Name: El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 46 s
Description: Aprende análisis de moléculas individuales de ADN con láser para estudiar respuestas celulares a daño genómico. Este método permite imaginar directamente lesiones de ADN inducidas por compuestos activados con láser.

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Esta investigación fue financiada en parte por el Programa de Investigación Intramural del NIH, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (Z01 AG000746-08) y el Fondo de Investigación de Anemia de Fanconi.

1. Preparación de Dig-TMP <ol><li> Mezclar 50 mg (0,18 mmoles) de 4&#39;-clorometil-4,5&#39; , 8-trimetilpsoraleno y 590 mg (2,7 mmoles) de 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amina en un lugar seco 25 ml ronda matraz -fondo bajo nitrógeno. Añadir 10 ml de tolueno y reflujo durante 12 h. Eliminar el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida. <ol><li> Se purifica el residuo por cromatografía en columna ultrarrápida sobre gel de sílice. Eluir la columna con cloroformo, metanol y solución al 28% de amoniaco (9: 1: 0,5). Se evapora el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida, y recuperar el puro 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, 8-trimetilpsoraleno como un pálido amarillo viscoso líquido. </li><li> Mezclar 5,5 mg (0,012 mmoles) de 4 &#39;- [N- (13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5&#39;, 8-trimetilpsoraleno con 5 mg (0,008 mmoles) de éster NHS digoxigenina en un matraz de fondo redondo seco bajo nitrógeno. Añadir 0,5 ml de dimetil formamida (DMF) anhidra unad 3,4 l de trimetilamina y se agita a 50 ° C durante 18 h. </li><li> Eliminar el disolvente en un evaporador rotatorio a presión reducida. </li><li> Se disuelve el residuo en una cantidad mínima de diclorometano. Aplicar la solución en 2 puntos mu l horizontalmente a través de la parte inferior de una placa preparativa de capa fina con gel de sílice como fase estacionaria. Ejecutar la preparativa TLC en cloroformo: metanol: hidróxido de amonio 28% (8: 1: 0,1). </li><li> Máscara la placa, excepto para los bordes verticales e identificar la banda de producto con longitud de onda corta UV 254 lámpara nm. Raspar el producto de la placa con una espátula y aislar el producto puro usando cloroformo: metanol: hidróxido de amonio 28% (8: 1: 0,1) mezcla. </li><li> Eliminar los disolventes en un evaporador rotatorio a presión reducida. Disolver los pellets residuales en 1 ml de 50% de EtOH: H 2 O, dispensar en 50 alícuotas en tubos de 1,5 mL (~ alícuotas de 20) y se seca en un evaporador centrífugo hasta que todo el disolvente se evapora (~ 3 h). </li><li>Se vuelve a disolver cada alícuota en 200? L de 50% de EtOH: H 2 O y se seca de nuevo en un evaporador centrífugo. Disolver cada alícuota de nuevo en 200 l de 50% de EtOH: H 2 O, seco en un evaporador y almacenar centrífugas gránulos a -20 ° C para almacenamiento a largo plazo. </li></ol></li><li> Para su uso, disolver el precipitado en 50 l de 50% de EtOH: H 2 O. Preparar una dilución 1: 100 de la disuelto Dig-TMP en H 2 O y medir la DO a 250 nm. El coeficiente de extinción de Dig-TMP es 25.000. La solución es estable durante aproximadamente un mes si se almacena a -20 ° C. Verificar la concentración midiendo la DO a 250 nm antes de cada uso. <ol><li> Calcular la concentración Stock: Abs x 100 x10 6/25000 = concentración (en M). Típicamente, la solución madre es de aproximadamente 3 mM. Es importante estar en este intervalo con el fin de minimizar el volumen de EtOH se añade al medio. </li></ol></li></ol> 2. Láser localizadas DIG-TMP ICL <ol><li> Educación físicarforma localización láser con un microscopio confocal con un láser de nitrógeno SRS (337 nm) bombea a través de una célula de tinte que emite una línea de 365 nm y disparando 3 ns pulsos a 10 Hz, con una potencia de 0,7 nW. </li><li> Hacer una marca vertical en el lado de un vidrio de 35 mm tocó fondo placa de cultivo celular con un marcador. Rasguño una cruz en el centro del vidrio sobre la superficie de cultivo con una pluma de diamante de manera que la raya negro en el lado del plato es en la parte superior de un brazo de la cruz. La cruz está marcado en la superficie de crecimiento del cristal de modo que las células y estará en el mismo plano focal. </li><li> Esterilizar la placa después de marcar con un enjuague de 70% EtOH. Seco antes de placas células. </li><li> células de la placa (cepas de laboratorio estándar tales como HeLa o U2OS) en la cruz marcados placas de cultivo de uno o dos días antes. Cell debe dividen activamente y 50-70% de confluencia en el día del experimento. Incubar 24 h con 1? M 5-cloro-2-desoxiuridina (CldU) al ADN de etiqueta de manera uniforme. </li><li> AñadirDig-TMP en 50% de EtOH: H2O al medio de cultivo celular a una concentración final de 20? M. Llevar el medio a 37 ° C. Cambiar el medio sobre las células y el lugar en la incubadora (37 ° C, 5% CO2) durante 30 min para permitir que el Dig-TMP se equilibre. </li><li> Mientras que las células están incubando, establecer las coordenadas X / Y del campo de vista en el que el láser está activo. Siga el procedimiento de calibración del fabricante en la que el láser es dirigido por el software para grabar un portaobjetos de vidrio de espejo a lo largo de una línea horizontal y diagonal. Las dos líneas definen los límites del campo en el que el láser puede lograr un objetivo. </li><li> Colocar la placa en la cámara ambiental, a 37 ° C con CO 2 controlada y humedad, en la platina del microscopio y se centran con el objetivo aceite de 60X en la intersección de la cruz. </li><li> Dirigir el haz láser 365 nm a una ROI, establecida por el investigador con la herramienta forma en el software, para formar una franja de 3 &amp;# 181; mx 0,6 m. El contorno de la ROI se coloca el cursor en el núcleo de las células situadas en las inmediaciones de la intersección de la cruz. Ajustar el plano focal z para apuntar la mitad del camino láser a través del núcleo. Utilizar un láser en el rango de 350-370 nm. 405 láseres nm no pueden inducir reticulaciones 19. NOTA: Localizamos la ROI en áreas fuera de la nucleoplasmic nucleolos, que puede ser distinguida de nucleoplasma en formación de imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC). </li><li> Verificar el enfoque y la actividad del láser mediante el aumento del valor de corriente a un nivel suficiente para destruir una célula (la célula se oscurecerá y luego desaparecen). Este es un importante diagnóstico para una trayectoria de la luz sin obstáculos para el láser a través del microscopio y luego a través del cubreobjetos y en las células. <ol><li> Bajar el valor de corriente a basta con activar el