Name: Ensayo novedoso para la nocicepción en frío Drosophila Las larvas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: Aprende a cuantificar la nocicepción al frío en larvas de Drosophila usando una sonda Peltier personalizada. Este ensayo permite identificar genes conservados y mecanismos moleculares del dolor.

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Agradecemos a Sarah Wu y Camille Graham para el desarrollo de las primeras fases del ensayo enfriado sonda, el Centro de Bloomington Drosophila para poblaciones de moscas, y los miembros del laboratorio Galko para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIH NRSA (NIH F31NS083306) a HNT, y por el NIH R01NS069828, R21NS087360 y una Universidad de Texas MD Anderson Clark Fellowship en Investigación Básica a MJG.

1. Preparación de las larvas <ol><li> Elevar acciones o cruces genéticos en una incubadora a 25 ºC. <ol><li> Si el cultivo de una cruz, utilizar 20-25 hembras vírgenes y 15-20 varones por cada vial que contiene medios de comunicación regular de mosca harina de maíz. Permitir que las hembras ponen huevos a aproximadamente 48 h antes de transferirlos a un nuevo vial de alimentos. </li></ol></li><li> 4-5 días después de la puesta de huevos, recoger 3 rd instar larvas del genotipo deseado por chorros suavemente una corriente de agua en la comida blanda y larvas, y verter el contenido en una, placa de Petri limpia de tamaño mediano (60 mm x 15 mm). </li><li> A continuación, ordenar suavemente larvas por tamaño usando fórceps o un pincel para impedir más grande &quot;errante 3 rd instar&quot; o larvas enfermizo pequeña de ser probado. larvas de Descarte contiene ningún marcadores genéticos no deseadas o equilibradores. </li><li> Tener un compañero de platos de etiquetas miembro del laboratorio o recipientes donde se colocará larvas ordenados de modo que el experimentador puede ser &quot;ciegos&quot; a la experimental condición o genotipo de las larvas en su caso. El experimentador puede aplicar etiquetas decodificadas a los datos recogidos después de que el experimento utilizando una clave generada por un laboratorio-miembro. </li><li> El uso de un scoopula, transferir una cantidad tamaño de una moneda de alimentos frescos en una (35 mm x 10 mm o 60 mm x 15 mm) limpio, placa de Petri etiquetada lleno hasta la mitad con agua a temperatura ambiente. </li><li> mover suavemente el larvas ordenados sobre el alimento (para evitar la inanición o desecación si se anticipa pruebas que tomar más de 20 min) usando fórceps o pincel. </li></ol> 2. Fría ensayo de sondas <ol><li> A su vez en la unidad de sonda fría permitiendo unos pocos minutos para que se enfríe a la temperatura deseada. Si el ajuste a temperaturas más bajas, la condensación es probable que formar a lo largo de la sonda. </li><li> Limpiar cualquier exceso de humedad con un laboratorio de toallita antes de la aplicación a la larva. Cuando no está en uso inmediato, el lugar de aislamiento tapa de la sonda a la vez aislar y mantener la punta limpia y evitar daños. </li><li> Colocar un 3 rd instar larva mediados sobre una pieza delgada de vinilo movible oscuro (típicamente, utilice un pequeño trozo cortado de un aglutinante notebook) bajo un microscopio de campo brillante. Las ayudas de vinilo negros en la visualización de contraste y en mover la larva sin tocarlo para alinearlo correctamente con la sonda. </li><li> Ajuste el microscopio (véase la Tabla de Materiales) y la unidad de luz (véase la Tabla de Materiales) a brillo medio (50-75% de brillo max) para proporcionar contraste y evitar que la larva se seque demasiado rápido. </li><li> Descarte cualquier larva que no exhiben primera locomoción peristáltica normal, ya que podrían confundir los resultados. La larva debe estar húmedo de la placa de Petri de agua de lo contrario la larva se adherirá a la de vinilo inhibir la locomoción normal. El agua no debe formar un charco alrededor de la larva. </li><li> Avanzar en la sonda con la mano hacia la larva en un ángulo de 90º con respecto al eje anteroposterior del cuerpo, utilizando el vinilo para mover la larva en corposición rect (véase la Figura 1A). </li><li> Oriente la punta de la sonda para sentar suavemente por la superficie dorsal media de la larva con la sonda en un ángulo de aproximadamente 45º a la platina del microscopio. </li><li> Tras el contacto de la sonda, iniciar un temporizador de laboratorio. Aplicar suficiente presión hacia abajo para sangrar ligeramente la superficie de la cutícula larval mientras que todavía permite adelante o movimiento hacia atrás. </li><li> Mantener la sonda en su lugar durante un máximo de 10 s o hasta que se observó una respuesta de comportamiento evocada por el frío - lo que ocurra primero. A continuación, retire la sonda. </li><li> Registrar la respuesta conductual observada y la latencia de respuesta. Las larvas que no responde dentro de 10 s se consideran &quot;no respondedores&quot;. Latencia también se puede grabar para los respondedores y se usa para medir los cambios en respuesta robustez / amplitud. </li><li> Descartar larva y preparar el siguiente. </li><li> Repetir los pasos 2.3 a 2.11 hasta que se alcanza el número deseado de larvas de prueba (tres conjuntos de n = 20-40 larvas fueron used aquí). </li></ol>

