Name: Un In Vitro Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Aprende a predecir la unión de fármacos al caseum de lesiones tuberculosas mediante diálisis de equilibrio rápido. Este método evalúa la penetración antimicrobiana sin modelos animales costosos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deseamos agradecer a Johnson &amp; Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X y Trius Therapeutics por proporcionar bedaquiline, PA-824 (pretomanida), AZD5847, radezolid y tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li y Danielle Weiner apoyaron el análisis MALDI, los métodos bioanalíticos, la preparación del sustituto del caseo, la síntesis química y el aislamiento del caseo de conejo. Este trabajo se llevó a cabo con fondos de la Fundación Bill y Melinda Gates, el premio # OPP1044966 y OPP1024050 a V. Dartois, la Subvención de Instrumentación Compartida NIH S10OD018072, así como el financiamiento conjunto de la Fundación Bill y Melinda Gates y Wellcome Trust for A Centre of Excellence Para la optimización del plomo para las enfermedades del mundo en vías de desarrollo a P. Wyatt.

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, con la aprobación del Comité Institucional Animal Cuidado y Uso del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Se realizaron todos los estudios con M. tuberculosis en un laboratorio con nivel de bioseguridad de contención 3 (BSL-3). 1. Conejo Modelo de infección y caseosa Colección <ol><li> Infect Nueva Zelanda conejos blancos con M. tuberculosis usando un sistema de exposición a aerosol sólo para la nariz como se describió anteriormente. 12, 13 permitir que la infección progrese durante 12-16 semanas. Sedate los conejos con 35 mg / kg de ketamina y 5 mg / kg de xilazina por vía intramuscular, la eutanasia a los conejos con 0,22 ml / kg de pentobarbital de sodio de sodio y fenitoína por vía intravenosa y proceder con la necropsias. </li><li> El uso de pinzas y bisturí, retire los pulmones de la ca pechoVidad De cada lóbulo pulmonar, diseccionar cavidades individuales y grandes granulomas necróticos con un bisturí. Raspe con cuidado el caseum de las paredes de la cavidad y del granuloma. Pesar, registrar y almacenar las muestras en tubos tapados con tornillos de 2 mL a -20 ° C hasta que estén listos para su uso. </li><li> Irradiar gamma las muestras de caseo infeccioso a 3 MegaRad en hielo seco para hacerlas no infecciosas y seguras para su uso en un laboratorio BSL-2. </li></ol> 2. Generación in vitro de sustituto de caseo a partir de células THP-1 <ol><li> Cultivo de monocitos THP-1 en medio RPMI 1640 (L-glutamina 2 mM y suero fetal bovino al 10%) en matraces de cultivo celular T175 (80 ml / matraz). Incubar los matraces en una atmósfera de CO2 al 5% a 37 ° C durante 3-4 días. </li><li> Centrifugar el cultivo de un matraz T175 en dos tubos cónicos de 50 ml a 150 xg durante 5 min. Desechar el sobrenadante y suspender el sedimento en 10 ml de medio RPMI 1640. </li><li> Pipetear 5 μL de este cultivo en un tubo de 1,5 ml que contenga 45 μl de tRypan azul Mezcle bien pipeteando. Transferir 10 μL a un hemocitómetro y contar el número de monocitos THP-1 viables (sin tinción) utilizando un microscopio óptico (aumento de 10X). Calcular el número de células viables por ml del cultivo. Diluir con medio RPMI hasta la densidad final de 1,25 x 106 células / ml. </li><li> Cargar 40 mL del cultivo en una placa de cultivo celular grande (50 x 106 células / placa). Añadir 40 μL de 100 μM de PMA (forbol 12-miristato13-acetato preparado en etanol) y permitir que las células se adhieran durante la noche en la incubadora. NOTA: La concentración final de PMA es 100 nM. </li><li> Diluir ácido oleico puro (OA) (0,89 g / ml) en etanol hasta la concentración de 0,1 M ( es decir, 31,7 μl de OA en 968,3 μl de etanol). Diluir esta solución en medio RMPI precalentado fresco a una concentración de 10 mM. Diluir esta suspensión de OA a 0,4 mM (concentración final de trabajo) en medio RPMI precalentado a 37ºC. </li><li> Eliminar los medios existentes y losDe las placas de cultivo celular y añadir suavemente 40 ml de OA 0,4 mM a los macrófagos THP-1 (THP-M). Incubar a 37 ° C en la incubadora durante la noche. </li><li> Utilice un microscopio óptico con una ampliación de 40x para confirmar visualmente la presencia de numerosas inclusiones de cuerpo lipídico en cada THP-M. Eliminar todo el medio RPMI de las placas de cultivo celular y lavar suavemente las células adherentes dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una pipeta serológica de 50 ml. NOTA: Los cuerpos lipídicos aparecen como estructuras pequeñas, claras y esféricas en el citoplasma del THP-M. </li><li> Añadir 40 mL de ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA) en PBS a cada placa. Incubar durante 15 minutos a 37 ° C. </li><li> Desmonte los macrófagos espumosos (FM) pipeteando repetidamente hacia arriba y hacia abajo sobre la superficie de la placa entera usando una pipeta serológica de 10 ml. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 50 ml y centrifugar a 150 xg durante 5 min. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 10 ml de PBS (tercer lavado con PBS) aNd a un tubo cónico de 15 mL previamente pesado. Girar de nuevo a 150 xg durante 5 min. