntos para identificar los gránulos de estrés dentro de cada una de las regiones de interés designadas. Luego se puede generar una imagen binaria para mostrar todos los gránulos de estrés identificados.

El análisis de los gránulos de estrés debe adaptarse cuidadosamente a cada mercado de gránulos de estrés analizado. Por ejemplo, modificar el requisito de tamaño de la región de interés detectada o cambiar la sensibilidad de los parámetros de detección conduce a resultados variables. En escalas de tamaño de píxeles más grandes, los gránulos de estrés más pequeños no se contarán, y el número de gránulos de estrés disminuirá.

Si bien aumentar la sensibilidad provoca un incremento en la cantidad de gránulos de estrés. Por ejemplo, en este experimento, una escala de dos con una sensibilidad de 100 dio el mejor resultado con el marcador de gránulos de estrés G3BP1. Mientras que una escala de dos con una sensibilidad de 55 dio el mejor resultado para el marcador de gránulos de estrés EIF3B.

El área de superficie puede calcularse entonces a partir del tamaño de los gránulos de estrés. Los gráficos de distribución de frecuencia son útiles para resaltar los cambios en el tamaño de los gránulos de estrés entre diferentes poblaciones celulares. Además, la intensidad de la fluorescencia puede proporcionar información sobre la calidad de los gránulos de estrés analizados.

Una vez dominado, el ensayo de células completas puede realizarse en aproximadamente de seis a siete horas, y el análisis puede completarse en otras dos a tres horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar procesar siempre las muestras de control y las muestras experimentales al mismo tiempo y en las mismas condiciones para minimizar la variabilidad dentro de los datos. Tras seguir este procedimiento, el análisis también puede extenderse a un volumen tridimensional para obtener información adicional sobre la localización de los gránulos de estrés.

Este procedimiento semiautomatizado permite un análisis riguroso e imparcial de los gránulos de estrés en células no infectadas e infectadas. Puede revelar alteraciones previamente desconocidas en la vía de los gránulos de estrés. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo infectar células con bacterias, cómo inducir la formación de gránulos de estrés y cómo utilizar un enfoque semiautomatizado para analizar los gránulos de estrés de manera cualitativa y cuantitativa.

Y no olvide que Shigella flexneri y agentes inductores de gránulos de estrés como el clotrimazol pueden ser peligrosos, y que son necesarias precauciones como usar guantes, trabajar en un laboratorio BL2 y desechar adecuadamente todos los reactivos.