El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

El objetivo general de este procedimiento es realizar un análisis de molécula única de la distribución de enlaces cruzados entre cadenas localizadas con láser en el ADN genómico con el fin de estudiar las respuestas celulares a los enlaces cruzados entre cadenas de ADN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, con respecto a la distribución de las lesiones de ADN introducidas por la tecnología láser, una herramienta experimental ampliamente utilizada. La principal ventaja de esta técnica es que permite obtener imágenes directas de las lesiones de ADN introducidas por el compuesto activado por láser en el ADN genómico.

Esto no ha sido posible antes. La demostración del procedimiento estará a cargo de Julia Gichimu e Hima Gali de nuestro laboratorio. Cada vez que se utiliza el láser de puntería, es importante realizar una calibración del deslizamiento del espejo para verificar que el láser está golpeando en las coordenadas XYZ apropiadas y para establecer el área del campo capturado por la cámara donde se puede configurar el láser para golpear.

Busque un campo en la diapositiva que se haya grabado previamente. Ajuste el tiempo de exposición y la potencia del láser. A continuación, ajuste el enfoque para desplazarse a un campo cercano no objetivo en la diapositiva del espejo.

Inicie el procedimiento de calibración. El software disparará el láser para grabar la corredera del espejo a lo largo de la línea horizontal y diagonal. Estas líneas definen los límites del campo en el que el láser puede incidir en una célula objetivo.

Establezca varias regiones de interés, o ROI, dentro del campo y dispare el láser para confirmar que está apuntando a las áreas seleccionadas y, por lo tanto, golpeando las coordenadas XYZ apropiadas. También se debe realizar una calibración biológica al configurar el sistema láser de orientación del microscopio. El primer paso es definir la potencia láser mínima requerida para fotoactivar el trimetilpsoraleno, o TMP, inducir enlaces cruzados entre hebras y provocar el reclutamiento de un factor de reparación marcado con GFP, para el cual se puede caracterizar previamente la cinética.

En este laboratorio se utiliza una línea celular U2OS transfactada de forma estable con un plásmido que expresa GFP fan one. Como se muestra aquí, cuando las células se exponen a seis micromolares TMP y 1,2% de láser en una imagen durante 10 minutos, la visualización de la secuencia de imágenes en forma de vídeo confirma el reclutamiento de GFP fan uno para el ROI objetivo. El segundo paso es verificar que este ajuste de potencia no desencadene el reclutamiento en ausencia del compuesto.

Como se muestra aquí, cuando las células se exponen a una imagen láser al 1,2% solo durante 10 minutos y la imagen se ve como un video, no hay reclutamiento de GFP fan uno para el ROI objetivo. En tercer lugar, es importante definir la configuración de potencia mínima que puede soplar una celda. La capacidad de soplar una celda a esta configuración de potencia debe probarse como una calibración biológica de rutina todos los días que se usa el láser de puntería.

Establezca el ROI dentro del núcleo evitando los nucléolos. Ajusta el enfoque. Ajuste la potencia del láser al 12% y dispare.

Por último, es esencial establecer el plano focal en la mitad de la celda para lograr una orientación correcta. Para demostrar esto, tres celdas están dirigidas a tres planos focales. Célula media.

Demasiado alto. Y demasiado bajo. Tres minutos después de la selección de objetivos, se genera una pila de imágenes de tres micras para examinar la distribución del ventilador GFP, una franja en todo el plano focal de la imagen.

Solo la celda dirigida a la celda central muestra un ventilador GFP una raya en todos los planos Z. Antes de realizar la localización láser, prepare placas de cultivo celular con fondo de vidrio de 35 milímetros para el crecimiento de células. Con un rotulador, haz una marca vertical en el costado de cada plato.

Use un bolígrafo de diamante para rascar una cruz en el centro del vidrio en la superficie del cultivo, de modo que la raya negra en el costado del plato esté en la parte superior de un brazo de la cruz. La cruz está marcada en la superficie de crecimiento del vidrio para que éste y las células estén en el mismo plano focal. Las células en placa y las placas de cultivo esterilizadas marcadas en cruz e incuban durante 24 horas en un micromolar cinco clorodesoxiuridina para marcar uniformemente el ADN.

El día del experimento, agregue TMP unido a digoxigenina o extraiga TMP en etanol al 50% en el medio de cultivo celular hasta una concentración final de 20 micromolares. Lleva el medio a 37 grados centígrados. Reemplace el medio en las placas de cultivo con medio que contenga TMP de excavación e incube a 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante 30 minutos para permitir que el TMP de excavación se equilibre.

