Name: La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Aprenda a evaluar la susceptibilidad de virus influenza A y B a inhibidores de neuraminidasa mediante un ensayo fluorimétrico. Este método permite identificar cepas resistentes y calcular valores IC50 para guiar tratamientos antivirales efectivos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

El Melbourne Centro Colaborador para Referencia e Investigación sobre la Gripe es apoyado por el Departamento de Salud del Gobierno de Australia.

1. Determinación del rango lineal del producto fluorescente 4-MU en un fluorómetro <ol><li> Preparar 10 ml de mM 4-MU solución madre de 6,4 disolviendo 11,3 mg de 4-MU en 5 ml de etanol absoluto. Añadir 5 ml de NaCl al 0,9% (w / v) a la solución madre para hacer 10 ml. Preparar una 640? M de solución de trabajo diluyendo 1 ml de 6,4 mM 4-MU en 9 ml de 1x tampón de ensayo (ácido 33,3 mM de ácido 2- (N-morfolino) etanosulfónico (MES) y CaCl2 4 mM, pH 6,5). NOTA: Preparar el tampón de ensayo 2x mediante la adición de 13 g de MES y 8 ml de 1 M CaCl2 para 992 ml de agua destilada. Ajustar el pH a 6,5 ​​usando 10 M de NaOH. Filtrar el tampón utilizando un filtro de acetato de celulosa estéril de tamaño de poro 0,2 m. ¡Precaución! El hidróxido de sodio es cáustico y puede causar quemaduras químicas en la piel y los ojos. Asegúrese de que el equipo de protección personal completo está desgastado. </li><li> Preparar 5 ml de una gama de concentraciones de 4-MU (es decir, 5? M, 10? M, 20? M, 40? M, 80? M, 160 &amp; #181; M, y 320? M) a través de una dilución en serie de dos veces de 640? M 4-MU usando tampón de ensayo 1x. </li><li> Dispensar 50 l de cada dilución en serie de 4-MU (es decir, 5? M, 10? M, 20? M, 40? M, 80? M, 160? M, 320? M y 640? M) (dos pocillos por dilución) en un claro, 96- así placa de fondo plano y 50! l de tampón de ensayo 1x en los pocillos restantes (que sirven como espacios en blanco para medir señales de fondo). NOTA: Las concentraciones finales de 4-MU en el volumen de reacción (50! L 4-MU + 50! L 300 mM Munana) son 2,5 M, 5 M, 10? M, 20? M, 40? M, 80? M, 160? M y 320? M . </li><li> Preparar una mM MUNANA solución madre de 2,5 mediante la reconstitución de 25 mg de Munana en 20 ml de agua destilada. Mezclar 0,72 ml de Munana 2,5 mM con 5,28 ml de 1x tampón de ensayo para obtener un 300? M Munana solución de trabajo (volumen suficiente para una placa). Cubrir el tubo que contiene la Munana workin 300 Mg de solución con papel de aluminio y mantenerlo en hielo si no se utiliza inmediatamente. Descarte cualquier materiales sobrantes. NOTA: El mM MUNANA solución madre de 2,5 se puede almacenar a -20 ° C durante 1 mes y debe ser utilizado dentro del ciclo / descongelación uno congelación. Las 4-MU soluciones y Munana son sensibles a la luz y deben ser protegidos de la exposición a la luz prolongado. </li><li> Añadir 50 l de 300 Munana M a cada pocillo, golpee suavemente para mezclar, y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. NOTA: Este paso es para tener en cuenta la fluorescencia de fondo en el ensayo de inhibición de NA. </li><li> Preparar la solución de parada mediante la mezcla de 11 ml de etanol absoluto con 2,225 ml de NaOH 0,824 M (volumen suficiente para una placa). </li><li> Añadir 100! L de solución de parada a cada pocillo para detener la reacción y golpear suavemente para mezclar. </li><li> Leer la placa usando un fluorómetro con un ajuste de longitud de onda de excitación de 355 nm y un ajuste de longitud de onda de emisión de 460 nm, como per las instrucciones del fabricante. </li><li> Calcular la media de la señal de fondo usando señales de fluorescencia de todos los pocillos que no contienen 4-MU. Restar esta señal media de fondo de cada uno de los pocillos que contienen 4-MU y calcular las señales de promedio (RFU) para cada concentración de 4-MU. Trazar una curva estándar de RFU frente a la concentración de 4-MU (M), como se muestra en la Figura 1a; una sección lineal de primer plano de la curva se muestra en la Figura 1b. </li><li> Visualizar la trama de RFU contra 4-MU concentración (M) para determinar el intervalo lineal y la señal objetivo óptimo; el intervalo lineal es donde la señal de fluorescencia aumenta en proporción al aumento de las concentraciones de la 4-MU en el terreno, mientras que la señal objetivo óptimo es una concentración de 4-MU arbitrario dentro del rango lineal. NOTA: El intervalo lineal y