Name: Un In Vitro Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprende a predecir la unión de fármacos al caseum de lesiones tuberculosas mediante diálisis de equilibrio rápido. Este método evalúa la penetración antimicrobiana sin modelos animales costosos.

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Deseamos agradecer a Johnson &amp; Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X y Trius Therapeutics por proporcionar bedaquiline, PA-824 (pretomanida), AZD5847, radezolid y tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li y Danielle Weiner apoyaron el análisis MALDI, los métodos bioanalíticos, la preparación del sustituto del caseo, la síntesis química y el aislamiento del caseo de conejo. Este trabajo se llevó a cabo con fondos de la Fundación Bill y Melinda Gates, el premio # OPP1044966 y OPP1024050 a V. Dartois, la Subvención de Instrumentación Compartida NIH S10OD018072, así como el financiamiento conjunto de la Fundación Bill y Melinda Gates y Wellcome Trust for A Centre of Excellence Para la optimización del plomo para las enfermedades del mundo en vías de desarrollo a P. Wyatt.

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, con la aprobación del Comité Institucional Animal Cuidado y Uso del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Se realizaron todos los estudios con M. tuberculosis en un laboratorio con nivel de bioseguridad de contención 3 (BSL-3). 1. Conejo Modelo de infección y caseosa Colección <ol><li> Infect Nueva Zelanda conejos blancos con M. tuberculosis usando un sistema de exposición a aerosol sólo para la nariz como se describió anteriormente. 12, 13 permitir que la infección progrese durante 12-16 semanas. Sedate los conejos con 35 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por vía intramuscular, la eutanasia a los conejos con 0,22 ml / kg de pentobarbital de sodio de sodio y fenitoína por vía intravenosa y proceder con la necropsias. </li><li> El uso de pinzas y bisturí, retire los pulmones de la ca pechoVidad De cada lóbulo pulmonar, diseccionar cavidades individuales y grandes granulomas necróticos con un bisturí. Raspe con cuidado el caseum de las paredes de la cavidad y del granuloma. Pesar, registrar y almacenar las muestras en tubos tapados con tornillos de 2 mL a -20 ° C hasta que estén listos para su uso. </li><li> Irradiar gamma las muestras de caseo infeccioso a 3 MegaRad en hielo seco para hacerlas no infecciosas y seguras para su uso en un laboratorio BSL-2. </li></ol> 2. Generación in vitro de sustituto de caseo a partir de células THP-1 <ol><li> Cultivo de monocitos THP-1 en medio RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM y suero fetal bovino al 10%) en matraces de cultivo celular T175 (80 ml / matraz). Incubar los matraces en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ° C durante 3-4 días. </li><li> Centrifugar el cultivo de un matraz T175 en dos tubos cónicos de 50 ml a 150 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y suspender el sedimento en 10 ml de medio RPMI 1640. </li><li> Pipetear 5 μL de este cultivo en un tubo de 1,5 ml que contenga 45 μl de tRypan azul Mezcle bien pipeteando. Transferir 10 μL a un hemocitómetro y contar el número de monocitos THP-1 viables (sin tinción) utilizando un microscopio óptico (aumento de 10X). Calcular el número de células viables por ml del cultivo. Diluir con medio RPMI hasta la densidad final de 1,25 x 106 células / ml. </li><li> Cargar 40 mL del cultivo en una placa de cultivo celular grande (50 x 106 células / placa). Añadir 40 μL de 100 μM de PMA (forbol 12-miristato13-acetato preparado en etanol) y permitir que las células se adhieran durante la noche en la incubadora. NOTA: La concentración final de PMA es 100 nM. </li><li> Diluir ácido oleico puro (OA) (0,89 g / ml) en etanol hasta la concentración de 0,1 M ( es decir, 31,7 μl de OA en 968,3 μl de etanol). Diluir esta solución en medio RMPI precalentado fresco a una concentración de 10 mM. Diluir esta suspensión de OA a 0,4 mM (concentración final de trabajo) en medio RPMI precalentado a 37ºC. </li><li> Eliminar los medios existentes y losDe las placas de cultivo celular y añadir suavemente 40 ml de OA 0,4 mM a los macrófagos THP-1 (THP-M). Incubar a 37 ° C en la incubadora durante la noche. </li><li> Utilice un microscopio óptico con una ampliación de 40x para confirmar visualmente la presencia de numerosas inclusiones de cuerpo lipídico en cada THP-M. Eliminar todo el medio RPMI de las placas de cultivo celular y lavar suavemente las células adherentes dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una pipeta serológica de 50 ml. NOTA: Los cuerpos lipídicos aparecen como estructuras pequeñas, claras y esféricas en el citoplasma del THP-M. </li><li> Añadir 40 mL de ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA) en PBS a cada placa. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C. </li><li> Desmonte los macrófagos espumosos (FM) pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo sobre la superficie de la placa entera usando una pipeta serológica de 10 ml. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 150 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 10 ml de PBS (tercer lavado con PBS) aNd a un tubo cónico de 15 mL previamente pesado. Girar de nuevo a 150 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica y desecharla. </li><li> Sujeción de los gránulos de FM a 3 ciclos de congelación-descongelación para lisar las células e incubar a 75 ° C durante 20-30 min para desnaturalizar las proteínas en la matriz. Guarde los gránulos a -20 ° C hasta que estén listos para su uso. </li></ol> 3. Ensayo de Diálisis de Equilibrio Rápido (RED) <ol><li> Preparar soluciones madre 10 mM de todos los compuestos de ensayo en dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a 500 μM de soluciones de trabajo en DMSO antes de cada ensayo. </li><li> Pesar el tubo que contiene la pastilla de caseo sustituto. Reste el peso del tubo vacío para obtener el peso del gránulo solo. Añadir 2-3 perlas de metal por tubo y, utilizando un homogeneizador de tejidos a 1200 golpes / minuto durante 1 minuto, romper el caseo o la matriz sustituta en PBS (1: 9 w / v) para conseguir 10x de suspensión diluida de cada matriz. </li><li> Spike 6.5 μL de los 500ΜM del compuesto de ensayo en 643,5 μl del homogeneizado para alcanzar la concentración final de 5 μM (≤1% de DMSO) y vórtice. </li><li> Coloque los insertos ROJOS en la placa base. Añadir 200 μl de la matriz de droga en la cámara del donante (anillo rojo) de cada inserto ROJO y 350 μl de PBS en cada cámara receptora. Prepare 3 insertos para cada compuesto de ensayo (muestras triplicadas). Sellar la placa con un sello de placa adhesiva e incubar a 37 ° C en el termomixer a 200 rpm (1 xg) durante 4 h. </li><li> Después de la incubación, mezcle suavemente el contenido de las cámaras del donante y del receptor pipeteando arriba y abajo 2-3 veces. Pipetear 20 μL de alícuotas de homogeneizado de las cámaras donadoras y añadir 20 μL de PBS limpio en un tubo de 1,5 ml (1: 1). De forma similar, se pipetean alícuotas de 20 μl de muestras de PBS de las cámaras receptoras y se añaden a 20 μl de homogeneizado limpio (combinación de matriz). 8 NOTA: La concordancia de matriz elimina la need para 2 curvas de calibración separadas (en homogeneizado y PBS) que se hizo para el análisis cuantitativo. El contenido de la cámara donante pueden sedimentar con el tiempo. Mezclar suavemente el contenido pipeteando antes de retirar alícuotas. </li></ol> 4. CL-EM Cuantificación y Análisis de Datos <ol><li> Añadir 160! L de 1: 1 de metanol: acetonitrilo que contiene 500 ng / ml de diclofenaco o 10 ng / ml de verapamil (patrón interno) a cada tubo y vórtice para precipitar las proteínas. Centrifugar a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar el precipitado sobrenadantes y transferencia en placas de 96 pocillos de pocillos profundos para el análisis de líquido espectrometría de masas-cromatografía (LCMS). 7 </li><li> Construir curvas de calibración de 1-1.000 nM para cada compuesto de ensayo mientras se mantiene la misma composición de la matriz que las muestras anteriormente. Cuantificar la concentración de compuesto de ensayo en las muestras de las cámaras donante y receptora utilizando un método LC-MS. </li><li> Calcular la fracción no unida (f u) oF el fármaco en matriz diluida utilizando la ecuación 1. Calcular el f u en matriz sin diluir usando la ecuación 2 ( D = factor de dilución de 10). 14 <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Compruebe la recuperación (balance de masa) de cada compuesto usando la ecuación 3 para identificar compuestos con estabilidad / metabolismo / problemas de unión no específicos. NOTA: La recuperación típicamente cae entre 70% y 130%. 15 <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

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<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
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No hay intereses financieros en competencia.

lesiones necróticas pulmonares y cavidades en los pacientes de tuberculosis infectados contienen subpoblaciones de bacterias que son recalcitrantes al tratamiento farmacológico. Los núcleos caseosos de estas estructuras son particularmente responsable de albergar estos persisters en un entorno extracelular. 16 distribución favorable de agentes antibacterianos en estos lugares remotos se cree que es un determinante importante de la eficacia del fármaco tuberculosis. Antes de la validación de este ...

