Name: Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprende a transfectar células Th17 humanas con ARN pequeño mediante electroporación de última generación. Este método eficiente permite estudiar la diferenciación y función inmune de linfocitos T primarios.

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU. (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), un premio académico de la Sociedad de Leucemia y Linfoma (K.M.A.) y el Programa de Capacitación de Científicos Médicos del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS) (Grant #T32GM007618) (M.M.).

Este protocolo se adhiere a las directrices de la UCSF para la ética de investigación en humanos. 1. Preparación de T cultivo celular, el aislamiento de células T CD4 + y la polarización Th17 <ol><li> En el Día 0, capa placas de cultivo tisular de 6 pocillos con 1,5 ml por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C. <ol><li> Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm. </li></ol></li><li> Preparar las células mononucleares de sangre de cordón (CBMCs) por centrifugación en gradiente de densidad de acuerdo con las instrucciones del fabricante. PRECAUCIÓN: Trabajar con cuidado y asegurar que el equipo de protección personal (EPP) se utilizar para la manipulación de la sangre humana para evitar cualquier riesgo de exposición a patógenos transmitidos por la sangre. </li><li> Una vez que se han aislado y se lavó las células mononucleares, lleve a cabo el aislamiento de células T CD4 + humano por sele negativocción utilizando un kit comercial de células T CD4 humano +. NOTA: Si hay contaminación de glóbulos rojos después del aislamiento de células mononucleares, una lisis de glóbulos rojos opcional puede llevarse a cabo antes de las etapas de aislamiento de células T CD4 +. Resuspender las células mononucleares en 1 ml de tampón de aislamiento (2% de FBS en PBS). Añadir 5 ml de solución de lisis 1x. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. A continuación, añadir 5 ml de tampón de aislamiento y se centrifuga a 300 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. <ol><li> Resuspender las células mononucleares a una densidad de 50 x 10 6 por 500! L en el tampón de aislamiento en un nuevo tubo de 5 ml. </li><li> Añadir 100 ml de FBS y 100 l de la mezcla de anticuerpo por tubo a continuación, incubar cada tubo a 4 ° C durante 20 min en un agitador orbital a mezclar bien. </li><li> Después de la incubación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento para lavar las células. Centrifugar las células a 300 xg durante 8 minutos a 4 ° C para sedimentar las células. aspirar con cuidado la supernatant. </li><li> Durante este giro, antes de lavar las perlas magnéticas. Transferir la cantidad deseada de perlas magnéticas en un nuevo tubo (utilizado a 1: 1 con las células) y se añade un volumen igual de tampón de aislamiento para lavar las perlas. Mezclar bien usando una micropipeta ml 1 y luego colocar el tubo en el imán durante al menos 1 min. aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Resuspender las perlas magnéticas en el mismo volumen inicialmente transferido antes de la colada. </li><li> Resuspender las células en cada tubo con 500! L del tampón de aislamiento y añadir 500 l de perlas magnéticas pre-lavado. </li><li> Se incuban las células con las perlas magnéticas durante 15 min en un agitador orbital a temperatura ambiente (18 ° C a 25 ° C) para mezclar bien. </li><li> Después de la incubación, pipetear a fondo las células utilizando una micropipeta de 1 ml, al menos 10 veces. A continuación, añadir 34 ml de tampón de aislamiento y coloque cada tubo en el imán durante 2 min. </li><li> Transferir cuidadosamente las células T CD4 + seleccionadas negativamente que se encuentran enel sobrenadante a un nuevo tubo. </li></ol></li><li> Una vez que se ha completado el aislamiento de células T CD4 +, contar las células con un hemocitómetro y mantener las células en hielo. </li><li> Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 1,5 ml de 2x mezcla de medios Th17-polarizar a cada pocillo: IFN anti-humano (20 g / ml), anti-IL-4 humana (20 mg / ml), TGF humano (10 ng / ml), humana IL-1β (40 ng / ml), IL-23 (40 ng / ml), IL-6 humana (50 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol). NOTA: La transfección y la interferencia de ARN hace el trabajo en medios que contienen suero. El propósito de usar medios libres de suero con este protocolo es para lograr una mejor producción de IL-17A. </li><li> Centrifugar las células T CD4 + humanos a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para sedimentar las células. Aspirar con cuidado la Supernathormiga. Entonces resuspender las células en medios de base libre de suero y la placa de las células a una densidad de 3 x 10 6 en 1,5 ml por pocillo de modo que el volumen final es de 3 ml por pocillo y