Small RNA Transfección en células primarias Th17 humano por Next Generation electroporación

El objetivo general de este procedimiento es transfectar de manera eficiente linfocitos T humanos primarios con reactivos de ARN pequeño utilizando electroforesis de próxima generación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la biología de los linfocitos T, como la forma en que productos génicos específicos regulan la diferenciación y la función inmunitaria de los linfocitos T. La principal ventaja de esta técnica es que constituye un método altamente eficiente y confiable para transfectar linfocitos T humanos primarios con ARNp y otros reactivos sintéticos de ARN pequeño.

Este método puede proporcionar información sobre la biología de las células Th17 humanas, pero también puede aplicarse a otros sistemas, como otros linfocitos de humanos o ratones. En el día cero, recubra placas de cultivo celular de seis pocillos con 1,5 mililitros por pocillo de anticuerpo antihumano CD3 y anticuerpo antihumano CD28 en PBS con calcio y magnesio durante al menos dos horas a 37 grados Celsius. Una vez que las células mononucleares de sangre de cordón, o CBMCs, hayan sido aisladas y lavadas, realice el aislamiento de linfocitos T CD4 positivos mediante selección negativa utilizando un kit comercial para linfocitos T CD4 positivos humanos.

Agregue tampón de aislamiento y re-suspenda las células mononucleares. Transfiera las células a un nuevo tubo de cinco mililitros, luego agregue 100 microlitros de suero bovino fetal, o FBS, y 100 microlitros de la mezcla de anticuerpos por tubo, e incube cada tubo a cuatro grados Celsius durante 20 minutos en un agitador orbital para mezclar bien. Después de la incubación, agregue tres a cuatro mililitros de tampón de aislamiento para lavar las células.

Centrifugar las células a 300 veces g durante ocho minutos a cuatro grados Celsius para obtener el sedimento celular. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Transferir las perlas magnéticas a un tubo nuevo y agregar un volumen igual de tampón de aislamiento para lavar las perlas.

Utilice una micropipeta de un mililitro para mezclar bien las perlas y luego coloque el tubo en el imán durante al menos un minuto. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y re-suspenda las perlas magnéticas en el mismo volumen que se transfirió inicialmente antes del lavado. Añada 500 microlitros del tampón de aislamiento a cada tubo y re-suspenda las células, luego añada 500 microlitros de perlas magnéticas previamente lavadas.

Incube las células con las microesferas magnéticas durante 15 minutos en un agitador orbital a temperatura ambiente para mezclar adecuadamente. Tras la incubación, utilice una micropipeta de un mililitro para pipetear completamente las células al menos 10 veces, luego agregue tres a cuatro mililitros de tampón de aislamiento y coloque cada tubo en el imán durante dos minutos. Transfiera cuidadosamente las células T CD4 positivas seleccionadas negativamente que se encuentran en el sobrenadante a un tubo nuevo.

Una vez completada la aislación de linfocitos T positivos para CD4, mantenga las células en hielo y cuéntelas utilizando un hemocitómetro. Lave las placas recubiertas con anticuerpo dos veces con PBS, luego agregue 1,5 mililitros de la mezcla al doble de medio polarizante para Th17 en cada pocillo. A continuación, centrifugue los linfocitos T humanos positivos para CD4 para formar el sedimento celular.

Aspire cuidadosamente el sobrenadante y deséchelo, luego re-suspenda las células en medio básico libre de suero y siembre las células de modo que el volumen final sea de tres mililitros por pocillo y que las citocinas polarizantes tengan ahora una concentración final de 1 X; a continuación, coloque las placas en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante dos días. En el día dos, recubra placas de cultivo celular de 48 pocillos con 250 microlitros por pocillo de anticuerpo anti-CD3 humano y anti-CD28 humano en PBS con calcio y magnesio durante al menos dos horas a 37 grados Celsius. Para preparar los ARN pequeños para la transfección, retire una alícuota de un microlitro de una solución stock de cinco micromolar de ARNip en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros por cada transfección.

Mantenga todos los tubos en hielo. A continuación, lave las placas recubiertas con anticuerpo dos veces con PBS, luego agregue 500 microlitros de medio polarizante Th17 1X a cada pocillo. Después de preparar las placas de cultivo y los reactivo de transfección, vuelva a suspender las células con una micropipeta de un mililitro, pipeteando suavemente pero asegurándose de que todas las células se hayan desprendido del fondo de los pocillos.

Reúna las células en un tubo cónico y centrifugue los tubos a 500 veces g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y luego re-suspenda las células en al menos un mililitro de PBS para lavar. Cuente las células Th17 viables con un hemocitómetro, utilizando la exclusión con azul de tripano para evaluar la viabilidad, y luego haga un pellet de las células en un tubo de microcentrífuga.

Aspire cuidadosamente el sobrenadante y resuspenda las células utilizando el tampón de resuspensión proporcionado en el kit. Mantenga las células a temperatura ambiente. Añada nueve microlitros de células a un microlitro de ARN pequeño en cada tubo de microcentrifugación.

Pipetee una vez para mezclar las células y los ARN pequeños para la transfección, luego cargue las células en la punta de pipeta electrodo proporcionada. Para garantizar una transfección óptima, evite introducir burbujas de aire en la punta de pipeta electrodo antes de la transfección. Añadimos 9,5 microlitros de suspensión celular para asegurar que haya suficiente mezcla y evitar la formación de burbujas en la pipeta de electroforesis.

Llene el cubilete suministrado con tres mililitros de tampón electrolítico a temperatura ambiente. Coloque el cubilete dentro de la estación de pipetas neon y luego coloque la pipeta en posición dentro del cubilete. Electroporte inmediatamente cada mezcla de 10 microlitros de células y ARN pequeño.

Una vez finalizada la electroforesis, agregue directamente la mezcla celular a 500 microlitros de medio de polarización Th17 1X en los pozos preparados de una placa de cultivo. Finalmente, coloque las placas en un incubador con 5 % de dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante dos días más. Trabaje con cuidado pero con rapidez para prevenir la muerte celular.

Si hay muchas muestras para electrotransferir, las células se pueden recolectar y transfectar por lotes. Este gráfico de contorno muestra que los linfocitos T cultivados bajo condiciones de polarización Th17 expresaron el receptor de quimioquinas CCR6 y el factor de transcripción ROR gamma T, los cuales no se expresaron cuando los linfocitos T se cultivaron bajo condiciones no polarizantes. Los linfocitos T cultivados bajo condiciones de polarización Th17 también produjeron IL-17A tras la re-estimulación, pero no bajo condiciones ThN.

La diferenciación de Th17 aún ocurre tras la transfección con ARN pequeños, pero en algunos experimentos se observa una reducción en la frecuencia de producción de IL-17A. Esto demuestra la importancia de utilizar un control de ARN pequeño con química coincidente para la comparación dentro de cada experimento. La viabilidad se mantiene tras la transfección con ARN pequeños y normalmente es superior al 70 %. La transfección de células Th17 humanas el día dos con un grupo de siRNA dirigido al gen PTPRC, que codifica CD45, redujo fuertemente la expresión de CD45 en comparación con un siRNA de control con química coincidente.

El desplazamiento poblacional unimodal en la expresión de CD45, observado aquí, indica una eficiencia de transfección cercana al 100 %. La reducción de la expresión de ROR gamma T mediante ARNip tuvo un efecto funcional, ya que estas células mostraron una producción disminuida de IL-17A en comparación con las células transfectadas con un ARNip de control. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo transfectar células Th17 humanas polarizadas in vitro con ARN pequeños utilizando la electroporación de próxima generación.