<ol><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).</li>
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<li>Hwang, R. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).</li>
<li>Im, S. H., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pokes%2C+sunburn%2C+and+hot+sauce%3A+Drosophila+as+an+emerging+model+for+the+biology+of+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception.</a> Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).</li>
<li>Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+tool+for+studying+the+conserved+genetics+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain.</a> Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).</li>
<li>Turner, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TRP+Channels+Pkd2%2C+NompC%2C+and+Trpm+Act+in+Cold-Sensing+Neurons+to+Mediate+Unique+Aversive+Behaviors+to+Noxious+Cold+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila.</a> Curr Biol. , (2016).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).</li>
<li>Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+filopodia%2C+Ripped+Pocket%2C+NOMPC%2C+and+NMDARs+contribute+to+the+sense+of+touch+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).</li>
<li>Yan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+NOMPC+is+a+mechanotransduction+channel+subunit+for+gentle-touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation.</a> Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).</li>
<li>Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113 (2), 261-273 (2003).</li>
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<li>Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+and+global+methods+of+assessing+thermal+nociception+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae.</a> J Vis Exp. (63), e3837(2012).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134 (1), 55-64 (2007).</li>
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<li>Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+directional+change+after+mechanical+stimulation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila.</a> Mol Brain. 5, 39(2012).</li>
<li>Im, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tachykinin+acts+upstream+of+autocrine+Hedgehog+signaling+during+nociceptive+sensitization+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila.</a> Elife. 4, e10735(2015).</li>
<li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+regulates+nociceptive+sensitization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization.</a> Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).</li>
<li>Berrigan, D., Pepin, D. J. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/002219109400113U">How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera.</a> J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).</li>
<li>Galko, M. J., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+genetic+analysis+of+wound+healing+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae.</a> PLoS Biol. 2 (8), E239(2004).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+genetic+discovery+of+targets+and+anti-targets+for+cancer+polypharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology.</a> Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).</li>
<li>Pandey, U. B., Nichols, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+disease+models+in+Drosophila+melanogaster+and+the+role+of+the+fly+in+therapeutic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery.</a> Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).</li>
<li>Gill, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistate+life-tables+and+regression+models%5BTitle%5D)+AND+%22Math+Popul+Stud%22%5BJournal%5D)">Multistate life-tables and regression models.</a> Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).</li>
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<li>Breslow, N. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2334776?seq=1#page_scan_tab_contents">A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship.</a> Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).</li>
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</ol>

Una solicitud de patente de Estados Unidos (CL) está pendiente en el diseño de la sonda fría. Información adicional sobre los detalles de los números de pieza sonda fría y la construcción, así como la consulta adicional sobre el diseño de la herramienta se puede proporcionar a petición.