la señal objetivo óptimo son-fluorómetro específico. Por ejemplo, el fluorómetro en el Melbourne WHOCCRRI tiene un rango lineal de 20,5 a 40? M 4-MU y una señal objetivo óptimo de ~ 30? M 4-MU, que corresponde a ~ 1.500 RFU. </li></ol> 2. La determinación de la actividad de NA de los virus NOTA: Los virus de influenza son cultivadas a títulos suficientes en Madin-Darby Canine Kidney células (MDCK) o huevos de pollo embrionados 8. <ol><li> Dispensar 120 l por pocillo de virus de influenza en cultivo sin diluir en la columna 1 y 60! L de tampón de ensayo 1x que contienen 0,1% de NP-40 en las 11 columnas restantes de un de 96 pocillos, la placa de fondo en U. </li><li> En serie realizar dilución de dos veces de los virus a través de la placa (es decir, la transferencia de 60! L de la columna 1 a la columna 2 y así sucesivamente, hasta la columna 11) usando una pipeta multicanal, sale de la columna 12 como un blanco que contiene tampón de ensayo solamente 1x. </li><li> Transferir 50! L de cada uno de los pocillos (virus y espacios en blanco diluido) en un 96 pocillos, la placa transparente, de fondo plano. NOTA: No es necesario cconsejos hange pipeta si los materiales se transfieren desde la columna 12 a través de a la columna 1. </li><li> Añadir 50 l de 300 mM Munana (preparado como en la etapa 1.4) por pocillo y golpear suavemente la placa para mezclar. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 h. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. </li><li> Añadir 100! L de solución de parada (preparado como en la etapa 1.6) por pocillo para terminar la reacción y golpear suavemente la placa para mezclar. </li><li> Leer la placa usando un fluorómetro. <ol><li> Utilice un ajuste de la longitud de onda de excitación de 355 nm y un ajuste de la longitud de onda de emisión de 460 nm. </li></ol></li><li> Determinar la señal de fondo promedio basado en las lecturas de fluorescencia de la columna 12 y restar la señal de fondo promedio de cada pocillo. Trazar un gráfico de RFU frente a diluciones de virus. NOTA: Los valores de fondo para 100 Munana M en el WHOCCRRI Melbourne son típicamente entre 50 y 120 RFU, pero estos serán diferentes dependiendo de la bei fluorómetrong utiliza. </li><li> Ver la trama de RFU contra diluciones de virus para determinar el punto medio de la sección lineal de la curva para cada virus (Figura 2). Utilice la señal objetivo óptimo (determinado en el paso 1) como el punto de referencia. NOTA: Este debe corresponder con el intervalo lineal 4-MU del fluorómetro determina en el apartado 1 y proporcionará la concentración apropiada de virus para ser utilizado en la sección 3. </li></ol> 3. Estimación de la susceptibilidad Virus de NA inhibidores usando el Ensayo de inhibición de NA <ol><li> Preparar lotes maestros de inhibidores de NA a concentraciones de 300? M. <ol><li> Preparar 300 M zanamivir (peso molecular, PM = 332,32 g / mol) por disolución de 5,0 mg de zanamivir en tampón de ensayo 50 ml de 2x (MES 66,6 mM y 8 mM de CaCl2, pH 6,5). </li><li> Preparar 300 M carboxilato de oseltamivir (D-tartrato; PM = 386,44 g / mol) por disolución de 5,8 mg en 50 ml de tampón de ensayo 2X. </li><li> Preparar300? M peramivir trihidrato (PM = 382,45 g / mol) por disolución de 5,7 mg en 50 ml de tampón de ensayo 2X. </li><li> Preparar 300 M Laninamivir (PM = 346,34 g / mol) por disolución de 5,2 mg en 50 ml de tampón de ensayo 2X. NOTA: Los lotes maestros de inhibidor de NA se pueden almacenar a -20 ° C durante 12 meses. Compruebe el MW de los inhibidores de NA para asegurar los pesos y volúmenes correctos se utilizan en la reconstitución. El carboxilato de oseltamivir es el compuesto activo del fosfato profármaco oseltamivir. Por lo tanto, sólo el carboxilato de oseltamivir se debe utilizar en el ensayo de inhibición de NA. </li></ol></li><li> A partir de los lotes maestros, preparar stocks de diez veces diluciones en serie de los inhibidores de NA en 50 tubos de centrífuga mL trabajar a concentraciones de 0,03 nM, 0,3 nM, 3 nM, 30 nM, 300 nM, 3000 nM, y 30.000 nM en el ensayo de 2x tampón (MES 66,6 mM y 8 mM de CaCl2, pH 6,5); esto es para uso a través de múltiples ensayos. NOTA: Las concentraciones finales de inhibidores de NA en la volum reaccióne (50? l de dilución de virus + 50 l de NA inhibidor + 50 l de 300 Munana M) son 0,01 nM, 0,1 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM, 1000 nM, y 10 000 nM, respectivamente. La