Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

El objetivo general de este método es generar de manera eficiente grandes cantidades de esferoides celulares robustos mediante agregación celular para su uso en una variedad de ensayos basados en células. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza una matriz no proteica soluble en agua para la agregación celular y la formación de esferoides, lo que permite un fácil y rápido aislamiento de los esferoides. Este método puede ayudar a obtener nuevos conocimientos en biología celular sobre los efectos de las interacciones célula-célula y célula/matriz en el crecimiento de los tejidos en un microambiente tridimensional.

Antes de preparar los agregados, caliente 50 mililitros de agua ultrapura a 80 grados centígrados y agregue 10 gramos de polvo de metilcelulosa. Agite la suspensión hasta que las partículas se dispersen uniformemente. Luego agregue agua ultrapura fría hasta un volumen final de 100 mililitros y almacene las partículas durante la noche a 4 grados centígrados hasta que la solución se vuelva clara y de color pajizo sin sólidos visibles.

Pase la solución a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar los fragmentos no disueltos y diluya 1:5 miligramos por mililitro de la solución filtrada en el medio de cultivo adecuado. A continuación, filtre el medio suplementado con metilcelulosa a través de un colador de 0,22 micrómetros. A continuación, en una cabina de bioseguridad, lavar un subcultivo confluente al 70% con PBS y unir las células con tres mililitros de tampón de asociación de tripsina-EDTA en una incubadora de cultivos celulares.

Después de unos minutos, inspeccione las células bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x. Cuando las células se hayan levantado de la placa, neutralice la reacción con siete mililitros de medio de cultivo suplementado con suero. Transfiera la solución celular a un tubo nuevo de 15 mililitros y luego recoja las células liberadas por centrifugación.

La causa más común de una formación fallida de esferoides, además de las partículas contaminantes, es el uso de concentraciones subóptimas de metilcelulosa o suero para la agregación y el crecimiento de su línea celular específica. NARRADOR-Usando una micropipeta P1000 con una punta de filtro, triture la paleta de tres a cinco veces con un mililitro del medio de formación de esferoide, presionando la punta de la pipeta contra el fondo del tubo en un ligero ángulo, mientras pipetea lentamente sin expulsar todo el contenido de la punta para espurar el pellet. Después de contar, diluya la suspensión celular a una concentración de una por 10 a la cuarta celdas por mililitro, y enjuague un depósito de pipeta multicanal estéril con agua ultrapura filtrada para eliminar el polvo y las fibras.

Dispense las celdas en el depósito y use las puntas de filtro para transferir 100 microlitros de las celdas a cada pocillo de una placa repelente de celdas de fondo en U de 96 pocillos, mezclando la suspensión celular periódicamente para evitar que las celdas se depositen en el fondo del reservorio. Cuando todas las células se hayan asentado, coloque la placa en una incubadora de cultivo de tejidos e inspeccione los pocillos diariamente para detectar la formación de esferoides. Las células deben asentarse en el fondo de cada pocillo dentro de las seis horas y, por lo general, agregarse en un esferoide dentro de las 24 a 48 horas.

Para confirmar la formación de un esferoide exitoso, use una punta P10 bajo un microscopio óptico para pipetear suavemente el medio sobre el esferoide. Los esferoides correctamente formados se desprenderán de la placa y rodarán, confirmando su estructura 3-D. Para incrustar los esferoides en el colágeno, utilice el pipeteo inverso para cubrir uniformemente el fondo de cada pocillo de un portaobjetos de cámara de cultivo de tejidos de ocho pocillos con un mínimo de 50 microlitros de colágeno neutralizado por pocillo.

Cuando se hayan cubierto todos los pocillos, coloque el portaobjetos de la cámara en una placa de cultivo de tejidos de 35 milímetros llena de agua ultrapura en una placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros e incube la placa de cultivo de tejidos de 10 centímetros a 37 grados centígrados durante aproximadamente una hora. Cuando el colágeno se haya polimerizado, use una punta de filtro P1000 para transferir cuidadosamente los esferoides preformados a tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Es fundamental que las capas base de colágeno se incuben hasta que estén completamente polimerizadas para evitar perturbar el colágeno al agregar los esferoides o el medio.

Narrador Recoja los esferoides recolectados en una microcentrífuga de mesa y use una pipeta P200 para eliminar los sobrenadantes, absorbiendo cualquier exceso de sobrenadante mediante la inversión del tubo en una toalla de papel limpia según sea necesario. Con una punta de pipeta P200 de diámetro ancho, vuelva a suspender inmediatamente los esferoides en 50 microlitros de colágeno neutralizado y transfiera cuidadosamente las mezclas de colágeno esferoide a cada pocillo del portaobjetos de la cámara de cultivo de tejidos de ocho pocillos. Regrese el portaobjetos a la incubadora hasta que el colágeno se polimerice.

Después de aproximadamente una hora, agregue lentamente al menos 100 microlitros de medio de cultivo calentado que contenga el tratamiento adecuado de interés para cada pocillo para otra incubación. A continuación, utilice un microscopio de fluorescencia para adquirir secciones de imágenes ópticas a través de los esferoides invasores. Con este protocolo, se pueden generar esferoides a partir de una variedad de líneas celulares.

Bajo las condiciones apropiadas de tratamiento con metilcelulosa y suero, las células individuales se asientan y se adhieren juntas en el centro del pocillo para formar esferoides con una adherencia mínima al fondo del pocillo. Algunas líneas celulares son capaces de adherirse a las placas repelentes celulares en ausencia o a bajas concentraciones de metilcelulosa, lo que da lugar a la formación de un esferoide rodeado por una monocapa celular. En general, las concentraciones más altas de metilcelulosa impiden que las células se adhieran al pozo.

Pero una concentración demasiado alta de metilcelulosa reduce la adhesión célula a célula y evita que las células se asienten en el fondo del pozo, lo que resulta en la formación de agregados sueltos y numerosos esferoides satélite. Los esferoides incrustados en colágeno se pueden tratar con un quimioatrayente para inducir la invasión de células individuales hacia afuera del esferoide hacia la matriz circundante. Los esferoides incrustados en colágeno fijo se pueden obtener mediante microscopía de campo claro para cuantificar la distancia y el número de células invasoras, o mediante microscopía de inmunofluorescencia para visualizar las estructuras invasivas formadas por las células migratorias.

Es importante dejar tiempo suficiente para que las células se agreguen en esferoides estructuralmente sanos que sean lo suficientemente robustos para su manipulación sin fragmentarse, y que puedan recogerse fácilmente para su uso en ensayos posteriores. Nuestro protocolo de crecimiento celular se puede adaptar aún más para múltiples ensayos de biología celular. Por ejemplo, el asentamiento de las células en medios suplementados con altas concentraciones de metilcelulosa se puede utilizar para evaluar la resistencia a la celanía.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar esferoides celulares tridimensionales por agregación, lo que será una herramienta valiosa para muchas aplicaciones de biología celular.