El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la nocicepción o sensibilización nociceptiva en larvas de varios fondos genéticos, influencias ambientales, y / o condiciones de avería inducida. Dado que este ensayo permite la aplicación focal de un estímulo frío, con esta herramienta se puede evaluar la función de un subconjunto de neuronas sensoriales periféricas específicamente en respuesta a las temperaturas frías. Curiosamente, estos comportamientos evocados fríos parecen utili...

Drosophila ha demostrado ser de gran utilidad para la identificación de nuevos genes conservados y circuitos neuronales que subyacen a los comportamientos complejos. Moscas proporcionan un conjunto de herramientas genético sofisticado y un sistema nervioso simplificado, que permiten la manipulación precisa genética y neuronal 1, 2, 3, 4 para diseccionar las bases celulares y moleculares de la nocicepción 5, 6, 7. Las larvas son particularmente útiles para estos análisis, dado que los ensayos de comportamiento para el tacto suave 8, 9, 10, calor nocivo 11, 12, 13 y la sensación mecánica de estímulos nocivos 4, </sup&gt; 11 ya se han establecido, y la cutícula larval transparente permite la obtención de imágenes en vivo o fijo de la epidermis y de las neuronas sensoriales subyacentes. Recientemente, un ensayo frío nocivo También se ha desarrollado 7, que se describe con más detalle aquí. Usando una sonda fría bien,-cónica con punta, mostramos que exhiben las larvas de Drosophila un conjunto de comportamientos reactivos específicos de frío, distinto de comportamientos observados durante la locomoción normal, siguientes toque suave, o después de duras estímulos mecánico de temperatura o alta 7, 8, 11 . Los comportamientos específicos de frío incluyen un robusto contracción de todo el cuerpo (CT), un aumento de 45-90º de los segmentos posteriores (PR) y un aumento simultáneo de la parte anterior y posterior segmentos en forma de U (Estados Unidos). La prevalencia de estos comportamientos se incrementa con temperaturas decrecientes pero cada picos a sligeramente diferentes temperaturas frías. Trabajos recientes sugieren que las respuestas de TC están mediadas por diferentes neuronas sensoriales periféricas que los que responden a estímulos calor nocivo o mecánica dura 7. Al igual que los nociceptores vertebrados, Drosophila dendríticas múltiple (MD), las neuronas sensoriales periféricas tienen estructuras dendríticas complejos que ramifican sobre la epidermis 1. neuronas MD están presentes en cada segmento del cuerpo de las larvas, la proyección de sus axones al cordón nervioso ventral 14. neuronas sensoriales MD están separados en cuatro clases diferentes (I-IV) en base a la morfología dendrítica y tienen diferentes funciones sensoriales 4, 9, 10, 15, 16, 17. Si bien se requieren neuronas clase IV para las respuestas de balanceo de la carrocería lateral de larvasa altas temperaturas o estímulos mecánicos dura 4, clase III se requieren las neuronas para las respuestas de suave tacto 9, 10 y no sólo se activan por frío, pero también son necesarios para las respuestas de comportamiento evocada por frío 7. Ambos de clase III y clase IV neuronas utilizan potenciales canales discretos receptor transitorio (TRP) para facilitar las respuestas de comportamiento a nociva 7, 11, 18 y no nocivo estímulos 9, 10, 17, 19. Además, la nocicepción larval se sensibiliza después de la lesión, en los niveles celular 20 y de comportamiento 12, 21. El ensayo descrito aquí permite la quantification de cualquiera normal, o potencialmente alteró las respuestas de comportamiento a bajas temperaturas que van desde nocivo frío (≤ 10 ºC), enfriar inocuo (11-17 ºC), a temperatura ambiente (18-22 ºC). Las temperaturas frías utilizadas en este ensayo son capaces de activar directamente de clase III neuronas sensoriales, provocando robustos, los aumentos de calcio reproducibles y respuestas de comportamiento evocada por frío, que puede ser cualitativa y cuantitativamente analizadas 7. Este ensayo puede ser aplicado a larvas de virtualmente cualquier genotipo, así como a las larvas expuestas a diversas condiciones ambientales (nutrición alterado, lesión, agentes farmacológicos) para determinar los factores tanto genéticos como ambientales que afectan a la nocicepción frío, sensibilización nociceptiva o plasticidad nociceptivo. Dado que thermosensation es ubicuo en muchas especies, este ensayo proporciona una herramienta valiosa para el estudio de la nocicepción y puede descubrir nuevas dianas de genes o interacciones neuronales que mejorennuestra comprensión de la nocicepción vertebrados. La sonda fría hecha a la medida (ver sonda fría, Tabla de Materiales) utiliza una temperatura de bucle cerrado controlado dispositivo Peltier, que enfría el tubo de aluminio y punta cónica a través de la conducción térmica. Un termistor está incorporado dentro de la punta cónica de aluminio informa de la temperatura en tiempo real sobre la unidad de control. Un disipador de calor y el ventilador están unidos al módulo termoeléctrico para regular la carga del efecto Peltier calor (Qc) de modo que el intervalo de temperatura deseado de (22-0 ° C) se puede lograr (véase la unidad de control térmico, Tabla de Materiales). El estímulo frío nocivo de la punta de sonda fría se aplica a mano a la línea media dorsal, a segmento (s) equidistante de los extremos anterior y posterior (aproximadamente segmento A4, véase la Figura 1A) de la larva. En respuesta a estímulos de frío, las larvas generalmente producen uno de los tres comportamientos evocados frías dentro de un 10 s de corte: un cuerpo llenocontracción (TC), un aumento de 45-90º segmentos anterior y posterior en forma de U (Estados Unidos), o un aumento de los segmentos posteriores (PR) (descritos en los resultados). Ninguno de estos comportamientos se llevan a cabo durante la locomoción peristáltica normal o comportamiento de forrajeo. Estos comportamientos también son distintas de las respuestas táctiles suaves y la respuesta aversiva rodadura a alta temperatura o estímulos mecánicos nocivos.