psoraleno y la RDA ICL inducida (esto debe ser determinado empíricamente para cada láser / micrófonoROSCOPE combinación). Use un valor de intensidad del láser (1,7% aquí) que no activa la RDA en ausencia de psoraleno (controlado por la formación de γ-H2AX). NOTA: Esta es una determinación importante y la configuración puede requerir ajuste si se cambia la fuente de láser o un componente en la trayectoria de la luz. Sigue la acumulación de GFP etiquetada proteínas de reparación tales como XPC o FAN1, ambos de los cuales son reclutados rápidamente (en segundos) a las franjas de psoraleno láser, pero no a Roi expuesta al láser solo. Algunas proteínas de la RDA aparecen en cuestión de segundos, mientras que varios minutos pueden ser necesarios para otros. Es necesario llevar a cabo las determinaciones del curso de tiempo para cada proteína de interés. También observamos que en las células no expuestas al láser no hay bandas de proteínas que responden. </li></ol></li><li> Después de todas las células en un campo han sido objeto de mover la placa a un nuevo campo, permaneciendo cerca de la intersección de la cruz. </li><li> En experimentos diseñados para determine la distribución de las distancias inter lesión exponer las células al láser en 20-25 campos (4-5 células / campo) alrededor de la intersección. Con el fin de analizar los patrones de replicación en las proximidades de los ICLs localizadas incubar las células con 10? M 5-yodo-2-desoxiuridina (IDU) después de la cocción láser. NOTA: El tiempo de incubación con el UDI es un tanto arbitraria. Hemos utilizado tan corto como 20 min y el tiempo que 60 min (ver más abajo). pulsos más largos (unas pocas horas) a menudo resultan en múltiples extensiones de replicación de coalescencia, perdiendo así la oportunidad de imagen del progreso de tenedores individuales. En algunos experimentos ces se etiquetan con CldU para 24 h de forma homogénea ADN etiqueta antes de la exposición a Dig-TMP seguido de etiquetado pulso de extensiones de replicación. </li></ol> 3. Cosecha de las células y el estiramiento de las fibras de ADN <ol><li> Retirar la placa de la etapa, eliminar el medio y lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Eliminar la solución de PBS. Coloque una gota de 10 l de una tripsina comercial/ Solución de EDTA en la intersección de la cruz en el centro de la superficie de vidrio. </li><li> Incubar durante 3-4 min a temperatura ambiente (RT) y luego extraer la solución de tripsina con las células separadas en la punta de la pipeta. No hay necesidad de neutralizar la tripsina. </li><li> Coloque la gota de tripsina / EDTA con las células en un extremo de un portaobjetos de microscopio de vidrio silanizado. Lisar las células y liberar el ADN mediante la adición de 10 l de solución de SDS al 0,5% y se incuba durante 3-4 min a RT la mezcla suavemente con la punta de la pipeta, permitiendo que la periferia de la piscina a secar. </li><li> Inclinar la placa de 20º y permita que el líquido deteriorado hasta el final. Las fibras de ADN se amplían / ​​estirado por las fuerzas hidrodinámicas del líquido que fluye. Deje que el portaobjetos de aire seco (~ 10 min) y fijar en 3: 1 de metanol / ácido acético durante 10 min. Retire las diapositivas de la solución de arreglo y secar al aire de nuevo. En este punto se pueden almacenar indefinidamente en EtOH al 70% a -20 ° C. Al retirar del EtOH 70% dejar secar al aire antes de la nepaso xt. </li><li> Lavado de los portaobjetos en PBS, y luego desnaturalizar en HCl 2,5 M durante 1 h a TA. Este tratamiento depurinates hacer las nucleobases halogenados incorporados accesibles a los anticuerpos de ADN. </li><li> Neutralizar diapositivas en 0,4 M Tris-HCl, pH 7,4. Lavar dos veces en PBS / 0,5% Tween-20 (PBST) durante 5 min cada uno. </li><li> Bloquear desliza con 5% de albúmina de suero bovino (BSA) y suero de cabra al 10% en PBS. Cubra los portaobjetos suavemente con un Parafilm para difundir la solución de bloqueo de manera uniforme sobre el portaobjetos y se incuba durante 1 h a TA. </li><li> Pipetear 100 l de dilución 1: 200 en solución de rata anti-bromodesoxiuridina bloqueo (detecta específicamente CldU) anticuerpo primario a cada diapositiva. Cubra los portaobjetos suavemente con un Parafilm para difundir la dilución de manera uniforme sobre el portaobjetos y se incuban en una cámara humidificada durante 1 hora a RT. Quitar la parafina y lavar los pocillos tres veces en PBST durante 5 minutos cada uno. </li><li> Pipetear 100 l de diluido (1: 100) de cabra anti-rata de Alexa Fluor 647 en solución a cada corredera de bloqueo. Cubrir eldesliza suavemente con un parafilm y se incuba durante 45 min a TA. Lavar los portaobjetos tres veces en PBST durante 5 min cada uno. </li><li> Pipetear 100 l de diluido anti-bromodesoxiuridina (1:40) del ratón (detecta LDU y CldU Esta doble especificidad requiere el bloqueo de CldU por la rata anti BrdU en la incubación previa.) Anticuerpo primario y anticuerpo de conejo anti-DIG (1: 200 ) en solución a cada corredera de bloqueo. Cubra los portaobjetos suavemente con un parafilm y se incuba en una cámara humidificada durante 1 hora a RT. Lavar los portaobjetos tres veces en PBST durante 5 min cada uno. </li><li> Pipetear 100 l de diluido (1: 100) de cabra anti-ratón de Alexa Fluor 488 y c (1: 5000) sonda anti-conejo de cabra (por ejemplo, Qdot 655) en solución a cada corredera de bloqueo. Cubra los portaobjetos suavemente con parafilm y se incuba durante 45 min a TA. Lavar los portaobjetos tres veces en PBST durante 5 min cada uno. </li><li> Drenar el exceso de PBST en una toalla de papel. Añadir 50 l de antifade medio de montaje sobre cada portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos. Imagen o tienda parano más de 48 h a -20 ° C. </li></ol> 4. Fibra de imagen por microscopía de fluorescencia <ol><li> Realizar la adquisición de imágenes a través de un objetivo 63X en un microscopio invertido con una rueda de filtros motorizada completamente unida con FITC, Cy5 y Q del punto 655 de detección. El filtro de excitación es de 425 nm, y el filtro de emisión es 655 nm con 20 nm centrada en el pico de emisión 20. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La tecnología de localización láser requiere el uso de células adherentes con núcleos que son visibles en microscopía de campo claro. Hemos tratado de unir las células no adherentes, tales como linfocitos primarios, o células cultivadas de baja adherencia, tales como AD293, a la superficie de cristal con preparaciones adhesivas de células tales como polilisina o colágeno, o mezclas más complejas. Aunque estos tratamientos pueden unir las células a la superficie, nos encontramos con que por lo general se quedan redondead...