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta serológica y desecharla. </li><li> Sujeción de los gránulos de FM a 3 ciclos de congelación-descongelación para lisar las células e incubar a 75 ° C durante 20-30 min para desnaturalizar las proteínas en la matriz. Guarde los gránulos a -20 ° C hasta que estén listos para su uso. </li></ol> 3. Ensayo de Diálisis de Equilibrio Rápido (RED) <ol><li> Preparar soluciones madre 10 mM de todos los compuestos de ensayo en dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir a 500 μM de soluciones de trabajo en DMSO antes de cada ensayo. </li><li> Pesar el tubo que contiene la pastilla de caseo sustituto. Reste el peso del tubo vacío para obtener el peso del gránulo solo. Añadir 2-3 perlas de metal por tubo y, utilizando un homogeneizador de tejidos a 1200 golpes / minuto durante 1 minuto, romper el caseo o la matriz sustituta en PBS (1: 9 w / v) para conseguir 10x de suspensión diluida de cada matriz. </li><li> Spike 6.5 μL de los 500ΜM del compuesto de ensayo en 643,5 μl del homogeneizado para alcanzar la concentración final de 5 μM (≤1% de DMSO) y vórtice. </li><li> Coloque los insertos ROJOS en la placa base. Añadir 200 μl de la matriz de droga en la cámara del donante (anillo rojo) de cada inserto ROJO y 350 μl de PBS en cada cámara receptora. Prepare 3 insertos para cada compuesto de ensayo (muestras triplicadas). Sellar la placa con un sello de placa adhesiva e incubar a 37 ° C en el termomixer a 200 rpm (1 xg) durante 4 h. </li><li> Después de la incubación, mezcle suavemente el contenido de las cámaras del donante y del receptor pipeteando arriba y abajo 2-3 veces. Pipetear 20 μL de alícuotas de homogeneizado de las cámaras donadoras y añadir 20 μL de PBS limpio en un tubo de 1,5 ml (1: 1). De forma similar, se pipetean alícuotas de 20 μl de muestras de PBS de las cámaras receptoras y se añaden a 20 μl de homogeneizado limpio (combinación de matriz). 8 NOTA: La concordancia de matriz elimina la need para 2 curvas de calibración separadas (en homogeneizado y PBS) que se hizo para el análisis cuantitativo. El contenido de la cámara donante pueden sedimentar con el tiempo. Mezclar suavemente el contenido pipeteando antes de retirar alícuotas. </li></ol> 4. CL-EM Cuantificación y Análisis de Datos <ol><li> Añadir 160! L de 1: 1 de metanol: acetonitrilo que contiene 500 ng / ml de diclofenaco o 10 ng / ml de verapamil (patrón interno) a cada tubo y vórtice para precipitar las proteínas. Centrifugar a 10.000 xg durante 5 min para sedimentar el precipitado sobrenadantes y transferencia en placas de 96 pocillos de pocillos profundos para el análisis de líquido espectrometría de masas-cromatografía (LCMS). 7 </li><li> Construir curvas de calibración de 1-1.000 nM para cada compuesto de ensayo mientras se mantiene la misma composición de la matriz que las muestras anteriormente. Cuantificar la concentración de compuesto de ensayo en las muestras de las cámaras donante y receptora utilizando un método LC-MS. </li><li> Calcular la fracción no unida (f u) oF el fármaco en matriz diluida utilizando la ecuación 1. Calcular el f u en matriz sin diluir usando la ecuación 2 ( D = factor de dilución de 10). 14 <img alt="Ecuación 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="Ecuación 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li> Compruebe la recuperación (balance de masa) de cada compuesto usando la ecuación 3 para identificar compuestos con estabilidad / metabolismo / problemas de unión no específicos. NOTA: La recuperación típicamente cae entre 70% y 130%. 15 <img alt="Ecuación 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol><li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drugs+versus+bugs%3A+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li>
<li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li>
<li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+Int+Union+Tuberc%22%5BJournal%5D)">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li>
<li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li>
<li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+path+of+anti-tuberculosis+drugs%3A+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li>
<li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li>
<li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li>
<li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://jpharmsci.org/article/S0022-3549(16)32735-6/pdf">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li>
<li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+localization%2C+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li>
<li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits%3A+a+failed+host+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li>
<li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2423064/">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li>
<li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure%3A+implications+for+rational+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Drug+Dispos%22%5BJournal%5D)">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li>
<li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sci%22%5BJournal%5D)">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li>
<li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li>
<li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li>
</ol>

