Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.

El objetivo general de este experimento es evaluar los efectos de una infección bacteriana en la capacidad de las células huésped para formar gránulos de estrés en respuesta al estrés exógeno. Este método es una herramienta valiosa en el campo de la microbiología celular para evaluar si un patógeno determinado es capaz de alterar o subvertir toda la vía de los gránulos de estrés. La principal ventaja de esta técnica es que los gránulos de tensión pueden analizarse cualitativa y cuantitativamente de forma rigurosa y automatizada utilizando programas gratuitos de análisis de imágenes.

Este método proporciona información sobre la dinámica de la formación y composición de gránulos de estrés y cómo estos parámetros se ven afectados por un patógeno específico. Gracias. Antes de comenzar el desafío, inocule una colonia de bacterias rojas S.flexneri M90T de una placa de agar rojo Congo 1% de agar de soja tríptico recién rayado en un tubo cónico de 15 mililitros, que contiene ocho mililitros de caldo de soja tríptico.

Después de apretar la tapa, incubar la colonia durante la noche agitando a 222 RPM y 30 grados centígrados. Al día siguiente, subcultivó 150 microlitros de la bacteria en ocho mililitros de caldo de soja tríptico fresco durante unas dos horas a 37 grados centígrados y 222 RPM para iniciar una fase exponencial tardía de inducción de la expresión génica de virulencia y mejorar la infectabilidad bacteriana. Cuando la densidad óptica del subcultivo esté entre 0,6 y 0,9, transfiera un mililitro de las bacterias a un tubo de 1,5 mililitros para su recolección por centrifugación.

Y vuelva a suspender el pellet en el medio de infección a una densidad óptica de uno. A continuación, aspire los sobrenadantes de cada pocillo de un cultivo de cubreobjetos de células HeLa. Y lave cuidadosamente las células HeLa con 500 microlitros de medio de células HeLa fresco a temperatura ambiente por pocillo.

Reemplace el lavado con 500 microlitros de medio de infección por pocillo y centrifugue la placa de 24 pocillos para hacer girar las bacterias en las células. Transfiera los cocultivos bacterianos asentados a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius durante 30 minutos para facilitar la infección de la célula huésped. Al final de la incubación, elimine las bacterias exógenas de las células con tres enjuagues en un mililitro de medio de cultivo HeLa fresco a 37 grados centígrados por lavado.

A continuación, cubra las células infectadas con un mililitro de medio de cultivo fresco que contenga gentamicina y devuelva la placa a la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, reemplace el medio con 500 microlitros del medio de cultivo apropiado, complementado con el factor estresante de interés, y devuelva las células a la incubadora de cultivo de tejidos. Después de una hora, aspire el sobrenadante por completo y fije las muestras en 0,5 mililitros de paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente en PBS durante 30 minutos.

A continuación, deseche el fijador en el contenedor de residuos adecuado y lave los cubreobjetos con un mililitro de solución salina tampón tris durante dos minutos agitando suavemente. Al final del lavado, aspirar completamente el TBS y permeabilizar las células de cada pocillo con 500 microlitros de Triton X-100 al 0,3% en TBS. Después de 10 minutos, reemplace la solución permeable con un mililitro de TBS, agite la placa suavemente y reemplace el TBS con un mililitro de solución de bloqueo durante una hora a temperatura ambiente.

Para etiquetar las células con un cóctel de anticuerpos primarios de interés, coloque 50 microlitros de la mezcla de anticuerpos primarios por cubreobjetos en un trozo de plástico Parafilm firmemente pegado con cinta adhesiva a la mesa de trabajo. A continuación, utilice unas pinzas para recoger el primer cubreobjetos. Y frota el borde del cubreobjetos sobre un trozo de papel de seda para eliminar el exceso de líquido.

Coloque con cuidado el cubreobjetos en la gota e incube los cubreobjetos en las condiciones de etiquetado adecuadas. Al final de la incubación del marcaje primario de anticuerpos, transfiera cada cubreobjetos a un pocillo individual de una nueva placa de 24 pocillos que contenga un mililitro de TBS por pocillo, y lave las células a temperatura ambiente en un agitador de placas durante cinco minutos tres veces. Después del último lavado, etiquete las células en cada cubreobjetos con la mezcla de cóctel de anticuerpos secundarios adecuada, como se acaba de demostrar.

E incubar los cubreobjetos en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación del marcaje secundario de anticuerpos, lavar las células en un mililitro de PBS tres veces en una nueva placa de 24 pocillos agitando suavemente como se acaba de demostrar, pero protegidas de la luz. Después del último lavado, sumerja brevemente cada cubreobjetos en agua desionizada para eliminar la sal, aplique los bordes del cubreobjetos en un pañuelo de papel y monte con cuidado los cubreobjetos en cinco microlitros de medio de montaje de fluorescencia por portaobjetos de microscopio de vidrio sin burbujas.