concentración final no incluye los 100 l de solución de parada. Almacenar todos los inhibidores de diluciones de NA a 2-8 ° C. La fecha de caducidad es el mismo que el de los lotes maestros. </li><li> Preparar las diluciones de virus en tampón de ensayo 1x que contienen 0,1% de NP-40 tensioactivo en un bloque de 96 pocillos profundos. El uso de diluciones de virus a partir de los resultados del ensayo de actividad de NA derivados de la sección 2. Utilizar un volumen total de 2 ml por virus para probar cuatro inhibidores de NA. NOTA: Preparar dos pozos (1 ml por pocillo) por virus en un bloque de 96 pocillos profundos. Ejemplos de diluciones de virus para el virus de 1, 2, y 3 se muestran en la Tabla 1. </li><li> Dispensar el volumen requerido de inhibidores de la NA (preparado como en la etapa 3.2) en un depósito 8 de pozo profundo. A partir de ahí, dispensar 50 l de inhibidores de la NA a diluciones que varían de 0 nM (2x ensayo bsolamente Uffer) a 30.000 nM en las filas A a H en una de 96 pocillos, la placa transparente, de fondo plano. NOTA: La disposición de la placa se ilustra en la Figura 3. </li><li> Añadir 50 l de virus de ensayo diluidos por pocillo a las columnas 1-11 y 50 l por pocillo de tampón de ensayo 1x solamente a la columna 12. Golpear suavemente la placa para mezclar e incubar a temperatura ambiente durante 45 min. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. </li><li> Añadir 50 l de 300 mM Munana (preparado como en la etapa 1.4) por pocillo y golpear suavemente la placa para mezclar. Incubar la placa a 37 ° C durante 1 h. Cubrir la placa con un sellador de placas para evitar la evaporación. </li><li> Añadir 100! L de solución de parada (preparado como en la etapa 1.6) a cada pocillo y golpear suavemente la placa para mezclar. </li><li> Leer la placa usando un fluorómetro. <ol><li> Utilice una longitud de onda de excitación de 355 nm y una longitud de onda de emisión de 460 nm, como se describe anteriormente. </li></ol></li></ol> 4. Cálculo deLos valores de CI50 NOTA: El v1.2 JASPR es un software de ajuste de curvas que permite el cálculo de los valores de CI50. El software fue desarrollado por la División de Influenza de los CDC, Atlanta, EE.UU.. El software utiliza la ecuación: V = V max x (1 - ([I] / (K i + [I]))), donde V max es la tasa máxima de metabolismo, [I] es la concentración de inhibidor, V es la respuesta se inhibió, y K i es el IC 50 para la curva de inhibición. <ol><li> Copiar y pegar los datos en bruto que salen de la fluorómetro en una hoja de cálculo en un formato de placa de 12 columna (96 pocillos), a partir de la celda A1. NOTA: Raw datos de cada placa posterior debe ser escalonada por una fila vacía. Si cada virus ha sido probado contra cuatro inhibidores de la NA, pegar los datos en bruto en un conjunto de cuatro (con una fila vacía entre cada placa). </li><li> Abra el software de adaptación y click en la pestaña &quot;Experimento&quot;. Elija &quot;alternativos 2-fármaco Fluoro 11 muestras.&quot; </li><li> Haga clic en la pestaña &quot;Opciones&quot; y marca &quot;generar gráficos.&quot; </li><li> Haga clic en &quot;Opciones&quot; de nuevo y haga clic en la pestaña &quot;Nueva clave&quot;. Guarde el archivo .csv &quot;inhibition_key&quot; en la misma carpeta que el archivo de la hoja de datos en bruto. </li><li> En el archivo inhibition_key, listar todos los nombres de las muestras por debajo de la ID. Cada nombre de la muestra debe ser único. </li><li> Si se probaron cuatro inhibidores de la NA, insertar espacios para dos filas adicionales a continuación Oseltamivir y el tipo de &quot;Peramivir&quot; y &quot;Laninamivir.&quot; Guardar los cambios realizados en el archivo inhibition_key. </li><li> Volver a la &quot;jaspr v 1.2-Inhibición Ajuste de curvas&quot; de la ventana y seleccione el archivo de datos brutos como el &quot;Experimento Archivo&quot; y inhibition_key como el &quot;archivo de clave.