Question 1

¿Cómo crean las técnicas de edición del genoma mutaciones dirigidas en el ADN?

Accepted Answer

Los métodos de edición del genoma utilizan enzimas nucleasas diseñadas para crear pequeños cortes o roturas de doble cadena en secuencias específicas de ADN. Las células intentan reparar este daño mediante la unión de extremos no homólogos o la reparación dirigida por homología. Durante la reparación, se introducen mutaciones en la región objetivo con una eficiencia mucho mayor que los métodos clásicos gen dirigido.

Question 2

¿Cuál es la diferencia entre NHEJ y HDR en la reparación del ADN?

Accepted Answer

Unión de extremos no homólogos (NHEJ) resella directamente extremos de ADN rotos pero a menudo de manera imperfecta, eliminando o añadiendo bases y mutando la secuencia objetivo. La reparación dirigida por homología (HDR) corrige el daño copiando de una plantilla homóloga, permitiendo a los investigadores añadir secuencias específicas para dirigir cambios precisos en el sitio objetivo.

Question 3

¿Cómo difieren las nucleasas de dedos de zinc y los TALENs en su enfoque de targeting?

Accepted Answer

Las nucleasas de dedo de zinc (ZFN) fusionan dominios de dedo de zinc que se unen al ADN con la endonucleasa FokI, con cada dominio reconociendo un triplete específico de nucleótidos. Los TALEN unen FokI a dominios efectores similares a los activadores de la transcripción bacteriana, donde cada dominio reconoce una única base de ADN, proporcionando diferentes niveles de especificidad de secuencia.

Question 4

¿Por qué es ventajoso el sistema CRISPR-Cas9 en comparación con los métodos de edición del genoma basados en proteínas?

Accepted Answer

El sistema CRISPR-Cas9 utiliza secuencias guía de ARN personalizables llamadas ARN guía únicos (sgRNAs) para dirigir Cas9 a las secuencias genéticas deseadas. Este enfoque basado en ARN proporciona ventajas distintas sobre los métodos basados en proteínas como ZFNs y TALENs porque la secuencia guía puede ser fácilmente modificada para dirigir casi cualquier ubicación genómica en células de mamíferos u otros sistemas.

Question 5

¿Qué papel juega el motivo adyacente al protoespacio en el objetivo de CRISPR-Cas9?

Accepted Answer

El motivo adyacente al protoespaciador (PAM) es una secuencia de 3 pares de bases localizada en el extremo 3' de la región diana de ADN. Cas9 requiere el PAM para reconocer y escindir el ADN diana, y la secuencia exacta del PAM es específica del organismo del cual se originó la enzima Cas9, haciéndolo esencial para la edición exitosa del genoma.

Question 6

¿Cómo se sintetizan y se incorporan las secuencias guía CRISPR en las células?

Accepted Answer

Dos oligonucleótidos complementarios que coinciden con la secuencia objetivo se sintetizan, desnaturalizan y renaturalizan. La secuencia guía resultante se liga en un plásmido que contiene un andamio de sgRNA utilizando enzimas de restricción y ligasa. La construcción CRISPR se co-transfecta entonces con una construcción que codifica Cas9 en células objetivo, que se cultivan y se examinan mediante PCR o secuenciación para detectar las mutaciones deseadas.

Question 7

¿Cuáles son algunas de las aplicaciones actuales de la edición del genoma en la investigación?

Accepted Answer

Los investigadores utilizan la edición del genoma para insertar secuencias reporteras como la proteína fluorescente verde en genes específicos, generar organismos knockout donde los genes se vuelven no funcionales y crear grandes deleciones genéticas al inducir dos roturas de doble cadena en la misma región cromosómica. Estas aplicaciones permiten el estudio de los mecanismos de función génica y enfermedad en organismos modelo y células cultivadas.

La edición del genoma - Cuestionario de evaluación