las citocinas polarizantes están ahora a una concentración final de 1x. <ol><li> Colocar las placas en 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante dos días. </li></ol></li></ol> 2. Las células Electroporación de In Vitro Polarized Th17 humana <ol><li> En el Día 2, la capa de placas de cultivo tisular de 48 pocillos con 250! L por pocillo de anti-CD3 humano (2 g / ml) y CD28 anti-humano (4 mg / ml) en PBS con calcio y magnesio durante al menos 2 h en 37 ° C. <ol><li> Alternativamente, revestir las placas durante la noche a 4 ° C. Envolver las placas en Parafilm. </li></ol></li><li> Preparar pequeños ARN para la transfección. Para cada transfección, alícuota de 1 l de una 5 M solución madre de siRNA en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incluir pequeñas contr ARN química con ajuste apropiadool. Mantenga todos los tubos en hielo. </li><li> Lavar las placas recubiertas de anticuerpos dos veces con PBS. A continuación, añadir 500 l de 1X Th17-polarizando medios de comunicación a cada pocillo: IFN anti-humano (10 g / ml), anti-IL-4 humana (10 mg / ml), TGF humana (5 ng / ml), IL-humana 1β (20 ng / ml), IL-23 (20 ng / ml), IL-6 humana (25 ng / ml) todo diluyó en un medio de base libre de suero (suplementado con 2 mM L-glutamina, 100 U / ml de penicilina, 100 mg / ml de estreptomicina, HEPES 10 mM, piruvato de sodio 1 mM y 100 mM 2-mercaptoetanol). </li><li> Después se preparan las placas de cultivo y reactivos de transfección, resuspender las células con un 1 ml micropipeta, pipeteado suave pero que garantiza que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Reunir las células en un tubo cónico y se centrifuga a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. NOTA: Para los períodos de cultivo más largo que el protocolo de cuatro días presentado en el presente documento, las células deben transfectarse aproximadamente cada 3 días usando este mismo protocolo. Paso 20.4 debería modificarse sin embargo ya que las células tratadas con diferentes ARNs pequeños no se mezclarán. Todas las condiciones se están probando debe recogerse, contados, y se transfectaron por separado. </li><li> aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego volver a suspender las células en al menos 1 ml de PBS para lavar. Contar las células Th17 en vivo (por ejemplo con un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano para evaluar la viabilidad) y luego transferir las células a un tubo de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a 500 xg durante 5 min a temperatura ambiente para sedimentar las células. </li><li> Aspirar cuidadosamente el sobrenadante, y luego resuspender las células usando el tampón de resuspensión proporcionado en el kit de sistema de transfección 10 l a una densidad de 2,5-4 x 10 7 células por ml. Mantener las células a temperatura ambiente. NOTA: Como pauta, tratar de preparar sólo como muchas células como se puede transfectadas dentro de 30 min. Varios lotes se pueden comparar. </li><li> Añadir 9 l de células a 1 l de ARN pequeño en cada MicroCtubo entrifuge. Pipetear una vez para mezclar las células y los pequeños ARN para la transfección a continuación, cargar en la punta del electrodo pipeta proporcionado. NOTA: Típicamente, añadir 9,5! L de suspensión de células para asegurar que hay suficiente de la mezcla para evitar la creación de burbujas en la punta del electrodo de pipeta antes de la transfección. </li><li> Llenar la cubeta proporcionado con 3 ml de temperatura ambiente electrolítico Buffer E. Place la cubeta dentro de la estación de pipeta y luego colocar la pipeta en posición dentro de la cubeta. </li><li> Inmediatamente electroporar cada 10? L de la mezcla de células y pequeños ARN utilizando los siguientes parámetros: voltaje de impulso 1,500-1,550 V, anchura de impulso de 10 ms, y 3 pulsos total en el dispositivo de la transfección. </li><li> Después de la electroporación es completa, añadir directamente a la mezcla de células a 500 l de medio 1X Th17 polarizante en pozos preparados de una placa de cultivo. Placas lugar en un 5% de CO2, 37 ° C incubadora durante dos días más. NOTA: Lavar la punta del electrodo pipeta pipeteandoarriba y abajo en PBS entre cada transfección. </li></ol> 3. Las células de cosecha Th17 humana <ol><li> Resuspender las células en medios de cultivo con una micropipeta, pipeteando suavemente pero asegurando que todas las células se separan del fondo de los pocillos. Preparar las células para ensayos de expresión funcionales y / o de genes. NOTA: Rutinariamente, suficientes células se produjeron a partir de un único pocillo de células Th17 transfectadas para ser utilizado para el análisis de citometría de flujo de marcador de superficie e intracelular de citoquinas y factor de transcripción tinción o para la preparación de ARN para el análisis de la expresión génica. </li></ol>