DNA está bajo asalto constante de los agentes exógenos tales como la radiación, luz ultravioleta, toxinas ambientales, productos de combustión, etc. Además, también es atacado por las especies de radicales endógenos producidos por el metabolismo oxidativo. Todos estos tienen el potencial de alterar química o físicamente la integridad del ADN 1. Las perturbaciones en el genoma pueden activar la respuesta al daño del ADN (DDR), un reclutamiento y la cascada de la modificación post traduccional con cientos, si no miles, de proteínas y microRNAs implicados en la reparación de la lesión, la regulación del ciclo celular, apoptosis, senescencia, y las vías inflamatorias 2. La mayor parte de nuestra información sobre el DDR proviene de estudios con DSB. Esto es en gran parte debido a la disponibilidad de tecnologías para la introducción de roturas, incluidas las pausas específicos de secuencia, en el ADN genómico en las células vivas 3. Además, el propensity de descansos para inducir focos de proteínas de DDR, que se pueden visualizar mediante inmunofluorescencia, ha sido muy útil para la identificación de la cinética y requerimientos de proteínas que responden. Una de las tecnologías clave para el estudio de la DDR fue introducido por Bonner y colegas, que utiliza un rayo láser para dirigir una banda de DSBs en una &quot;región de interés&quot; (ROI) en los núcleos de las células vivas 4. En efecto, crearon un enfoque muy largo en el que las proteínas de la RDA podrían ser identificados por inmunofluorescencia. Esto se ilustró por su demostración de la fuerte de la raya de la histona H2AX fosforilado (γ-H2AX) en las células expuestas a láser. Desde entonces, el enfoque de láser se ha empleado en numerosos estudios de la DDR inducidos por DSBs. Aunque potente y popular, y la fuente de las imágenes de inmunofluorescencia dramáticos, cabe señalar que en la mayoría de los experimentos de la intensidad del láser se ajusta a fin de producir resultados observables, sin preocuparse por la identidad de la lesión,densidad, o espaciado. De hecho, puede ser difícil hacer estas estimaciones. Por lo tanto son ignorados en gran medida, a pesar de la multiplicidad de las lesiones introducidos en ADN por láser 5. Esto contribuye a las muchas contradicciones en la literatura 6. En contraste con DSBs, la mayoría de modificaciones químicas de ADN no estimulan la formación de focos discretos de las proteínas de DDR. Esto es importante a la luz de nuestra comprensión actual de las frecuencias de la lesión. Se ha estimado que las células humanas en cultivo incurren en tanto como 50 DSBs por ciclo celular, formadas en gran medida durante la fase S 7, 8, 9. Menos se forman en las células no proliferativas. Esto contrasta con el número de pérdidas de nucleobases o eventos de modificación, que están en las decenas de miles por célula / día 1, 10. Por lo tanto, la mayoría sabemos acercala DDR inducida por eventos que son relativamente raras, y mucho menos acerca de los inducidos por lesiones hélice distorsión, que en conjunto son mucho más comunes. Con el fin de abordar cuestiones relativas a la respuesta celular a las modificaciones covalentes de ADN genómico, queríamos trabajar con una hélice que distorsionan aductos de ADN que tenía actividad inherente de inducción DDR. Además, para facilitar el diseño experimental y la interpretación que estábamos interesados ​​en una estructura cuya introducción podría ser controlado con respecto al tiempo y era susceptible de visualización. En consecuencia, hemos desarrollado una estrategia basada en psoraleno. Los psoralenos están bien caracterizados intercaladores de ADN fotoactivos que favorecen 5&#39; TA: AT sitios. A diferencia de otros agentes de reticulación tales como mostazas de nitrógeno y mitomicina C (MMC) que no son ADN reactiva a menos expuesto a la luz UV de onda larga (UVA). Las moléculas intercaladas reaccionan con bases de timina en hebras opuestas para producir hélice distorsionar reticulaciones entre cadenas (ICL) 11. Con el psoraleno trimetil usado en nuestros experimentos mayoría de los productos son ICL, se generan relativamente pocos monoaductos (menos de 10%) 12, y reticulaciones intracatenarios entre bases adyacentes en una cadena no se forman. Debido a que son potentes bloques a la replicación y transcripción, psoraleno y otros agentes de reticulación, como cis-platino y MMC, se utilizan comúnmente en la quimioterapia. Por lo tanto permitido psoraleno estudios que siguieron a la activación de la DDR por una estructura que distorsionan hélice, y también proporcionado información sobre la respuesta celular a un compuesto con importancia clínica. Se sintetizaron un reactivo en el que psoraleno trimetil estaba relacionado con digoxigenina (Dig), un esterol de planta no se encuentra en células de mamífero y se utiliza con frecuencia como un immunotag. El requisito para la fotoactivación permite la localización por la luz láser (365 nm) de ICL de psoraleno en ROI definido en núcleos en las células vivas. Éstas se pueden representar por la IMMunofluorescence contra la etiqueta Dig. La reparación del ADN y las proteínas de DDR aparecieron en las rayas de láser localizadas ICL 13, 14. El DDR activado por las intensidades altas de láser usados para producir DSBs podría ser debido al daño aislado o agrupado 15, 16. En consecuencia, la relevancia de los resultados de estos experimentos a lesiones de origen natural, presente en mucho menor concentración, es incierto. Para hacer frente a preguntas similares acerca de la frecuencia aducto psoraleno y el espaciamiento en el ADN, nos aprovechamos de la tecnología de fibra de ADN y 17 puntos immunoquantum. Los puntos cuánticos son mucho más brillantes que los tintes fluorescentes y no se blanquean por la exposición a la luz. Por lo tanto se utilizan con frecuencia para la imagen única molécula de 18, una solicitud de que los colorantes fluorescentes no son suficientemente brillante. fibras de ADN individuales se pueden estirar en gdiapositivas Lass y se pueden visualizar por inmunofluorescencia contra análogos de nucleósidos incorporados durante incubaciones anteriores a la celda de la cosecha. Se han tratado las células con Dig-psoraleno y expuesta la ROI a micro láser irradiación. Las fibras se preparan a partir de las células y los aductos individuales DIG-psoraleno puede ser visualizado con los puntos immunoquantum. Exponer las células a los análogos de nucleósidos para tiempos relativamente cortos (20-60 min) permite la visualización de secciones de replicación en las proximidades de los ICLs láser localizado.