<table><tbody><tr><td>Sonda de frío</td><td>Pro-Dev Engineering</td><td>Hecho a medida bajo demanda Los números de</td><td>pieza y los detalles de construcción se pueden proporcionar a pedido</td></tr><tr><td>Unidad de control térmico</td><td>Tecnología TE</td><td>Gabinete personalizado</td> Los <td>números de pieza y los detalles de construcción se pueden proporcionar a pedido</td></tr><tr><td>Microscopio Zeiss Stemi 2000</td><td>Zeiss</td><td>NT55-605</td><td></td></tr><tr><td>Fiber-Lite MI-150 Iluminador</td> <td>de alta intensidadIndustrias Dolan-Jenner.</td><td>A20500</td><td></td></tr><tr><td>Schott Doble cuello de cisne de 23 pulgadas Guía de luz de fibra óptica</td><td>Schott North America, Inc.</td><td>Pinza Schott A08575</td><td></td></tr><tr><td>FST</td><td></td><td>FS-1670</td><td>Se utiliza para clasificar y manipular larvas. Asegúrese de alisar y desafilar ligeramente las puntas de las pinzas para reducir el riesgo de perforar o lesionar accidentalmente las larvas</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Dick Blick Art Materials</td><td>06762-1002</td><td>Se utiliza para clasificar y manipular larvas. Es útil si el pincel está húmedo durante el uso.</td></tr><tr><td>35 mm x 10 mm Placa de Petri de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>60mm x 10 mm Placa de Petri de poliestireno</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Pieza de vinilo negro (al menos 2 pulgadas x 2 pulgadas)</td><td></td><td></td><td>Se utiliza para proporcionar contraste y orientar las larvas a la sonda fría</td></tr><tr><td>Fisherbrand Scoopula Espátula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td>Se utiliza para mover alimentos</td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td>Se utiliza para secar las larvas y sondear en frío si hay exceso de humedad</td></tr></tbody></table>

ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em&gt; drosophila</em&gt; las larvas