<ol><li>Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Effector+CD4+T+Cell+Populations%2A%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*.</a> Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).</li>
<li>Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-17+and+Th17+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">IL-17 and Th17 Cells.</a> Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).</li>
<li>Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+IL-23-IL-17+immune+axis%3A+from+mechanisms+to+therapeutic+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The IL-23-IL-17 immune axis: from mechanisms to therapeutic testing.</a> Nature. 14 (9), 585-600 (2014).</li>
<li>Romagnani, S., Maggi, E., Liotta, F., Cosmi, L., Annunziato, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+and+origin+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Properties and origin of human Th17 cells.</a> Mol Immunol. 47 (1), 3-7 (2009).</li>
<li>Acosta-Rodriguez, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+phenotype+and+antigenic+specificity+of+human+interleukin+17-producing+T+helper+memory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Surface phenotype and antigenic specificity of human interleukin 17-producing T helper memory cells.</a> Nature Immunol. 8 (6), 639-646 (2007).</li>
<li>Annunziato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+and+functional+features+of+human+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Phenotypic and functional features of human Th17 cells.</a> J Exp Med. 204 (8), 1849-1861 (2007).</li>
<li>Du, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+miR-326+regulates+TH-17+differentiation+and+is+associated+with+the+pathogenesis+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">MicroRNA miR-326 regulates TH-17 differentiation and is associated with the pathogenesis of multiple sclerosis.</a> Nature Immunol. 10 (12), 1252-1259 (2009).</li>
<li>Escobar, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miR-155+Activates+Cytokine+Gene+Expression+in+Th17+Cells+by+Regulating+the+DNA-Binding+Protein+Jarid2+to+Relieve+Polycomb-Mediated+Repression%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">miR-155 Activates Cytokine Gene Expression in Th17 Cells by Regulating the DNA-Binding Protein Jarid2 to Relieve Polycomb-Mediated Repression.</a> Immunity. 40 (6), 865-879 (2014).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+regulation+of+Hif1a+expression+and+TH17+differentiation+by+the+hypoxia-regulated+microRNA+miR-210%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">Negative regulation of Hif1a expression and TH17 differentiation by the hypoxia-regulated microRNA miR-210.</a> Nature Immunol. 15 (4), 393-401 (2014).</li>
<li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+transfection%3A+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+bioanal+chem%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal bioanal chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Steiner, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-29+Regulates+T-Box+Transcription+Factors+and+Interferon-%26gamma%3B+Production+in+Helper+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-29 Regulates T-Box Transcription Factors and Interferon-&gamma; Production in Helper T Cells.</a> Immunity. 35 (2), 169-181 (2011).</li>
<li>Simpson, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+upregulated+in+asthma+airway+T+cells+promotes+TH2+cytokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunol%22%5BJournal%5D)">A microRNA upregulated in asthma airway T cells promotes TH2 cytokine production.</a> Nature Immunol. 15 (12), 1162-1170 (2014).</li>
<li>Pua, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+24+and+27+Suppress+Allergic+Inflammation+and+Target+a+Network+of+Regulators+of+T+Helper+2+Cell-Associated+Cytokine+Production%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs 24 and 27 Suppress Allergic Inflammation and Target a Network of Regulators of T Helper 2 Cell-Associated Cytokine Production.</a> Immunity. 44 (4), 821-832 (2016).</li>
<li>Flaherty, S., Reynolds, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Na%C3%AFve+CD4%2B+T+Cell+Isolation+and+In+vitro+Differentiation+into+T+Cell+Subsets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse Naïve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets.</a> J Vis Exp. (98), (2015).</li>
<li>Schumann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+knock-in+primary+human+T+cells+using+Cas9+ribonucleoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 112 (33), 10437-10442 (2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un método mejorado para el suministro de pequeños ARN en células Th17 humanos. Aunque se utilizaron células Th17 humanos aquí, este método de electroporación con pequeños ARN se puede utilizar con otros subconjuntos helper humano primario T, tales como Th1, Th2, y Tregs. No ha funcionado bien para las células T CD4 + vírgenes por lo que las células deben ser activadas en cultivo antes de la transfección. Para este protocolo, primero optimizado el sistema de cultivo in v...