No hay intereses financieros en competencia.

lesiones necróticas pulmonares y cavidades en los pacientes de tuberculosis infectados contienen subpoblaciones de bacterias que son recalcitrantes al tratamiento farmacológico. Los núcleos caseosos de estas estructuras son particularmente responsable de albergar estos persisters en un entorno extracelular. 16 distribución favorable de agentes antibacterianos en estos lugares remotos se cree que es un determinante importante de la eficacia del fármaco tuberculosis. Antes de la validación de este ...

El tratamiento de la tuberculosis pulmonar requiere una distribución eficaz de fármacos en diferentes tipos de lesiones. Las lesiones necróticas y las cavidades contienen centros caseosos que albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a los fármacos o &quot;persistentes&quot;. 1 , 2 La enfermedad cavitaria se asocia con tasas de curación inferiores y mal pronóstico. 3 , 4 Estudios previos han demostrado, usando técnicas cuantitativas y de imágenes, que la capacidad de penetrar el caseo varía significativamente de una clase de fármaco a otra. 5 , 6 Estos métodos, sin embargo, requieren el uso de modelos de infección animal que son lentos y tediosos. Se diseñó un ensayo in vitro que mide la unión del fármaco al caseo ex vivo . Se encontró que esta unión se correlacionaba inversamente con la penetración del fármaco en granulomas caseosos y, por lo tanto, esUtilizado como herramienta predictiva. 7 La diálisis de equilibrio se considera como el método estándar de oro para los estudios de unión a proteínas plasmáticas. El dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) proporciona un sistema rápido, fácil de usar y fiable para realizar tales ensayos. 8 El dispositivo se compone de dos componentes: insertos de un solo uso y desechables compuestos de 2 cámaras separadas por un cilindro vertical de membrana semipermeable; Y placas de base reutilizables que pueden contener hasta 48 insertos a la vez. La membrana de diálisis tiene un corte de peso molecular de 8 kDa (MWCO) que es ideal para estudios de unión de fármacos-macromoléculas. La alta relación superficie / volumen del compartimento de membrana permite una diálisis rápida y equilibrio. Tanto los insertos como la placa de base han sido validados para una unión no específica específica. La combinación del dispositivo RED con técnicas bioanalíticas proporciona estimaciones precisas de las fracciones no unidas de fármacos en pLasma 8 , 9 Aunque originalmente se diseñó para medir la unión a proteínas plasmáticas, el dispositivo RED se ha utilizado en varios estudios de unión de tejidos utilizando homogenados. 10 , 11 En este protocolo, medimos la unión del fármaco al caseo, los residuos necróticos escindidos de las lesiones necróticas y cavidades de los conejos infectados con tuberculosis. La naturaleza acelular y no vascular del material caseoso hace que sea fácil de homogeneizar en una suspensión homogénea que sea compatible con el ensayo. Dado que el caseum es tedioso para producir y difícil de conseguir, el protocolo también ha sido validado para su uso con una matriz sustituta que se prepara a partir de macrófagos espumosos. Los macrófagos derivados de monocitos THP-1 son inducidos con ácido oleico para acumular múltiples cuerpos lipídicos que les dan su aspecto &quot;espumoso&quot;. Estas células cargadas de lípidos se cosechan yprocesada para producir una matriz que usamos como un sustituto para caseosa. Este estudio ha demostrado la unión a esta matriz sustituta se correlaciona bien con la unión a caseosa, imitando eficazmente el proceso in vivo que impide la penetración del fármaco en el núcleo caseosa de granulomas y cavidades que de drogas.