Mientras las células se incuban, realice la calibración del portaobjetos del espejo y el 12% de soplado de una celda como se demostró anteriormente. Coloque la placa en la cámara ambiental a 37 grados centígrados con CO2 y humedad controlados en la platina del microscopio. Concéntrese con el objetivo de aceite 60X en la intersección de la cruz.

Seleccione el primer campo al que dirigirse y utilice la herramienta de forma para establecer el ROI en celdas individuales situadas en las inmediaciones de la intersección de la cruz. Seleccione áreas nucleoplásmicas fuera de los nucléolos. Ajuste el plano focal Z para apuntar el láser a la mitad de los núcleos.

A continuación, ajuste el ajuste de potencia al mínimo requerido para activar el psoraleno en la respuesta al daño del ADN inducida por la reticulación entre hebras. 1.2%se utiliza aquí. Dispara el láser.

Una vez que se hayan seleccionado todas las celdas de un campo, mueva la placa a un nuevo campo, permaneciendo cerca de la intersección de la cruz. Repita el procedimiento que se acaba de demostrar en 12 a 18 campos para dirigirse a un total de 80 a 100 celdas. Para cosechar las células, retire la placa de cultivo del escenario.

Retire el medio y lave las células con una solución de PBS. Retire el PBS y coloque una gota de 10 microlitros de una solución comercial de tripsina EDTA en la intersección de la cruz en el medio de la superficie del vidrio. Incubar durante tres o cuatro minutos a temperatura ambiente y luego extraer la solución de tripsina con las células separadas en una punta de pipeta.

Coloque la gota de tripsina EDTA con las células en un extremo del portaobjetos de microscopio de vidrio silanizado. Para lisar las células y liberar el ADN, agregue 10 microlitros de solución de SDS al 5% e incube durante tres o cuatro minutos a temperatura ambiente, mezclando suavemente con la punta de la pipeta, permitiendo que la periferia de la piscina se seque. Incline el portaobjetos 20 grados y deje que el líquido corra hasta el final.

Las fuerzas hidrodinámicas del líquido que fluye extenderán y estirarán las fibras de ADN. Deje que el portaobjetos se seque al aire durante 10 minutos. Sumerja el portaobjetos en una solución de tres a uno de metanol a ácido acético y fije durante 10 minutos.

A continuación, retire el portaobjetos de la solución fija y vuelva a secar al aire. En este punto, el portaobjetos se puede almacenar indefinidamente en etanol al 70% a 20 grados centígrados. Para procesar el portaobjetos para la detección de señales de excavación en las fibras de ADN mediante microscopía de fluorescencia, retire el portaobjetos con el ADN estirado de la solución de etanol al 70% y deje que se seque al aire.

Posteriormente, desnaturalice las fibras de ADN en cloruro de hidrógeno y luego transfiéralas a un recipiente de clorhídrico de tris a PH ocho para su neutralización. A continuación, lave las muestras en PBS. Y, por último, teñirlos con los anticuerpos adecuados siguiendo un procedimiento previamente publicado.

Se muestra la estructura del trimetilpsoraleno con una marca de dioxigenina. Los enlaces cruzados de ADN entre hebras, o ICL, se pueden mostrar mediante inmunofluorescencia contra dig TMP. Este ejemplo muestra células con una acumulación de un marcador bien conocido de la respuesta al daño del ADN gamma H2AX, visualizado en verde, en ROIs que contienen ICLs localizadas con láser visualizadas en rojo.

El núcleo teñido con DAPI está en azul. El campo brillante muestra una celda parcialmente en la marca hecha por el bolígrafo de diamante. Tenga en cuenta que los ROI se colocan fuera de los nucléolos.

Para determinar la frecuencia y el espaciamiento de los aductos, las células se incubaron en cinco clorodesoxiuridinas durante 24 horas antes de la introducción de las ICL. Después de recolectar las células y esparcir las fibras de ADN, las señales de excavación se detectaron con un punto cuántico amino visualizado en rojo en las cinco cloro desoxiuridina por aminoflorescencia visualizadas en verde. El análisis de las señales de excavación en las fibras revela que las distancias entre ICL oscilan entre menos de 10 KB y más de 160 KB. No hubo evidencia de aductos agrupados.

Siguiendo estas directrices, debería ser posible extender este enfoque a otros aductos de ADN, como las lesiones oxidativas que pueden localizarse con láseres de longitud de onda adecuada.