<table><tbody><tr><td>Digoxigenina NHS éster</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11333054001</td><td></td></tr><tr><td>cloro-psoraleno</td><td>Berry and Associates</td><td>PS 5000</td><td></td></tr><tr><td>diaminoglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>369519</td><td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamina</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Acros Organics</td><td>423550040</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A4524</td><td></td></tr><tr><td>Solución de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5002</td><td></td></tr><tr><td>placas TLC</td><td>Analtech, Inc.</td><td>P02511</td><td></td></tr><tr><td>Columna de vidrio Flass 24/40, 100 mL</td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CG-1196-02</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal de disco giratorio Nikon T2000_E2, equipado con cámara de control ambiental y de etapa automatizada y soporte de placa</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td>con software Volocity</td></tr><tr><td>Micropoint Galvo&nbsp;</td><td>Andor Technologies</td><td></td><td>con un láser pulsado de nitrógeno&nbsp;</td></tr><tr><td>célula de colorante</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-2250-2-365</td><td></td></tr><tr><td>tinte 365</td><td>Andor Technologies</td><td>MP-27-365-DYE</td><td></td></tr><tr><td>IdU&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>17125</td><td></td></tr><tr><td>Placas de vidrio de 35 mm 1.5 cubreobjetos, 10 mm de diámetro de vidrio, sin recubrimiento</td><td>Portaobjetos de</td> microscopio Matek <td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nuevo Suministro Parte</td><td># 5070</td><td>Nuevos portaobjetos de silano</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti BrdU de ratón (IdU)</td><td>BD Biosciences</td><td>347580</td><td>1 en 40</td></tr><tr><td>Rata anticuerpo anti BrdU (CldU)</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>1 en 200& nbsp;</td></tr><tr><td>Anticuerpo anti Dig para conejos</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>710019</td><td>1 en 200</td></tr><tr><td>Q-dot 655 anti conejo para cabras IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q-11421MP</td><td>1 en 5.000</td></tr><tr><td>AF647- cabra anti ratas IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>112-605-167</td><td>1 en 100</td></tr><tr><td>AF488-cabra anti ratón IgG</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>115-545-166</td><td>1 en 100</td></tr><tr><td>Zeiss epifluorescente microscopio A200</td><td>Zeiss</td><td></td><td>&nbsp; con el software Axiovision</td></tr><tr><td>Q-dot 655 filter</td><td>Chroma</td><td>39107</td><td></td></tr></tbody></table>

el análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

La respuesta al daño del ADN (DDR) se ha caracterizado ampliamente en estudios de doble filamento se rompe (DSBs) inducida por irradiación con haz de micro láser en células vivas. El DDR a la hélice que distorsionan modificaciones del ADN covalentes, incluyendo entrecruzamientos de ADN entre hebras (ICL), no está tan bien definida. Hemos estudiado la DDR estimulado por ICL, localizada por fotoactivación de psoralenos láser immunotagged, en los núcleos de las células vivas. Con el fin de abordar cuestiones fundamentales sobre distribución de aductos y encuentros horquilla de replicación, se combinaron localización láser con otras dos tecnologías. fibras de ADN se utilizan a menudo para mostrar el progreso de las horquillas de replicación por inmunofluorescencia de análogos de nucleósidos incorporados durante pulsos cortos. puntos Immunoquantum han sido ampliamente empleado para obtener imágenes de una sola molécula. En el nuevo enfoque, las fibras de ADN de las células que llevan ICL láser localizada se extendieron sobre portaobjetos de microscopio. Las ICL etiquetados se muestran con puntos immunoquantum y THe distancias entre las lesiones determinadas. colisiones horquilla de replicación con ICL se pueden visualizar y diferentes patrones de encuentro identificaron y se cuantificaron.