<table><tbody><tr><td>Conejos blancos de Nueva Zelanda</td> Covance-HN878 <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesis (Ketamina) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (xilacina) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sódico y fenitoína sódica) Solución&nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>línea celular monocítica THP-1</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&sup2; Matraz tratado con TC (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medios sin glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Suero bovino fetal, irradiado con rayos gamma&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hypclona L-glutamina, 200 mM</td><td>Plato Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC, 145 mm x 20 mm, ventilado</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Ácido oleico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Dispositivo Placa base reutilizable</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Insertos de dispositivo, 50/caja&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED herramienta de extracción de plaquitas&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Sello de placa adhesiva</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&nbsp;</td><td>Tecnologías de la Vida&nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma 472301</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Clorhidrato de verapamilo</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Sal sódica de diclofenaco</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Solución de azul de tripano, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 pruebas</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr> Molino <tr><td>de bolas Homogeneizador Accesorio, perlas de metal a granel</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalto 60 Irradiador</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&nbsp; Hemacitómetros desechables C-Chip</td> Microscopio óptico vertical <td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de cromatografía líquida binaria</td><td></td><td></td>Leica DM1000 <td></td> Espectrómetro de masas multicomponente Agilent 1260</tr><tr><td></td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in vitro</em&gt; caseosa ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

La erradicación de la enfermedad de la tuberculosis requiere regímenes farmacológicos que pueden penetrar las múltiples capas de lesiones pulmonares complejas. La distribución de fármacos en los núcleos caseosos de cavidades y lesiones es especialmente crucial porque albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a fármacos también comúnmente denominadas persisters. Los métodos existentes para la medición de la penetración del fármaco en lesiones de tuberculosis implican costosos y largos estudios farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas o de formación de imágenes. La medida in vitro de la unión de fármacos a macromoléculas de caseo se propuso como una alternativa a tales técnicas ya que esta unión dificulta la difusión pasiva de moléculas de fármaco a través de caseo. La diálisis de equilibrio rápido es un sistema rápido y fiable para realizar estudios de unión a proteínas plasmáticas y tejidos. En este protocolo, se utilizó un dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a homogenados de caseo que es excised de las lesiones y de las cavidades de los conejos de tuberculosis infectados. El protocolo también se describe cómo generar una matriz sustituta de lípido cargado macrófagos THP-1 para utilizar en lugar de caseosa. Este / ensayo de unión sustituto caseosa es una herramienta importante en el descubrimiento de fármacos tuberculosis y se puede adaptar para ayudar a estudiar la distribución del fármaco en las lesiones o abscesos causados ​​por otras enfermedades.

