Un método de agregación celular eficiente y flexible para esferoide 3D Producción

NARRADOR El objetivo general de este método es generar eficientemente grandes cantidades de esferoides celulares robustos mediante agregación celular para su uso en una variedad de ensayos basados en células. La principal ventaja de esta técnica es que utiliza una matriz soluble en agua no proteica para la agregación celular y la formación de esferoides, lo que permite un aislamiento fácil y rápido de los esferoides. Este método puede ayudar a obtener nuevas perspectivas en biología celular sobre los efectos de las interacciones célula-célula y célula/matriz en el crecimiento tisular en un microentorno tridimensional.

NARRADOR Antes de preparar los agregados, caliente 50 mililitros de agua ultrapura a 80 grados Celsius y agregue 10 gramos de polvo de metilcelulosa. Agite la suspensión hasta que las partículas se dispersen uniformemente. Luego añada agua ultrapura fría hasta alcanzar un volumen final de 100 mililitros y almacene las partículas durante toda la noche a 4 grados Celsius hasta que la solución se vuelva transparente y de color amarillo pálido, sin sólidos visibles.

Pase la solución a través de un filtro de 0,45 micrómetros para eliminar cualquier fragmento no disuelto y diluya 1:5 miligramos por mililitro de la solución filtrada en el medio de cultivo adecuado. Luego, filtre el medio suplementado con metilcelulosa a través de un tamiz de 0,22 micrómetros. A continuación, en una cabina de seguridad biológica, lave un subcultivo con 70 % de confluencia con PBS y desprenda las células con tres mililitros de tampón de asociación tripsina-EDTA en un incubador de cultivo celular.

Después de unos minutos, inspeccione las células bajo un microscopio óptico con un aumento de 10x. Cuando las células se hayan desprendido de la placa, neutralice la reacción con siete mililitros de medio de cultivo suplementado con suero. Transfiera la solución celular a un tubo nuevo de 15 mililitros y luego recolecte las células liberadas mediante centrifugación.

La causa más común de una formación de esferoides fallida, aparte de partículas contaminantes, es el uso de concentraciones subóptimas de metilcelulosa o suero para la agregación y el crecimiento de su línea celular específica. NARRADOR: Utilizando una micropipeta P1000 con punta filtrada, triture el precipitado tres a cinco veces con un mililitro del medio de formación de esferoides, presionando la punta de la pipeta contra el fondo del tubo en un ángulo ligero, mientras pipetea lentamente sin expulsar todo el contenido de la punta para romper mecánicamente el precipitado. Después del recuento, diluya la suspensión celular a una concentración de un 1 × 10⁴ células por mililitro y enjuague un depósito estéril para pipeta multicanal con agua ultrapura filtrada para eliminar cualquier polvo y fibras.

Dispense las células en el reservorio y utilice puntas filtrantes para transferir 100 microlitros de las células a cada pocillo de una placa de fondo en U con superficie repelente a células de 96 pocillos, mezclando periódicamente la suspensión celular para evitar que las células se sedimenten en el fondo del reservorio. Una vez que todas las células se hayan asentado, coloque la placa en un incubador de cultivo de tejidos e inspeccione los pocillos diariamente para verificar la formación de esferoides. Las células deben sedimentar en el fondo de cada pocillo dentro de las seis horas y, por lo general, agregarse en un esferoide dentro de las 24 a 48 horas.

Para confirmar la formación de un esferoide exitoso, utilice una punta P10 bajo un microscopio óptico para pipetear suavemente medio sobre el esferoide. Los esferoides correctamente formados se soltarán de la placa y rodarán, confirmando su estructura tridimensional. Para incrustar los esferoides en colágeno, utilice pipeteo inverso para recubrir uniformemente el fondo de cada pocillo de una placa de cultivo tisular de ocho pocillos con un mínimo de 50 microlitros de colágeno neutralizado por pocillo.

Una vez que todos los pocillos estén cubiertos, coloque la placa de cámara en una placa de cultivo tisular de 35 milímetros llena con agua ultrapura dentro de una placa de cultivo tisular de 10 centímetros e incube la placa de 10 centímetros a 37 grados Celsius durante aproximadamente una hora. Cuando el colágeno haya polimerizado, utilice una punta filtrada P1000 para transferir cuidadosamente los esferoides preformados a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros. Es fundamental que las capas basales de colágeno se incuben hasta que estén completamente polimerizadas para evitar alterar el colágeno al agregar los esferoides o el medio.

Narrador Recolecte los esferoides cosechados en una microcentrífuga de banco y use una pipeta P200 para eliminar los sobrenadantes, absorbiendo cualquier exceso mediante inversión del tubo sobre una toalla de papel limpia según sea necesario. Usando una punta de pipeta P200 de gran orificio, resuspenda inmediatamente los esferoides en 50 microlitros de colágeno neutralizado y transfiera cuidadosamente las mezclas de esferoides y colágeno a cada pocillo de la placa de cultivo tisular de ocho pocillos. Devuelva la placa al incubador hasta que el colágeno se haya polimerizado.

Después de aproximadamente una hora, agregue lentamente al menos 100 microlitros de medio de cultivo calentado que contenga el tratamiento adecuado de interés a cada pocillo para una incubación adicional. Luego, utilice un microscopio de fluorescencia para adquirir secciones de imágenes ópticas a través de los esferoides invasores. Mediante este protocolo, se pueden generar esferoides a partir de una variedad de líneas celulares.

Bajo condiciones adecuadas de metilcelulosa y suero, las células individuales se sedimentan y adhieren entre sí en el centro del pocillo, formando esferoides con una adhesión mínima al fondo del pocillo. Algunas líneas celulares pueden adherirse a placas repelentes para células en ausencia o a bajas concentraciones de metilcelulosa, lo que da lugar a la formación de un esferoide rodeado por una monocapa celular. En general, concentraciones más altas de metilcelulosa impiden que las células se adhieran al pocillo.

Pero una concentración demasiado alta de metilcelulosa reduce la adhesión entre célula y célula, e impide que las células se sedimenten en el fondo de la placa, lo que resulta en la formación de agregados sueltos y numerosos esferoides satélite. Los esferoides embebidos en colágeno pueden tratarse con un quimioatractivo para inducir la invasión de células individuales desde el esferoide hacia la matriz circundante. Los esferoides embebidos en colágeno fijados pueden observarse mediante microscopía de campo claro para cuantificar la distancia y el número de células invasoras, o mediante microscopía de inmunofluorescencia para visualizar las estructuras invasivas formadas por las células migratorias.

Es importante permitir tiempo suficiente para que las células se agreguen en esferoides estructuralmente estables que sean lo suficientemente resistentes como para manipularlos sin fragmentarse, y que puedan recolectarse fácilmente para su uso en ensayos posteriores. Nuestro protocolo de crecimiento celular puede adaptarse aún más para múltiples ensayos de biología celular. Por ejemplo, sembrar las células en medios suplementados con altas concentraciones de metilcelulosa puede utilizarse para evaluar la resistencia celanoica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar esferoides celulares tridimensionales mediante agregación, lo cual será una herramienta valiosa para muchas aplicaciones en biología celular.