El tratamiento de la tuberculosis pulmonar requiere una distribución eficaz de fármacos en diferentes tipos de lesiones. Las lesiones necróticas y las cavidades contienen centros caseosos que albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a los fármacos o &quot;persistentes&quot;. 1 , 2 La enfermedad cavitaria se asocia con tasas de curación inferiores y mal pronóstico. 3 , 4 Estudios previos han demostrado, usando técnicas cuantitativas y de imágenes, que la capacidad de penetrar el caseo varía significativamente de una clase de fármaco a otra. 5 , 6 Estos métodos, sin embargo, requieren el uso de modelos de infección animal que son lentos y tediosos. Se diseñó un ensayo in vitro que mide la unión del fármaco al caseo ex vivo . Se encontró que esta unión se correlacionaba inversamente con la penetración del fármaco en granulomas caseosos y, por lo tanto, esUtilizado como herramienta predictiva. 7 La diálisis de equilibrio se considera como el método estándar de oro para los estudios de unión a proteínas plasmáticas. El dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) proporciona un sistema rápido, fácil de usar y fiable para realizar tales ensayos. 8 El dispositivo se compone de dos componentes: insertos de un solo uso y desechables compuestos de 2 cámaras separadas por un cilindro vertical de membrana semipermeable; Y placas de base reutilizables que pueden contener hasta 48 insertos a la vez. La membrana de diálisis tiene un corte de peso molecular de 8 kDa (MWCO) que es ideal para estudios de unión de fármacos-macromoléculas. La alta relación superficie / volumen del compartimento de membrana permite una diálisis rápida y equilibrio. Tanto los insertos como la placa de base han sido validados para una unión no específica específica. La combinación del dispositivo RED con técnicas bioanalíticas proporciona estimaciones precisas de las fracciones no unidas de fármacos en pLasma 8 , 9 Aunque originalmente se diseñó para medir la unión a proteínas plasmáticas, el dispositivo RED se ha utilizado en varios estudios de unión de tejidos utilizando homogenados. 10 , 11 En este protocolo, medimos la unión del fármaco al caseo, los residuos necróticos escindidos de las lesiones necróticas y cavidades de los conejos infectados con tuberculosis. La naturaleza acelular y no vascular del material caseoso hace que sea fácil de homogeneizar en una suspensión homogénea que sea compatible con el ensayo. Dado que el caseum es tedioso para producir y difícil de conseguir, el protocolo también ha sido validado para su uso con una matriz sustituta que se prepara a partir de macrófagos espumosos. Los macrófagos derivados de monocitos THP-1 son inducidos con ácido oleico para acumular múltiples cuerpos lipídicos que les dan su aspecto &quot;espumoso&quot;. Estas células cargadas de lípidos se cosechan yprocesada para producir una matriz que usamos como un sustituto para caseosa. Este estudio ha demostrado la unión a esta matriz sustituta se correlaciona bien con la unión a caseosa, imitando eficazmente el proceso in vivo que impide la penetración del fármaco en el núcleo caseosa de granulomas y cavidades que de drogas.

<table><tbody><tr><td>Conejos blancos de Nueva Zelanda</td> Covance-HN878 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesis (Ketamina) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (xilacina) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sódico y fenitoína sódica) Solución&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>línea celular monocítica THP-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; Matraz tratado con TC (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios sin glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Suero bovino fetal, irradiado con rayos gamma&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hypclona L-glutamina, 200 mM</td><td>Plato Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC, 145 mm x 20 mm, ventilado</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Dispositivo Placa base reutilizable</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Insertos de dispositivo, 50/caja&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED herramienta de extracción de plaquitas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Sello de placa adhesiva</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma 472301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de verapamilo</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de diclofenaco</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 pruebas</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr> Molino <tr><td>de bolas Homogeneizador Accesorio, perlas de metal a granel</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalto 60 Irradiador</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; Hemacitómetros desechables C-Chip</td> Microscopio óptico vertical <td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografía líquida binaria</td><td></td><td></td>Leica DM1000 <td></td> Espectrómetro de masas multicomponente Agilent 1260</tr><tr><td></td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; caseosa ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

La erradicación de la enfermedad de la tuberculosis requiere regímenes farmacológicos que pueden penetrar las múltiples capas de lesiones pulmonares complejas. La distribución de fármacos en los núcleos caseosos de cavidades y lesiones es especialmente crucial porque albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a fármacos también comúnmente denominadas persisters. Los métodos existentes para la medición de la penetración del fármaco en lesiones de tuberculosis implican costosos y largos estudios farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas o de formación de imágenes. La medida in vitro de la unión de fármacos a macromoléculas de caseo se propuso como una alternativa a tales técnicas ya que esta unión dificulta la difusión pasiva de moléculas de fármaco a través de caseo. La diálisis de equilibrio rápido es un sistema rápido y fiable para realizar estudios de unión a proteínas plasmáticas y tejidos. En este protocolo, se utilizó un dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a homogenados de caseo que es excised de las lesiones y de las cavidades de los conejos de tuberculosis infectados. El protocolo también se describe cómo generar una matriz sustituta de lípido cargado macrófagos THP-1 para utilizar en lugar de caseosa. Este / ensayo de unión sustituto caseosa es una herramienta importante en el descubrimiento de fármacos tuberculosis y se puede adaptar para ayudar a estudiar la distribución del fármaco en las lesiones o abscesos causados ​​por otras enfermedades.