Usando este protocolo, hemos probado cientos de compuestos de desarrollo de fármacos para la tuberculosis para su eficacia pronosticada en el caso de penetración. La figura 1 visualiza los conceptos básicos del ensayo RED. La membrana de diálisis de los insertos ROJO permite que pequeñas moléculas no unidas se difundan desde el pozo del donante hasta el pozo receptor, logrando finalmente un equilibrio entre ambos compartimentos. Las moléculas pequeñas que están unidas a ...

En este artículo se describe un método de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a caseum de lesiones y cavidades de tuberculosis pulmonar. El protocolo también se utiliza con una matriz espumosa derivada de macrófagos que es un sustituto efectivo del caseo.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Caseosa Ensayo de unión que permite predecir la penetración de fármacos en la tuberculosis lesiones

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

El objetivo general de este protocolo es predecir la unión de fármacos al caseum proveniente de lesiones tuberculosas. Este método puede ayudar a determinar con qué eficacia penetran los antimicrobianos en el núcleo caseoso de lesiones necróticas, sin necesidad de utilizar modelos animales ni técnicas de imagen costosas. Aunque este método puede aportar información útil para el descubrimiento directo de fármacos contra la tuberculosis, también puede aplicarse a otras enfermedades caracterizadas por la formación de lesiones o abscesos en los que la penetración de fármacos es limitada.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la consistencia en la realización del protocolo garantizará la reproducibilidad de los datos entre experimentos. Hoy, demostraré el procedimiento de cultivo celular y la preparación de la matriz sustituta. Hsin-pin, un asociado de investigación de nuestro laboratorio, demostrará el ensayo correcto.Cultive monocitos THP-1 en matraces para cultivo celular T-175 que contengan 80 mL de medio RPMI 1640, con 2 milimolares de L-glutamina y 10 por ciento de suero bovino fetal. Incube los matraces a 37 grados Celsius con cinco por ciento de dióxido de carbono durante tres a cuatro días. Cuando las células alcancen aproximadamente el 70 por ciento de confluencia, divídalas en dos tubos cónicos de 50 mL y centrifúguelos a 150 ×g durante cinco minutos.Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante y suspenda el paladar en 10 mL de medio RPMI 1640. Pase cinco microlitros de este cultivo a un tubo de 1,5 mL que contenga 45 microlitros de azul de tripano. Mezcle bien mediante pipeteo.Transfiera 10 microlitros a un hemocitómetro. Y utilizando un microscopio óptico con aumento de 10x, cuente el número de monocitos THP-1 viables. Tras determinar el número de células viables por mililitro del cultivo, dilúyalo con medio RPMI hasta una densidad final de 1,25 × 10⁶ células por mililitro.Añada 40 microlitros de PMA a 100 micromolar al tubo. A continuación, transfiera el cultivo a una placa de cultivo celular de 140 por 20 milímetros. Deje que las células se adhieran durante la noche en el incubador.A continuación, diluya el ácido ilíaco puro en etanol hasta una concentración de 0,1 molar. Aquí, 31,7 microlitros de ácido ilíaco se disuelven en 968,3 microlitros de etanol. Diluya la solución en medio RPMI fresco, previamente calentado, hasta una concentración de 10 milimolar.Diluya la suspensión de ácido ilíaco a una concentración de trabajo final de 0,4 milimolar en medio RPMI precalentado a 37 grados Celsius. La dilución del ácido ilíaco en medio RPMI precalentado es fundamental para garantizar una disolución suficiente del ácido graso en una solución acuosa. Mediante el uso de una pipeta, retire el medio existente y las células no adherentes de la placa de cultivo celular que contiene macrófagos THP-1, y agregue suavemente 40 mL de ácido ilíaco 0,1 milimolar.Incubar durante la noche a 37 grados Celsius en el incubador. Al día