Novel Assay for Cold Nociception in Drosophila Larvae

Cómo los organismos detectar y responder a las temperaturas nocivas aún es poco conocido. Además, los mecanismos de sensibilización de la maquinaria sensorial, tal como en los pacientes que experimentan la neuropatía periférica o sensibilización inducida por la lesión subyacentes, no están bien caracterizados. El modelo de Drosophila genéticamente tratables se ha utilizado para estudiar las células y los genes necesarios para la detección de calor nocivo, que ha dado múltiples genes conservados de interés. Poco se sabe sin embargo sobre las células y los receptores importantes para la detección frío nocivo. Aunque, Drosophila no sobrevive a la exposición prolongada a temperaturas frías (≤10 ºC), y evitará fresco, prefiriendo las temperaturas más cálidas en ensayos de preferencias de comportamiento, cómo se detectan y, posiblemente, evitar estímulos de frío nocivos sólo recientemente ha sido investigado. Aquí se describen y caracterizan los primeros fríos nocivo (≤10 ºC) en el ensayo de conductaDrosophila. El uso de esta herramienta y el ensayo, se muestra un investigador cómo evaluar cualitativa y cuantitativamente comportamientos nociceptivos fríos. Esto puede hacerse en condiciones de cultivo normales / sanos, o presumiblemente en el contexto de una enfermedad, lesión o sensibilización. Además, este ensayo puede ser aplicado a larvas seleccionadas para los genotipos deseados, lo que podría impactar thermosensation, dolor, o sensibilización nociceptiva. Dado que el dolor es un proceso altamente conservada, utilizando este ensayo para estudiar más a fondo la nocicepción térmica es probable que recoger importante comprensión de los procesos de dolor en otras especies, incluyendo vertebrados.

Drosophila larvas se mueven con un movimiento peristáltico que incluye pausas ocasionales, cabeza vueltas, y los cambios de dirección 22. En respuesta a la aplicación focal de un estímulo nocivo frío sin embargo, las larvas presentan un conjunto de comportamientos únicos, a diferencia del rodillo lateral aversivo al calor nocivo y estímulos mecánicos. Estos comportamientos también son diferentes de las respuestas al toque suave 8,</...

Aquí se demuestra un nuevo ensayo para estudiar la nocicepción frío en larvas de Drosophila. Este ensayo utiliza una sonda Peltier hecha a la medida capaz de aplicar un estímulo frío nocivo focal y da lugar a comportamientos específicos de frío cuantificables. Esta técnica permitirá además disección celular y molecular de la nocicepción frío.

Ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

How organisms sense and respond to noxious temperatures is still poorly understood. Further, the mechanisms underlying sensitization of the sensory ...