A continuación, selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Y guarde los portaobjetos según corresponda hasta la obtención de imágenes. Para obtener imágenes de las células mediante microscopía confocal de fluorescencia, comience seleccionando el objetivo apropiado y los canales fluorescentes apropiados para la adquisición de imágenes.

A continuación, adquiera pilas de imágenes de las células, utilizando el software de imágenes adecuado. Cuando se hayan capturado todas las imágenes, utilice el software de análisis de imágenes adecuado para contraer las pilas de imágenes y guardarlas como archivos TIFF. A continuación, cargue un control y una imagen TIFF experimental en la plataforma de análisis de imágenes y seleccione Tabla de búsqueda para abrir los parámetros del canal en la ventana Secuencia.

Haga clic en todas las casillas de verificación de la pestaña de canales para desactivar todos los canales. A continuación, haga clic en el canal cero y haga clic en la barra de color del canal cero para seleccionar el color preferido, aumentando la intensidad del canal según sea necesario para visualizar todas las estructuras. Después de seleccionar y ajustar cada uno de los canales de color apropiados para el análisis experimental, seleccione la pestaña del lienzo y ajuste la pestaña del zoom para visualizar aproximadamente 10 celdas por campo de visualización.

Con la herramienta polígono, haga clic en la celda de interés y extienda la línea alrededor de la celda para delinear el límite de la celda. Para nombrar esta región de interés, en la ventana de la región de interés, haga clic con el botón derecho en la celda de interés y haga doble clic en el nombre de la región de interés para modificarlo. Después de seleccionar y nombrar todas las celdas de interés de la misma manera, abra la aplicación Spot Detector dentro de la pestaña de detección y seguimiento.

Abra la pestaña Pre Procesamiento y seleccione el canal que se va a analizar. En la pestaña Detector, seleccione Detectar puntos brillantes sobre fondo oscuro y seleccione la escala y la sensibilidad adecuadas. En la pestaña Región de interés, seleccione la región de interés sugerida de la secuencia.

En la pestaña Filtrado, seleccione NoFiltering. En la pestaña Salida, seleccione la salida adecuada. Seleccione Eliminar puntos anteriores renderizados como regiones de interés y haga clic en ningún archivo seleccionado para seleccionar la carpeta para guardar el archivo.

A continuación, en la pestaña Visualización, seleccione las opciones adecuadas de interés y haga clic en Iniciar detección. Dentro del software de análisis de imágenes, el detector puntual se puede utilizar para identificar los gránulos de tensión dentro de cada una de las regiones de interés designadas. A continuación, se puede generar una imagen binaria para mostrar todos los gránulos de tensión identificados.

El análisis de gránulos de tensión debe adaptarse cuidadosamente a cada mercado de gránulos de tensión analizado. Por ejemplo, cambiar el requisito de tamaño de la región de interés detectada o cambiar la sensibilidad de los parámetros de detección conduce a resultados variables. En escalas de tamaño de píxel más altas, los gránulos de tensión más pequeños no se contarán y el número de gránulos de tensión disminuirá.

Mientras que el aumento de la sensibilidad da como resultado un aumento en el número de gránulos de estrés. Por ejemplo, en este experimento, una escala de dos con una sensibilidad de 100 dio el mejor resultado del marcador de gránulos de estrés G3BP1. Mientras que una escala de dos con una sensibilidad de 55 dio el mejor resultado para el marcador de gránulos de estrés EIF3B.

El área de superficie se puede calcular a partir del tamaño de los gránulos de tensión. Los gráficos de distribución de frecuencia son útiles para resaltar los cambios en el tamaño de los gránulos de estrés entre diferentes poblaciones de células. Además, la intensidad de la fluorescencia puede proporcionar información sobre la calidad de los gránulos de estrés analizados.

Una vez dominado, todo el desafío de la célula se puede realizar en unas seis o siete horas, y el análisis se puede completar en otras dos o tres horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que siempre se deben procesar las muestras de control y experimentales al mismo tiempo y en las mismas condiciones para minimizar la variabilidad dentro de los datos. Siguiendo este procedimiento, el análisis también se puede ampliar a un volumen tridimensional para obtener información adicional sobre la localización de los gránulos de tensión.

Este procedimiento semiautomatizado permite un análisis riguroso e imparcial de los gránulos de estrés en células infectadas y no infectadas. Puede revelar subversiones previamente desconocidas de la vía de los gránulos de estrés. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo infectar células con bacterias, cómo inducir la formación de gránulos de estrés y cómo usar un enfoque semiautomatizado para analizar gránulos de estrés de manera cualitativa y cuantitativa.

Y no olvide que con la Shigella flexneri y los agentes inductores de gránulos de estrés como el clotrimazol pueden ser peligrosos, y que son necesarias precauciones como usar guantes, trabajar en un laboratorio BL2 y desechar adecuadamente todos los reactivos.