siguiente, utilice un microscopio óptico con aumento de 40x para confirmar visualmente la presencia de numerosas inclusiones de cuerpos lipídicos en el macrófago THP. Los cuerpos lipídicos aparecen como estructuras pequeñas, claras y esféricas en el citoplasma.Retire todo el medio RPMI de la placa de cultivo celular y lave suavemente las células adherentes dos veces con PBS, utilizando una pipeta serológica de 50 mL. Añada 40 mL de EDTA 5 milimolar en PBS a la placa. Incube durante 15 minutos a 37 grados Celsius.A continuación, para desprender los macrófagos espumosos, utilice una pipeta serológica de 10 mL y pipetee repetidamente hacia arriba y hacia abajo sobre toda la superficie de la placa. Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 50 mL y centrifúguelo a 150 × g durante cinco minutos.Después de la centrifugación, resuspenda la paleta celular en 10 mL de PBS y transfiera a un tubo cónico de 15 mL previamente pesado. Vuelva a centrifugar a 150 ×g durante cinco minutos. Luego aspire cuidadosamente el sobrenadante utilizando una pipeta serológica y deseche el líquido.Sometan las paletas de macrófagos espumosos a tres ciclos de congelación-descongelación. Alterne entre hielo seco e incubación a 37 grados Celsius en un bloque térmico para lisar las células. Luego, incube a 75 grados Celsius durante 20 a 30 minutos para desnaturalizar las proteínas en la matriz.Guarde las paletas a menos veinte grados Celsius hasta que sean necesarias. Los dispositivos de equilibrio rápido, o ensayo RED que se muestra en esta sección del video, pueden realizarse utilizando ya sea la matriz sustituta que acabamos de preparar o el material caseoso de lesiones de conejos infectados con TB. Aquí, mostraremos el ensayo tal como se realiza con la matriz sustituta.Prepare soluciones stock de 10 milimolares de todos los compuestos de prueba. Aquí, la moxifloxacina se prepara en DMSO. Diluya a soluciones de trabajo de 500 micromolares en DMSO antes de cada ensayo.Coloque el tubo que contiene el caseum extirpado o la paleta sustituta. Reste el peso del tubo vacío para obtener el peso del caseum o de la paleta sustituta por separado. Añada de dos a tres bolitas de metal por tubo y luego añada PBS en una proporción de uno a nueve de peso a volumen. Mediante un vórtex, rompa el caseum o la matriz sustituta durante un minuto.Añada 6,5 µL del compuesto de prueba preparado a 643,5 µL del homogenato. Para alcanzar la concentración final de cinco micromolar, agite en vórtex. A continuación, coloque los insertos rojos en la placa base.Prepare los insertos para cada prueba, cada compuesto en triplicado. Añada 200 microlitros de la matriz con fármaco a la cámara donadora roja de cada inserto rojo. Luego, añada 350 microlitros de PBS a cada cámara receptora.Coloque un sello adhesivo en la placa e incúbela a 37 grados Celsius en el mezclador térmico a 200 rotaciones por minuto durante cuatro horas. Después de la incubación, mezcle suavemente el contenido de las cámaras donadora y receptora pipeteando hacia arriba y hacia abajo de dos a tres veces. Transfiera 20 microlitros de homogenato de cada una de las cámaras donadoras a 20 microlitros de PBS limpio en un tubo de 1.5 mL.De manera similar, transfiera alícuotas de 20 microlitros de muestras de PBS desde las cámaras receptoras a 20 microlitros de homogenato limpio. La coincidencia de matriz elimina la necesidad de elaborar dos curvas de visión de color separadas, una en homogenato y otra en PBS, para el análisis cuantitativo. El contenido de la cámara donadora forma sedimento con el tiempo.Mezcle suavemente el contenido mediante pipeteo antes de retirar alícuotas. Añada 160 microlitros de una mezcla uno a uno de metanol con acetonitrilo, que contenga 500 nanogramos por mililitro de diclofenaco o 10 nanogramos por mililitro de verapamilo, a cada tubo como estándar interno. Agite en vórtex para precipitar las proteínas.Centrifugar a 10000 x g durante cinco minutos para sedimentar el