Células T CD4 + son orchestrators cruciales de la respuesta inmune adaptativa. Células T CD4 + vírgenes son capaces de desarrollar en varias células T efectoras diferentes (por ejemplo, Th1, Th2, Th17, etc.), cada uno con su propio conjunto de citocinas características y factores de transcripción, dependiendo de la microentorno local 1. Las decisiones del linaje que las células T hacen son críticos tanto para la inmunidad protectora y la tolerancia a la libre. Células Th17 son un subconjunto de células T conocidos para combatir bacterias y hongos extracelulares, pero sus respuestas incorrectas también están implicados en la patogénesis de múltiples enfermedades autoinmunes e inflamatorias tales como esclerosis múltiple y psoriasis 2, 3. Células Th17 humanos pueden ser generados a partir de células T CD4 + vírgenes in vitro, proporcionándoles un ambiente de polarización apropiado 4. Vario<html> nos combinaciones de las citoquinas IL-1β, IL-23, TGF, y IL-6 se han utilizado para el desarrollo de las células Th17 humanos. Células Th17 humanos expresan CCR6, un receptor de quimioquinas que se utiliza comúnmente para identificar esta población de células y se define por la expresión de su director factor de transcripción, RORγt (codificada por RORC) 5, 6. células Th17 tienen la capacidad de expresar múltiples citocinas, pero IL-17A es la citoquina efectora linaje-definir producido por estas células. Se examinó la expresión de los tres marcadores Th17-asociado (CCR6, RORγt, IL-17A) para evaluar la solidez de nuestro ensayo de diferenciación humana Th17 in vitro. Además, se cultivaron células T CD4 + humanas en condiciones no polarización, donde no se añadieron citoquinas o anticuerpos de bloqueo a los medios de cultivo para su uso como un control negativo ya que la expresión de estos marcadores Th17 debe ser muy baja o ausente. ve_content &quot;&gt; Una manera de estudiar el desarrollo humano normal T biología celular y es manipular la expresión génica durante su desarrollo.-ARN corto de interferencia (ARNsi) son pequeñas moléculas de ARN sintéticos que se dirigen a ARNm codificantes de proteínas y pueden ser utilizados para reducir la expresión de genes específicos . microARNs (miARN) son endógenos no codificantes ARN pequeños conocidos para modular la expresión del gen post-transcripcionalmente. miRNAs han sido demostrado que desempeñan un papel importante tanto en murino y la biología de células T humanas, incluso en las células Th17 7, 8, 9. se es crucial tener métodos fiables de manipulación de la actividad de ARN pequeño en las células T humanas para estudiar sus efectos sobre la expresión de genes y en última instancia, sobre la biología de células T humanas. a continuación, describimos un protocolo fácil de uso, consistente y fiable que hemos desarrollado para introducir pequeños RNAs sintéticos y ácidos nucleicos bloqueados (LNA, modificar químicamente los ácidos nucleicos con una mayor estabilidad)en células inmunes, y específicamente en células Th17 humanos. Hay varios métodos alternativos de introducción de pequeños ARN en células de mamífero, que generalmente se dividen en categorías químicas, biológicas o físicas 10. métodos químicos normalmente usados, incluyendo transfecciones basadas en lípidos y transfecciones de calcio-fosfato, se basan en la creación de complejos de ADN-químico que se toman más eficientemente por las células. En general, los métodos químicos no son tan eficientes para la transfección de células T primarias. El método biológico más común es usar un vector viral (por ejemplo, retrovirus o lentivirus), que inserta directamente ARN extraño en un huésped como parte de su ciclo de replicación natural. transducción viral típicamente tarda más tiempo en completar, especialmente cuando se toma en cuenta el tiempo para la clonación molecular de los plásmidos proviral. Además, los vectores virales de transducción pueden ser potencialmente dañinos para los investigadores humanos. La electroporación es un m físicaétodo de inducir permeabilización de la membrana sometiendo las células a pulsos de alto voltaje, permitiendo que los ácidos nucleicos para introducir transitoriamente en la célula donde pueden actuar en su objetivo. instrumentos de electroporación tradicionales no eran eficaces para transfectar linfocitos primarios. Sin embargo, optimizado siguiente electroporación generación ha demostrado ser capaz de transfectar las células T a muy alta eficiencia, especialmente cuando el material a transfectar es pequeño ARN. El término próxima generación se utiliza libremente para diferenciar las dos plataformas más recientes (por ejemplo, neón, Amaxa) de máquinas de electroporación tradicionales. Además, este método es fácilmente escalable para pantallas de rendimiento moderados con hasta aproximadamente 120 pequeños RNAs en un solo experimento, a menudo utilizando reactivos sintéticos validados. Es importante destacar que las transfecciones con éxito se puede lograr en tan poco como 16 h después de la activación de células T. La desventaja de este método, sin embargo, es que no da como resultado de plástic genómico establesucesivamente, y es por lo tanto transitoria. Por lo tanto, vale la pena el esfuerzo extra para crear una construcción de expresión estable que puede ser empaquetado en un vector viral y se expresó con éxito en las células T en los casos en que se requiere la expresión a largo plazo de un pequeño ARN. Hemos utilizado una próxima generación de transfección (por ejemplo, neón) para ofrecer diversas herramientas sintéticos individuales o de doble hebra de ARN o de oligonucleótidos LNA para diferentes propósitos 11, 12, 13. la interferencia de ARN eficiente puede ser inducida en el ratón primario y las células T humanas utilizando ARN-interferencia corto de doble hebra (siRNA). Este protocolo describe condiciones optimizadas para el uso de esta técnica en las células Th17 humanos. Además de siRNAs, disponibles comercialmente imita e inhibidores de miARN sintéticos pueden ser utilizados para estudiar el aumento de miARN y pérdida de función. imita miARN son moléculas de ARN de doble cadena muy similares a siRNAs, pero designed con la secuencia de miRNAs maduros endógenos. inhibidores de miARN están químicamente modificados de ARN y / o LNA basado oligonucleótidos monocatenarios que se unen a miRNAs nativas y antagonizan su función. Hemos encontrado que todas estas herramientas se pueden utilizar de manera efectiva en los linfocitos T primarias cultivadas, incluyendo pero no limitado a las células Th17 humanos.