ICL láser localizadas Dig-TMP (Figura 1A) se pueden visualizar por inmunofluorescencia en contra de la Dig-tag vinculado al psoraleno. Aunque el láser puede ser dirigido de huelga en una superficie de cualquier contorno, rayas no son formas &quot;naturales&quot; en las células, y las señales legítimos se pueden distinguir fácilmente de los artefactos debido a la unión no específica por los anticuerpos primarios o secundarios. Esta característica es muy útil cuando se uti...

Los láseres se utilizan con frecuencia en los estudios de la respuesta celular al daño del ADN. Sin embargo, que generan lesiones cuya distancia, la frecuencia y las colisiones con las horquillas de replicación están raramente caracterizado. Aquí se describe un método que permite la determinación de estos parámetros con láser localizado entrecruzamientos entre cadenas.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar un análisis de molécula individual de la distribución de enlaces cruzados intercadena localizados por láser en el ADN genómico, con el fin de estudiar las respuestas celulares a los enlaces cruzados intercadena en el ADN. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la reparación del ADN, relacionadas con la distribución de lesiones en el ADN introducidas mediante tecnología láser, una herramienta experimental ampliamente utilizada. La principal ventaja de esta técnica es que permite la visualización directa de las lesiones en el ADN introducidas por el compuesto activado por láser en el ADN genómico.Esto no ha sido posible antes. El procedimiento será demostrado por Julia Gichimu y Hima Gali de nuestro laboratorio. Cada vez que se utilice el láser de localización, es importante realizar una calibración con la placa de espejo para verificar que el láser impacte en las coordenadas XYZ adecuadas, y para determinar el área del campo capturada por la cámara donde puede configurarse el impacto del láser.Busque un campo en la lámina que haya sido previamente grabado. Establezca el tiempo de exposición y la potencia del láser. Luego ajuste el enfoque para desplazarse a un campo cercano no dirigido en la lámina espejo.Inicie el procedimiento de calibración. El software disparará el láser para grabar la lámina de espejo a lo largo de una línea horizontal y una diagonal. Estas líneas definen los límites del campo en el que el láser puede impactar una célula diana.Establezca varias regiones de interés, o ROI, dentro del campo y active el láser para confirmar que está apuntando a las áreas seleccionadas y, por lo tanto, impactando en las coordenadas XYZ adecuadas. También se debe realizar una calibración biológica al configurar el sistema del láser de apuntado del microscopio. El primer paso consiste en definir la potencia mínima del láser necesaria para fotoactivar el trimetilpsoraleno, o TMP, inducir enlaces cruzados entre hebras e inducir la reclutación de un factor de reparación marcado con GFP, cuyas cinéticas previamente se pueden caracterizar.En este laboratorio se utiliza una línea celular U2OS estabilizada mediante transfección con un plásmido que expresa GFP fan uno. Como se muestra aquí, cuando las células se exponen a seis micromolares de TMP y 1,2 % de láser durante 10 minutos, observar la secuencia de imágenes como un video confirma el reclutamiento de GFP fan uno hacia la región de interés (ROI) objetivo. El segundo paso consiste en verificar que este ajuste de potencia no desencadene el reclutamiento en ausencia del compuesto.Como se muestra aquí, cuando las células se exponen al láser al 1,2 % durante 10 minutos y la imagen se visualiza como un video, no hay reclutamiento de GFP fan uno hacia la región de interés (ROI) objetivo. En tercer lugar, es importante definir el nivel mínimo de potencia capaz de destruir una célula. Esta capacidad de destrucción celular a dicho nivel de potencia debe probarse como una calibración biológica de rutina cada día que se utilice el láser de enfoque.Establezca la ROI dentro del núcleo evitando los nucléolos. Ajuste el enfoque. Establezca la potencia del láser al 12 % y dispare.Finalmente, es esencial ajustar el plano focal en el centro de la célula para lograr un posicionamiento correcto. Para demostrar esto, se dirigen tres células en tres planos focales. Centro de la célula.Demasiado alto. Y demasiado bajo. Tres minutos después de enfocar, se genera un conjunto de imágenes que abarca tres micrones para examinar la distribución del abanico GFP en una franja a lo largo del plano focal capturado.Solo la célula objetivo en el centro de la célula muestra un abanico de GFP con una raya en todos los planos Z. Antes de realizar la localización con láser, prepare platos de cultivo celular de 35 milímetros con fondo de vidrio para crecer las células. Con un rotulador, haga una marca vertical en el costado de cada plato.Utilice un lápiz de diamante para rayar una cruz en el centro del vidrio sobre la superficie de cultivo, de modo que la franja negra en el lateral del recipiente quede en la parte superior de uno de los brazos de la cruz. La cruz se marca sobre la superficie de crecimiento del vidrio para que esta y las células se encuentren en el mismo plano focal. Siembre las células en placas con los recipientes de cultivo marcados con la cruz esterilizada e