precipitado y luego transferir los sobrenadantes a placas de 96 pocillos de fondo profundo para su análisis mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas, LCMS. Elabore curvas de calibración de uno a 1000 nanomoles para cada compuesto de ensayo mediante diluciones de la solución stock del compuesto, manteniendo la misma composición de matriz que las muestras. Cuantifique la concentración del compuesto de ensayo en las muestras de las cámaras donadora y receptora utilizando un método LCMS.Calcule la fracción libre, o fu, del fármaco y de la matriz diluida, utilizando la ecuación uno que se muestra aquí. Luego, calcule la fu en la matriz no diluida utilizando la ecuación dos, donde D es igual a un factor de dilución de 10. Finalmente, verifique la recuperación o balance de masa de cada compuesto utilizando la ecuación tres que se muestra aquí.Para identificar compuestos con problemas de estabilidad, metabolismo o unión inespecífica. Tenga en cuenta que la recuperación generalmente se sitúa entre el 70 por ciento y el 130 por ciento. El protocolo descrito en este video se ha utilizado para probar cientos de compuestos en desarrollo para fármacos contra la tuberculosis, con el fin de evaluar su eficacia prevista en la penetración del caseum.La membrana de diálisis de los insertos rojos permite que las moléculas pequeñas no ligadas difundan desde el pocillo donador al pocillo receptor, alcanzando finalmente un equilibrio entre ambos compartimentos. Las moléculas pequeñas que están unidas a macromoléculas como proteínas o lípidos quedan atrapadas en el pocillo donador. El análisis cuantitativo de las muestras de ambos compartimentos permite el cálculo de la fracción no ligada, fu, de cada molécula pequeña en la matriz de cerumen o sustituta, como se muestra aquí.El valor de fu más alto indica una difusión más extensa del fármaco en el caseum. Se realizó espectrometría de masas con ionización por desorción láser asistida por matriz, o MALDI, para seis fármacos. Aquí se muestran mapas iónicos de lesiones pulmonares representativas, donde la intensidad de la señal se indica mediante la barra de escala situada a la izquierda.Se muestra debajo la tinción con hematoxilina y ESN o HNE de cortes adyacentes. Las líneas de contorno en blanco y negro resaltan el centro caseoso de cada lesión. Estos datos son consistentes con la hipótesis de que las moléculas del fármaco difunden hacia la zona externa del caseo desde su interfaz, con las capas celulares de la lesión.La unión a macromoléculas caseosas atrapa el fármaco, impidiendo que se difunda más hacia el núcleo caseoso. Como se muestra aquí, la matriz preparada a partir de macrófagos espumosos derivados de THP-1 es un sustituto eficaz del verdadero caseum. La unión en ambas matrices presenta una fuerte correlación entre sí.Tras seguir este procedimiento, se pueden probar varios compuestos simultáneamente para ahorrar tiempo y recursos. Denominamos a esto prueba en cassetes. Desde su desarrollo, este ensayo ha sido utilizado por múltiples programas de optimización de fármacos líderes en la búsqueda de medicamentos contra la tuberculosis.No olvide que trabajar con microbacterias y muestras de tejido infectado con tuberculosis puede ser extremadamente peligroso, y se debe utilizar un protocolo validado de esterilización de tejidos, mediante radiación gamma, antes de manipular muestras de revestimiento infectadas en un laboratorio BSL2. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Sarathy, J. P. et al. Un ensayo de unión a caseum in vitro que predice la penetración del fármaco en las lesiones tuberculosas. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un ensayo in vitro para medir la unión del fármaco al caseum de las lesiones tuberculosas mediante diálisis de equilibrio rápido. Describe los pasos para preparar suspensiones de caseum, realizar diálisis y calcular la fracción de fármaco no unido para predecir la penetración del fármaco en caseum.