<table><tbody><tr><td>anti-humano IL-17A PE</td><td>ebiociencia</td><td>12-7179-42&nbsp;</td><td>Clon: eBio64DEC17</td></tr><tr><td>anti-humano IFNg FITC</td><td>ebioscience</td><td>11-7319-82</td><td>Clon: 4S. B3</td></tr><tr><td>anti-humano CD4 eVolve605</td><td>ebioscience</td><td>83-0047-42</td><td>Clon: SK3</td></tr><tr><td>ratón anti-humano CD196 (CCR6) BV421</td><td>BD biosciences</td><td>562515</td><td>Clon: 11A9</td></tr><tr><td>anti-humano RORgt AF647</td><td>BD biociencias</td><td>563620</td><td>Clon: Q21-559</td></tr><tr><td>anti-humano CD45 eFluor450</td><td>ebioscience</td><td>48-9459-42</td><td>Clon: 2D1</td></tr><tr><td>Foxp3/Tinción de factor de transcripción Conjunto de tampones</td><td>ebioscience</td><td>00-5523-00</td><td>Para tinción con citometría de flujo de factor de transcripción intracelular</td></tr><tr><td>Inhibidor de unión Hu FcR ebioscience purificado</td><td></td><td>14-9161-71</td><td></td></tr><tr><td>ImmunoCult-XF Medio de expansión de células T</td><td>Stemcell Technologies</td><td>10981</td><td>"Medios de base sin suero"</td></tr><tr><td>MACS CD28 grado funcional puro, humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-375</td><td>Clon: 15E8</td></tr><tr><td>anti-humano CD3 Purificado</td><td>UCSF monocuerpo</td> núcleo N<td>/A</td><td>Clon: OKT-3</td></tr><tr><td>LEAF purificado anti-humano IL-4</td><td>Biolegend</td><td>500815</td><td>Clon: MP4-25D2</td></tr><tr><td>anti-humano IFNg, grado funcional purificado</td><td>ebioscience</td><td>16-7318-85</td><td>Clon: NIB42</td></tr><tr><td>IL-23 humano recombinante</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-23</td><td></td></tr><tr><td>IL-1 humana recombinante y beta;</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-01B</td><td></td></tr><tr><td>TGF-& beta humano recombinante; 1</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>100-21C</td><td></td></tr><tr><td>IL-6 humano recombinante</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>200-06</td><td></td></tr><tr><td>Pool de control siGENOME, no objetivo #2</td><td>Dharmacon</td><td>D-001206-14-05</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool RORC Humano</td><td>Dharmacon</td><td>M-003442-00</td><td></td></tr><tr><td>siGENOME SMARTpool PTPRC humano Dharmacon</td><td></td><td>M-008067-01</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Kit de células T CD4 humanas intactas</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11346D</td><td>Célula T humana CD4+ Kit de aislamiento</td></tr><tr><td>Sistema de tranfectión de neón</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Instrumento de electroporación de última generación</td></tr><tr><td>Sistema de tranfectión de neón 10 &mu; L Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de resuspensión T</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Provisto en kit (MPK1096)</td><td>"Tampón de resuspensión de transfección"</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Stemcell Technologies</td><td>#07801</td><td>Gradiente de densidad Medio costar</td></tr><tr><td>Placas tratadas de cultivo de tejidos de 6 pocillos</td><td>Placas de</td><td>fondo plano Corning</td><td></td></tr> <tr><td>3516Placas tratadas para cultivo de tejidos de 48 pocillos</td><td>Corning</td><td>3548</td><td>Placas de fondo plano</td></tr><tr><td>BD Pharm Tampón de lisado Lyse, 10x</td><td>BD biosciences</td><td>555899</td><td>Debe hacer 1x solución con agua destilada antes de usar</td></tr></tbody></table>