incube durante 24 horas en un micromolar de cinco clorodesoxiuridina para etiquetar uniformemente el ADN.El día del experimento, agregue TMP marcado con digoxigenina o dig TMP en etanol al 50 % al medio de cultivo celular hasta una concentración final de 20 micromoles. Eleve la temperatura del medio a 37 grados Celsius. Reemplace el medio en las placas de cultivo con el medio que contiene dig TMP e incube a 37 grados Celsius y 5 % de CO2 durante 30 minutos para permitir que el dig TMP alcance el equilibrio.Mientras las células están en incubación, realice la calibración del espejo deslizante y el 12% de expulsión de una célula como se demostró anteriormente. Coloque la placa en la cámara ambiental a 37 grados Celsius con CO2 y humedad controlados sobre la platina del microscopio. Enfóquese con el objetivo de aceite de 60X en la intersección de la cruz.Seleccione el primer campo objetivo y utilice la herramienta de forma para definir las ROI en células individuales ubicadas en la proximidad inmediata de la intersección de la cruz. Seleccione áreas del nucleoplasma fuera de los nucléolos. Ajuste el plano focal Z para dirigir el láser a la mitad de los núcleos.A continuación, ajuste la potencia al mínimo necesario para activar la psoralena en la respuesta al daño del ADN inducido por entrecruzamiento intercadena. Se utiliza 1,2 %. Dispare el láser.Después de que todas las células de un campo hayan sido seleccionadas, mueva la placa a un nuevo campo, manteniéndose cerca de la intersección de la cruz. Repita el procedimiento recién demostrado en 12 a 18 campos para seleccionar un total de 80 a 100 células. Para recolectar las células, retire el recipiente de cultivo del portaobjetos.Retire el medio y lave las células con solución de PBS. Retire el PBS y coloque una gota de 10 microlitros de una solución comercial de tripsina-EDTA en la intersección de la cruz en el centro de la superficie de vidrio. Incube durante tres a cuatro minutos a temperatura ambiente y luego aspire la solución de tripsina con las células desprendidas en una punta de pipeta.Coloque la gota de tripsina-EDTA con las células en un extremo de un portaobjetos de vidrio silanizado. Para lisar las células y liberar el ADN, agregue 10 microlitros de solución de SDS al 5% e incube durante tres a cuatro minutos a temperatura ambiente, mezclando suavemente con la punta de pipeta, permitiendo que el perímetro de la gota se seque. Incline el portaobjetos 20 grados y permita que el líquido fluya hacia el extremo.Las fuerzas hidrodinámicas del líquido en movimiento extenderán y estirarán las fibras de ADN. Deje que la preparación se seque al aire durante 10 minutos. Sumerja la laminilla en una solución de tres a uno de metanol a ácido acético y fíjela durante 10 minutos.Luego, retire el portaobjetos de la solución fijadora y séquelo al aire nuevamente. En este punto, el portaobjetos puede almacenarse indefinidamente en etanol al 70 % a 20 grados Celsius. Para procesar el portaobjetos para la detección de señales de dig en fibras de ADN mediante microscopía de fluorescencia, retire el portaobjetos con el ADN extendido de la solución de etanol al 70 % y déjelo secar al aire.Posteriormente, desnature los fibras de ADN en ácido clorhídrico y luego transfiéralos a un recipiente con tris clorhídrico a pH ocho para la neutralización. A continuación, lave las muestras en PBS. Y finalmente, tiña con los anticuerpos apropiados siguiendo un procedimiento publicado previamente.Se muestra la estructura del trimetilpsoraleno con una etiqueta de dioxigenina. Los entrecruzamientos intercadena del ADN, o ICLs, pueden visualizarse mediante inmunofluorescencia contra dig TMP. Este ejemplo muestra células con una acumulación de un marcador bien conocido de la respuesta al daño del ADN, gamma H2AX, visualizado en verde, en las ROI que contienen ICLs localizados por láser, visualizados en rojo.El núcleo teñido con DAPI aparece en azul. El campo brillante muestra una célula parcialmente sobre la marca hecha con el lápiz de diamante. Tenga en cuenta que las ROI se colocan fuera de los nucléolos.Para determinar la frecuencia y el espaciado de los aductos, las células se incubaron en cinco clorodesoxiuridina durante 24 horas antes de la introducción de los ICL. Después de recolectar las células y extender las fibras de ADN, las señales dig se detectaron con un punto cuántico amino, visualizado en rojo en la cinco clorodesoxiuridina, mediante fluorescencia amino visualizada en verde. El análisis de las señales dig en las fibras revela que las distancias inter-ICL varían desde menos de 10 KB hasta más de 160 KB. No hubo evidencia de aductos agrupados.Según estas pautas, debería ser posible extender este enfoque a otros aductos de ADN, como las lesiones oxidativas que pueden localizarse mediante láseres de longitud de onda adecuada.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Este video muestra imágenes de resonancia de plasmones de superficie localizadas para detectar secreciones de proteínas de una sola célula. Utilizando una configuración microfluídica y un chip de nanoestructura plasmónica unido a péptidos, los cambios en la intensidad de la luz reflejada en el ángulo de resonancia revelan interacciones con las proteínas secretadas de una sola célula.