Usando este protocolo, hemos probado cientos de compuestos de desarrollo de fármacos para la tuberculosis para su eficacia pronosticada en el caso de penetración. La figura 1 visualiza los conceptos básicos del ensayo RED. La membrana de diálisis de los insertos ROJO permite que pequeñas moléculas no unidas se difundan desde el pozo del donante hasta el pozo receptor, logrando finalmente un equilibrio entre ambos compartimentos. Las moléculas pequeñas que están unidas a ...

En este artículo se describe un método de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a caseum de lesiones y cavidades de tuberculosis pulmonar. El protocolo también se utiliza con una matriz espumosa derivada de macrófagos que es un sustituto efectivo del caseo.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

El objetivo general de este protocolo es predecir la unión de fármacos al caseum proveniente de lesiones tuberculosas. Este método puede ayudar a determinar con qué eficacia penetran los antimicrobianos en el núcleo caseoso de lesiones necróticas, sin necesidad de utilizar modelos animales ni técnicas de imagen costosas. Aunque este método puede aportar información útil para el descubrimiento directo de fármacos contra la tuberculosis, también puede aplicarse a otras enfermedades caracterizadas por la formación de lesiones o abscesos en los que la penetración de fármacos es limitada.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la consistencia en la realización del protocolo garantizará la reproducibilidad de los datos entre experimentos. Hoy, demostraré el procedimiento de cultivo celular y la preparación de la matriz sustituta. Hsin-pin, un asociado de investigación de nuestro laboratorio, demostrará el ensayo correcto.Cultive monocitos THP-1 en matraces para cultivo celular T-175 que contengan 80 mL de medio RPMI 1640, con 2 milimolares de L-glutamina y 10 por ciento de suero bovino fetal. Incube los matraces a 37 grados Celsius con cinco por ciento de dióxido de

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Sarathy, J. P. et al. Un ensayo de unión a caseum in vitro que predice la penetración del fármaco en las lesiones tuberculosas. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un ensayo in vitro para medir la unión del fármaco al caseum de las lesiones tuberculosas mediante diálisis de equilibrio rápido. Describe los pasos para preparar suspensiones de caseum, realizar diálisis y calcular la fracción de fármaco no unido para predecir la penetración del fármaco en caseum.

Medición de la unión de fármacos al caseum de lesiones tuberculosas mediante el método de diálisis de equilibrio rápido

Este video muestra un ensayo para evaluar la eficacia de medicamentos contra la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se genera un modelo de infección in vitro que contiene agregados de Mtb/macrófagos que imita la infección in vivo. Tras la introducción de antibióticos adecuados, su eficacia se prueba mediante un ensayo de resuzarina para controlar la supervivencia de las bacterias con concentraciones crecientes del fármaco.

Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

Este video muestra un ensayo en caldo para determinar la eficacia antibiótica contra Mycobacterium tuberculosis. El cultivo bacteriano se incuba con diferentes concentraciones de un antibiótico bactericida. La eficacia bactericida se mide evaluando la presencia de bacterias viables mediante un ensayo de resazurina.

Evaluación de la eficacia de un compuesto de ensayo contra micobacterias en caldo

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

El charcoal a gar resazurin assay (CARA) es un método semicuantitativo de rendimiento medio para evaluar la actividad de los agentes de prueba contra micobacterias que se replican, no replican o ambas.  El CARA permite una evaluación rápida de la actividad dependiente del tiempo y la concentración e identifica los parámetros a seguir mediante ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC).

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

La determinación de las unidades formadoras de colonias (UFC) es la técnica de referencia para cuantificar las bacterias, incluida la Mycobacterium tuberculosis , que puede tardar semanas en formar colonias visibles. Aquí describimos una micro-UFC para la determinación de UFC con mayor eficiencia de tiempo, menor espacio de laboratorio y costo de reactivos, y escalabilidad a experimentos de rendimiento medio y alto.

Ensayo de la unidad formadora de microcolonias para la evaluación de la eficacia de las vacunas contra la tuberculosis

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Aprende a predecir la unión de fármacos al caseum de lesiones tuberculosas mediante diálisis de equilibrio rápido. Este método evalúa la penetración antimicrobiana sin modelos animales costosos.

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