small rna transfección en células primarias th17 humano por next generation electroporación

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

Las células T CD4+ pueden diferenciarse en varios subconjuntos de células T auxiliares efectoras dependiendo del entorno de citocinas circundante. Las células Th17 se pueden generar a partir de células T CD4+ vírgenes vírgenes activándolas en presencia de las citocinas polarizantes IL-1β, IL-6, IL-23 y TGFβ. Las células Th17 orquestan la inmunidad contra bacterias y hongos extracelulares, pero su actividad aberrante también se ha asociado con varias enfermedades autoinmunes e inflamatorias. Las células Th17 se identifican por el receptor de quimiocinas CCR6 y se definen por su factor de transcripción maestro, RORγt, y la citocina efectora característica, IL-17A. Las condiciones de cultivo optimizadas para la diferenciación de células Th17 facilitan los estudios mecanicistas de la biología de las células T humanas en un entorno controlado. También proporcionan un entorno para estudiar la importancia de genes específicos y programas de expresión génica a través de la interferencia de ARN o la introducción de imitadores o inhibidores de microARN (miARN). Este protocolo proporciona un método fácil de usar, reproducible y altamente eficiente para la transfección transitoria de células Th17 humanas primarias diferenciadas con ARN pequeños utilizando un dispositivo de electroporación de próxima generación.

El primer paso para desarrollar un sistema fiable de electroporación con éxito células Th17 humanos era generar robusto en cultivos de células Th17 humanos in vitro diferenciados. Las células T cultivadas en condiciones Th17-polarizantes expresan el receptor de quimiocinas CCR6 y el factor de transcripción RORγt (Figura 1A, izquierda). Estos marcadores no se expresaron cuando se cultivaron las células T en condiciones no polarizante (THN) (Figur...

La electroporación de próxima generación es un método eficiente para transfectar células Th17 humanas con ARN pequeños para alterar la expresión génica y el comportamiento celular.

Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

El objetivo general de este procedimiento es transfectar de manera eficiente linfocitos T humanos primarios con reactivos de ARN pequeño utilizando electroforesis de próxima generación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de los linfocitos T, como la forma en que productos génicos específicos regulan la diferenciación y la función inmunitaria de los linfocitos T. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método altamente eficiente y confiable para transfectar linfocitos T humanos primarios con ARNp y otros reactivos sintéticos de ARN pequeño.Este método puede proporcionar información sobre la biología de las células Th17 humanas, pero también puede aplicarse a otros sistemas, como otros linfocitos de humanos o ratones. En el día cero, recubra placas de cultivo celular de seis pocillos con 1,5 mililitros por pocillo de anticuerpo antihumano CD3 y anticuerpo antihumano CD28 en PBS con calcio y magnesio durante al menos dos horas a 37 grados Celsius. Una vez que las células mononucleares de sangre de cordón, o CBMCs, hayan sido aisladas y lavadas, realice el aislamiento de linfocitos T CD4 positivos mediante selección negativa utilizando un kit comercial para linfocitos T CD4 positivos humanos.Agregue tampón de aislamiento y re-suspenda las células mononucleares. Transfiera las células a un nuevo tubo de cinco mililitros, luego agregue 100 microlitros de suero bovino fetal, o FBS, y 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos por tubo, e incube cada tubo a cuatro grados Celsius durante 20 minutos en un agitador orbital para mezclar bien. Después de la incubación, agregue tres a cuatro mililitros de tampón de aislamiento para lavar las células.Centrifugar las células a 300 veces g durante ocho minutos a cuatro grados Celsius para obtener el sedimento celular. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Transferir las perlas magnéticas a un tubo nuevo y agregar un volumen igual de tampón de aislamiento para lavar las perlas.Utilice una micropipeta de un mililitro para mezclar bien las perlas y luego coloque el tubo en el imán durante al menos un minuto. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y re-suspenda las perlas magnéticas en el mismo volumen que se transfirió inicialmente antes del lavado. Añada 500 microlitros del tampón de aislamiento a cada tubo y re-suspenda las células, luego añada 500 microlitros de perlas magnéticas previamente lavadas.Incube las células con las microesferas magnéticas durante 15 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente para mezclar adecuadamente. Tras la incubación, utilice una micropipeta de un mililitro para pipetear completamente las células al menos 10 veces, luego agregue tres a cuatro mililitros de tampón de aislamiento y coloque cada tubo en el imán durante dos minutos. Transfiera cuidadosamente las células T CD4 positivas seleccionadas negativamente que se encuentran en el sobrenadante a un tubo nuevo.Una vez completada la aislación de linfocitos T positivos para CD4, mantenga las células en hielo y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. Lave las placas recubiertas con anticuerpo dos veces con PBS, luego agregue 1,5 mililitros de la mezcla al doble de medio polarizante para Th17 en cada pocillo. A continuación, centrifugue los linfocitos T humanos positivos para CD4 para formar el sedimento celular.Aspire cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo, luego re-suspenda las células en medio básico libre de suero y siembre las células de modo que el volumen final sea de tres mililitros por pocillo y que las citocinas polarizantes tengan ahora una concentración final de 1 X; a continuación, coloque las placas en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante dos días. En el día dos, recubra placas de cultivo celular de 48 pocillos con 250 microlitros por pocillo de anticuerpo anti-CD3 humano y anti-CD28 humano en PBS con calcio y magnesio durante al menos dos horas a 37 grados Celsius. Para preparar los ARN pequeños para la transfección, retire una alícuota de un microlitro de una solución stock de cinco micromolar de ARNip en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros por cada transfección.Mantenga todos los tubos en hielo. A continuación, lave las placas recubiertas con anticuerpo dos veces con PBS, luego agregue 500 microlitros de medio polarizante Th17 1X a cada pocillo. Después de preparar las placas de cultivo y los reactivo de transfección, vuelva a suspender las células con una micropipeta de un mililitro, pipeteando suavemente pero asegurándose de que todas las células se hayan desprendido del fondo de los pocillos.Reúna las células en un tubo cónico y centrifugue los tubos a 500 veces g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y luego re-suspenda las células en al menos un mililitro de PBS para lavar. Cuente las células Th17 viables con un hemocitómetro, utilizando la exclusión con azul de tripano para evaluar la viabilidad, y luego haga un pellet de las células en un tubo de microcentrífuga.Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células utilizando el tampón de resuspensión proporcionado en el kit. Mantenga las células a temperatura ambiente. Añada nueve microlitros de células a un microlitro de ARN pequeño en cada tubo de microcentrifugación.Pipetee una vez para mezclar las células y los ARN pequeños para la transfección, luego cargue las células en la punta de pipeta electrodo proporcionada. Para garantizar una transfección óptima, evite introducir burbujas de aire en la punta de pipeta electrodo antes de la transfección. Añadimos 9,5 microlitros de suspensión celular para asegurar que haya suficiente mezcla y evitar la formación de burbujas en la pipeta de electroforesis.Llene el cubilete suministrado con tres mililitros de tampón electrolítico a temperatura ambiente. Coloque el cubilete dentro de la estación de pipetas neon y luego coloque la pipeta en posición dentro del cubilete. Electroporte inmediatamente cada mezcla de 10 microlitros de células y ARN pequeño.Una vez finalizada la electroforesis, agregue directamente la mezcla celular a 500 microlitros de medio de polarización Th17 1X en los pozos preparados de una placa de cultivo. Finalmente, coloque las placas en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante dos días más. Trabaje con cuidado pero con rapidez para prevenir la muerte celular.Si hay muchas muestras para electrotransferir, las células se pueden recolectar y transfectar por lotes. Este gráfico de contorno muestra que los linfocitos T cultivados bajo condiciones de polarización Th17 expresaron el receptor de quimioquinas CCR6 y el factor de transcripción ROR gamma T, los cuales no se expresaron cuando los linfocitos T se cultivaron bajo condiciones no polarizantes. Los linfocitos T cultivados bajo condiciones de polarización Th17 también produjeron IL-17A tras la re-estimulación, pero no bajo condiciones ThN.La diferenciación de Th17 aún ocurre tras la transfección con ARN pequeños, pero en algunos experimentos se observa una reducción en la frecuencia de producción de IL-17A. Esto demuestra la importancia de utilizar un control de ARN pequeño con química coincidente para la comparación dentro de cada experimento. La viabilidad se mantiene tras la transfección con ARN pequeños y normalmente es superior al 70 %. La transfección de células Th17 humanas el día dos con un grupo de siRNA dirigido al gen PTPRC, que codifica CD45, redujo fuertemente la expresión de CD45 en comparación con un siRNA de control con química coincidente.El desplazamiento poblacional unimodal en la expresión de CD45, observado aquí, indica una eficiencia de transfección cercana al 100 %. La reducción de la expresión de ROR gamma T mediante ARNip tuvo un efecto funcional, ya que estas células mostraron una producción disminuida de IL-17A en comparación con las células transfectadas con un ARNip de control. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar células Th17 humanas polarizadas in vitro con ARN pequeños utilizando la electroporación de próxima generación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este procedimiento se describe cómo establecer cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina y es seguida por la transfección utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXCell.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