Medición de la unión de fármacos al caseum de lesiones tuberculosas mediante el método de diálisis de equilibrio rápido

Este video muestra un ensayo para evaluar la eficacia de medicamentos contra la infección por Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Se genera un modelo de infección in vitro que contiene agregados de Mtb/macrófagos que imita la infección in vivo. Tras la introducción de antibióticos adecuados, su eficacia se prueba mediante un ensayo de resuzarina para controlar la supervivencia de las bacterias con concentraciones crecientes del fármaco.

Un ensayo para evaluar la eficacia de un fármaco frente a un modelo de infección por Mycobacterium tuberculosis

Aquí, se describe un ensayo fenotípico aplicable a las pantallas de alto rendimiento / alto contenido de ARN sintético de interferencia pequeña (siRNA), compuesto químico, y bibliotecas de mutantes de Mycobacterium tuberculosis. Este método se basa en la detección de tuberculosis de la micobacteria fluorescentemente etiquetada dentro de la célula huésped etiquetada fluorescentemente usando microscopia confocal automatizada.

Un Ensayo Fenotípico Microscópico Para La Cuantificación De Micobacterias Intracelulares Adaptadas Para La Detección De Alto Rendimiento / Alto Contenido

El charcoal a gar resazurin assay (CARA) es un método semicuantitativo de rendimiento medio para evaluar la actividad de los agentes de prueba contra micobacterias que se replican, no replican o ambas.  El CARA permite una evaluación rápida de la actividad dependiente del tiempo y la concentración e identifica los parámetros a seguir mediante ensayos de unidades formadoras de colonias (UFC).

La visualización de la resazurina prueba de carbón en agar para semi-cuantitativa, Enumeración de mediano rendimiento de Micobacterias

Hemos desarrollado un sistema de cribado de alto rendimiento modular para el descubrimiento de nuevos compuestos contra Mycobacterium tuberculosis, la orientación intracelular y en caldo creciente bacterias, así como la citotoxicidad contra la célula huésped de mamífero.

Sistema para la eficacia y la citotoxicidad de detección de inhibidores de focalización intracelular<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Son muy deseables nuevos modelos y ensayos que mejorarían el proceso de desarrollo temprano de fármacos antituberculosos de próxima generación. Aquí, describimos un ensayo rápido, económico y compatible con BSL-2 para evaluar la eficacia de un fármaco contra Mycobacterium tuberculosis que se puede adaptar fácilmente para el cribado de alto rendimiento.

Un ensayo compatible de alto rendimiento para evaluar la eficacia del fármaco contra los macrófagos a pases<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.

Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)

Este estudio desarrolló un ensayo para el cribado de alto rendimiento contra Mycobacterium abscessus con una cepa doble reportera de reciente creación, utilizando fluorescencia y luminiscencia para evaluar rápidamente la viabilidad bacteriana. Este protocolo será relevante para los investigadores que buscan cribar nuevos fármacos contra esta bacteria resistente a los fármacos.

Desarrollo de ensayos para el cribado de fármacos de alto rendimiento contra micobacterias

Aquí presentamos un protocolo para identificar posibles candidatos a fármacos antituberculosos mediante cribado fenotípico, que abarca la síntesis química de un compuesto de 4-aminoquinolina, la determinación de su concentración inhibitoria mínima frente a Mycobacterium tuberculosis y la evaluación de su citotoxicidad en líneas celulares de mamíferos.

Identificación de posibles candidatos anti-TB: Guía paso a paso para la síntesis, determinación de la CIM y evaluación de citotoxicidad en células mamíferas

En este artículo se describe el procedimiento para la formación y la visualización de un biofilm bacteriano crecido dentro de una cámara de diapositivas 8...

En la formación de biofilm in vitro en una diapositiva Cámara de 8 pocillos

Aprende a predecir la unión de fármacos al caseum de lesiones tuberculosas mediante diálisis de equilibrio rápido. Este método evalúa la penetración antimicrobiana sin modelos animales costosos.

Un

Explorar más videos