El objetivo general de este ensayo de frío nocivo es poder cuantificar y evaluar los cambios en la detección del frío inofensivo a nocivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nocicepción, incluyendo la facilitación de la identificación de genes novedosos y conservados de nocicepción al frío, así como moduladores de las respuestas al dolor en enfermedades o lesiones. La principal ventaja de esta técnica es que permite la manipulación precisa del estímulo de frío nocivo y la cuantificación de las respuestas inducidas por el frío en una variedad de contextos ambientales y genéticos.Generalmente, las personas nuevas en este método necesitarán practicar la aplicación consistente de la sonda antes de comenzar un experimento. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando descubrimos que las larvas de drosófila responden al calor nocivo y nos preguntamos si reaccionan de manera similar al frío nocivo. Eleve cepas o cruces genéticos de drosófila en un incubador a 25 grados Celsius.Tenga en cuenta que, si está cultivando un cruzamiento, utilice de 20 a 25 hembras vírgenes y de 15 a 20 machos por frasco que contenga medio estándar de maíz para moscas, y cultive durante aproximadamente 48 horas antes de transferir las moscas a un nuevo frasco con alimento. Cinco días después de iniciar el cultivo, recolecte larvas de tercer estadio del genotipo deseado rociando suavemente un chorro de agua sobre la comida blanda y las larvas. Luego, vierta el contenido en una placa de Petri limpia de tamaño mediano.A continuación, separen suavemente las larvas por tamaño, utilizando pinzas para excluir larvas más grandes de tercer estadio errantes o larvas pequeñas y débiles. Descarten las larvas que contengan marcadores genéticos no deseados o balanceros. Que otro miembro del laboratorio etiquete los recipientes donde se colocarán las larvas clasificadas para mantener al experimentador ciego respecto a la condición experimental o al genotipo de las larvas.Utilice una espátula para transferir una pequeña cantidad de alimento fresco a una placa de Petri limpia y etiquetada, llena hasta la mitad con agua a temperatura ambiente. Finalmente, use pinzas para mover suavemente las larvas clasificadas hacia el alimento, a fin de prevenir la desnutrición o desecación, si se prevé que la prueba dure más de 20 minutos. Comience encendiendo la unidad de la sonda fría y déjela enfriar unos minutos hasta alcanzar la temperatura deseada.Elimine cualquier exceso de humedad en la sonda con una toalla de laboratorio. Cuando no se utilice inmediatamente, coloque una tapa aislante sobre la sonda para aislarla, mantener la punta limpia y evitar daños. A continuación, coloque una larva de tercer estadio medio sobre un trozo delgado de vinilo oscuro móvil para ayudar con la visualización del contraste y la alineación de la sonda.Luego, coloque este trozo de vinilo con la larva bajo un microscopio de campo brillante. Ajuste el microscopio y la unidad de luz a un brillo medio para proporcionar contraste y evitar que la larva se seque demasiado rápido. Utilizando un pincel húmedo, asegúrese de que la larva esté húmeda con el agua del plato de Petri para que no se adhiera al vinilo, y elimine cualquier exceso de agua que la rodee usando una toallita KimWipe.Avance manualmente la sonda hacia la larva en un ángulo de 90 grados respecto al eje corporal anteroposterior, utilizando el vinilo para colocar la larva en la posición correcta. Oriente luego la punta de la sonda de manera que quede suavemente apoyada sobre la superficie media dorsal de la larva, con la sonda en un ángulo aproximado de 45 grados respecto al platino del microscopio. Al producirse el contacto con la sonda, active un cronómetro.Aplique suficiente presión hacia abajo para hundir ligeramente la superficie de la cutícula larval, permitiendo aún el movimiento hacia adelante o hacia atrás. A continuación, mantenga la sonda en su lugar durante hasta 10 segundos o hasta que se observe una respuesta conductual inducida por el frío, lo que ocurra primero. Luego, retire la sonda.Registre la respuesta conductual observada y la latencia de la respuesta. Tome nota de cualquier no respondedor o larva que no responda dentro de los 10 segundos. Finalmente, deseche la larva y prepare la siguiente.Repita el procedimiento hasta alcanzar el número deseado de larvas de prueba. Después del contacto con la sonda fría, los resultados de este experimento indican que las larvas responden con los siguientes comportamientos inducidos por el frío: contracción (CT) al comprimir sus segmentos anterior y posterior hacia el centro del cuerpo, elevación de los segmentos anterior y posterior en el aire formando una forma de U (US), y elevación únicamente de los segmentos posteriores en el aire (PR). Además, diferentes comportamientos alcanzan su punto máximo en rangos de frío variables, de modo que PR y US alcanzan su pico entre tres y ocho grados Celsius, mientras que CT alcanza su máximo alrededor de nueve a 14 grados Celsius. Por último, al comparar las latencias de los diferentes comportamientos por frío, estos datos muestran que las respuestas CT fueron significativamente diferentes de PR y US a tres grados Celsius y a 10 grados Celsius, y de US a 20 grados Celsius.Una vez dominada, esta técnica puede completarse en aproximadamente 30 a 40 minutos para un conjunto de 30 larvas. Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta la locomoción anormal, el nivel de humedad de la larva y la presión y colocación de la sonda fría sobre la larva. La demostración visual de este método es fundamental, ya que una aplicación inadecuada de la sonda fría podría dar lugar a curvas de respuesta a la dosis diferentes o a la ausencia del comportamiento de respuesta al frío.Tras seguir este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos, como imágenes con luz fluorescente, análisis de expresión génica y ensayos conductuales. Todos determinarán cómo la exposición al frío afecta la actividad celular, la morfología, la expresión génica u otros comportamientos. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la nocicepción al frío estudien los efectos genéticos, ambientales y de enfermedades en *Drosophila*.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la herramienta y el ensayo de la sonda fría para analizar las respuestas inducidas por el frío y comprender los mecanismos celulares y genéticos de la nocicepción al frío.

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