Imágenes de resonancia de plasmón de superficie localizada para detectar secreciones de proteínas de una sola célula

Se presenta en un proceso de alteración in situ de la IC tratada Si (001) de superficie en un estado hidrófilo o hidrófobo irradiando muestras en cámaras de microfluidos llenos 2 O 2 / H 2 O solución (0,01% -0,5%) o soluciones de metanol H mediante láser UV pulsada de un familiar fluencia bajo pulso.

Área selectivo Modificación de humectabilidad de la superficie del silicio por pulsos láser UV irradiación en Ambiente Líquido

Las imágenes espectroscópicas electrónicas pueden obtener imágenes y distinguir el ácido nucleico de la proteína con una resolución nanométrica. Se puede combinar con el sistema miniSOG, que es capaz de etiquetar específicamente proteínas marcadas en muestras de microscopía electrónica de transmisión. Ilustramos el uso de estas tecnologías utilizando como ejemplo los focos de reparación de roturas de doble cadena.

Visualización de miniSOG Tagged proteínas de reparación de ADN en combinación con Electron espectroscópico Imaging (ESI)

El objetivo de este protocolo es describir cómo utilizar microirradiation de láser para inducir a diferentes tipos de daños en el ADN, como roturas de cadena relativamente simple y complejo daño, para el estudio de ADN daños reparación y señalización de factor Asamblea en sitios de daño en vivo .

Microirradiation láser para estudiar In Vivo las respuestas celulares al daño en el ADN Simple y complejo

Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

Aplicación de Micro-la irradiación del Laser para la examinación de Single y doble filamento romper reparación en células de mamíferos

Estudiar la cinética de reparación de daños de ADN requiere un sistema para inducir lesiones en regiones definidas del nucleares. Se describe un método para crear localizados roturas de doble cadena utilizando un microscopio confocal de escaneo láser equipado con un 405 nm láser y procedimientos automatizados para cuantificar la dinámica de los factores de reparación de estas lesiones.

Investigación de reclutamiento de la proteína a las lesiones del ADN usando 405 Nm láser Micro-irradiación

Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la homogeneidad de etiquetado para cada especie de proteína en una muestra de proteína compleja en el nivel de molécula única.

Cuantificación de todo el proteoma de etiquetado homogeneidad en el nivel de molécula única

Describimos aquí métodos para la cuantificación sensible y precisa de las lesiones 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine (8-oxodGuo), 1,n6-etheno-2'-deoxyadenosine (1,n6-dado) y 1,n2- etheno-2'-desoxyguanosine (1,N2-DGUO) en el ADN. Los métodos se aplicaron a la evaluación de los efectos de las partículas finas ambientales (PM2,5) en los tejidos (pulmón, hígado y riñón) de ratones expuestos A/J.

Cuantificación de tres lesiones de ADN por espectrometría de masas y evaluación de sus niveles en los tejidos de los ratones expuestos a la materia particulada fina ambiental

Este protocolo presenta un método para utilizar dosimetría radical en línea y una fuente de luz plasmática para realizar la huella de proteínas de oxidación flash. Este método reemplaza el peligroso láser UV para simplificar y mejorar la reproducibilidad de la oxidación fotoquímica rápida de los estudios de proteínas.

Huella De Proteína De Radicales Hidroxilo Libre De Láser Para Realizar Análisis Estructurales De Orden Superior De Proteínas

Este protocolo describe un método no invasivo para identificar eficientemente las células de fase S para estudios de microscopía aguas abajo, como la medición del reclutamiento de proteínas de reparación del ADN mediante microirradiación láser.

Microirradiación láser para estudiar el reclutamiento de ADN durante la fase S

Aquí se presenta un protocolo robusto para aislar gránulos de neuromelanina del tejido humano post-mortem substantia nigra pars compacta mediante microdisección láser. Este protocolo revisado y optimizado minimiza enormemente el tiempo requerido para la recolección de muestras, reduce la cantidad de muestra requerida y mejora la identificación y cuantificación de proteínas mediante análisis LC-MS / MS.

Protocolo basado en microdisección láser para el análisis LC-MS/MS del perfil proteómico de gránulos de neuromelanina

Aprende análisis de moléculas individuales de ADN con láser para estudiar respuestas celulares a daño genómico. Este método permite imaginar directamente lesiones de ADN inducidas por compuestos activados con láser.

El análisis de moléculas individuales de láser localizadas psoraleno aductos

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