Presentamos nuestra optimizado de alto rendimiento protocolo nucleofection como una forma eficiente de la transfección de primaria monocitos humanos derivados de células dendríticas, ya sea con el ADN de plásmido o siRNA sin causar la maduración celular. Nos proporcionan evidencia adicional para silenciar siRNA éxito de gen diana RIG-I tanto en el mRNA y los niveles de proteína.

Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

Este protocolo presenta un método eficiente y fiable para transfectar humanos THP-1 macrófagos con siRNA o ADN plásmido por electroporación con una alta eficiencia de transfección mientras se mantiene alta la vitalidad celular y la capacidad de los macrófagos completo para la diferenciación y polarización.

La transfección altamente eficiente de humanos THP-1 macrófagos por Nucleofection

Utilizando un Cas9 Confecciones complejo de ribonucleoproteína (RNP) es un método eficaz para la edición del genoma exacto, eficiente. Aquí, podemos destacar su utilidad en una amplia gama de células y organismos, incluyendo las células humanas primarias y ambos clásicos y emergentes en organismos modelo.

Mayor genoma edición con Cas9 ribonucleoproteína en diversas células y organismos

Hemos desarrollado un protocolo para transfectar células epiteliales pigmentarias humanas primarias por electroporación con el gen que codifica el factor derivado del epitelio pigmentario (PEDF) utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente (SB). La transfección exitosa se demostró mediante reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa (qPCR), inmunotransferencia y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA).

Modificación genética basada en electroporación de células epiteliales pigmentarias humanas primarias utilizando el sistema de transposones de la Bella Durmiente

Presentamos un método para el cultivo y edición génica de células B primarias de macaco rhesus utilizando CRISPR/Cas9 y virus adenoasociados recombinantes serotipo 6 para el estudio de terapias de células B.

Edición génica de células B primarias de macaco Rhesus

Presentamos un protocolo para la transducción retroviral de ARN guía en células T primarias de ratones transgénicos Cas9, proporcionando una alternativa eficiente para la edición de genes en el estudio de la diferenciación Th17.

Segmentación génica retroviral mediada por CRISPR/Cas9 para el estudio de la diferenciación de Th17 in vitro

Este protocolo proporciona un flujo de trabajo optimizado para generar y probar células T reguladoras del receptor de antígeno quimérico humano (CAR Tregs).

Generación de linfocitos T reguladores del receptor de antígeno quimérico humano

Se proporciona un protocolo detallado para el uso de la tecnología CRISPR/Cas9 para lograr un knock-in dirigido altamente eficiente de grandes construcciones multicistrónicas en células T humanas primarias a través de la vía de reparación del ADN de unión de extremos mediada por homología (HMEJ). Las células T diseñadas con este protocolo adaptable a las buenas prácticas de fabricación actuales mantienen una excelente expansión celular, citotoxicidad y producción de citocinas.

Ingeniería no viral de células T humanas primarias mediante la integración dirigida de grandes plantillas de ADN mediada por homología

La entrega de editores genómicos como ARN es un medio particularmente potente para modificar los genomas de las células y líneas celulares primarias de mamíferos. El objetivo de este protocolo es entregar editores genómicos como ARNm a células y líneas celulares primarias de mamíferos, seguido de secuenciación y análisis dirigidos de Illumina para cuantificar los resultados de edición.

Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

Aprende a transfectar células Th17 humanas con ARN pequeño mediante electroporación de última generación. Este método eficiente permite estudiar la diferenciación y función inmune de linfocitos T primarios.

Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

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