&quot; Ejecutar el análisis. Guardar los resultados en formatos .csv y .pdf. Nota: El software trazará automáticamente una curva de inhibición (RFU agaiNST NA concentraciones de inhibidor), como se muestra en la Figura 4. El programa también calcula los valores de IC50 para cada virus frente a un particular inhibidor de NA (Figura 4). Además, JASPR presenta los valores de CI 50 y el fondo de señal a (S / B) relación en formato de hoja de cálculo. Los valores de fondo pueden diferir de un laboratorio a otro dependiendo del fluorómetro usado. Al Melbourne WHOCCRRI, el fondo valora para la gama Munana 100? M de 50 a 120 RFU. Para un valor fiable IC 50, se prefiere una relación de S / B de ≥10, aunque una proporción de menos de 10 es todavía aceptable, en particular para los virus mutantes que tienen una actividad muy baja NA. </li><li> Inspeccionar los valores de IC50 y las formas de las curvas generadas por el software. Todos los puntos de datos deben caer sobre o cerca de la curva; si no lo hacen, repetir el ensayo de inhibición de NA. NOTA: Para los virus que muestran inusualmente altos valores de CI 50, el ensayo debe ser de repeticióned para confirmar el resultado. </li></ol>

<ol><li>Moscona, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuraminidase+inhibitors+for+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22N.Engl.J.Med%22%5BJournal%5D)">Neuraminidase inhibitors for influenza.</a> N.Engl.J.Med. 353 (13), 1363-1373 (2005).</li>
<li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19132915">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 132, 178-185 (2016).</li>
<li>Meijer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 110, 31-41 (2014).</li>
<li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+update+on+the+susceptibility+of+human+influenza+viruses+to+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Res%22%5BJournal%5D)">Global update on the susceptibility of human influenza viruses to neuraminidase inhibitors.</a> Antiviral Res. 117, 27-38 (2015).</li>
<li>Lackenby, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistance+to+oseltamivir+among+influenza+A%28H1N1%29+viruses+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Euro+Surveill%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistance to oseltamivir among influenza A(H1N1) viruses in Europe.</a> Euro Surveill. 13 (5), (2008).</li>
<li>Hurt, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+transmission+of+oseltamivir-resistant+A%28H1N1%29pdm09+influenza%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Community transmission of oseltamivir-resistant A(H1N1)pdm09 influenza.</a> N Engl J Med. 365 (26), 2541-2542 (2011).</li>
<li>Takashita, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+large+cluster+of+influenza+A%28H1N1%29pdm09+viruses+cross-resistant+to+oseltamivir+and+peramivir+during+the+2013-2014+influenza+season+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Characterization of a large cluster of influenza A(H1N1)pdm09 viruses cross-resistant to oseltamivir and peramivir during the 2013-2014 influenza season in Japan.</a> Antimicrob Agents Chemother. 59 (5), 2607-2617 (2015).</li>
<li>Eisfeld, A. J., Neumann, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influenza+A+virus+isolation%2C+culture+and+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Influenza A virus isolation, culture and identification.</a> Nat Protoc. 9 (11), 2663-2681 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meetings+of+the+WHO+working+group+on+surveillance+of+influenza+antiviral+susceptibility+-+Geneva%2C+November+2011+and+June+2012%5BTitle%5D)+AND+%22Wkly+Epidemiol+Rec%22%5BJournal%5D)">Meetings of the WHO working group on surveillance of influenza antiviral susceptibility - Geneva, November 2011 and June 2012.</a> Wkly Epidemiol Rec. 87 (39), 369-374 (2012).</li>
<li>A summary of amino acid substitutions in the influenza neuraminidase associated with resistance or reduced susceptibility to NAIs. WHO. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1">http://www.who.int/influenza/gisrs_laboratory/antiviral_susceptibility/avwg2014_nai_substitution_table.pdf?ua=1</a> (2016).</li>
<li>Okomo-Adhiambo, M., Hurt, A. C., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemiluminescent+neuraminidase+inhibition+assay%3A+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The chemiluminescent neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 95-113 (2012).</li>
<li>Hurt, A. C., Okomo-Adhiambo, M., Gubareva, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fluorescence+neuraminidase+inhibition+assay%3A+a+functional+method+for+detection+of+influenza+virus+resistance+to+the+neuraminidase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The fluorescence neuraminidase inhibition assay: a functional method for detection of influenza virus resistance to the neuraminidase inhibitors.</a> Methods Mol Biol. 865, 115-125 (2012).</li>
<li>Analysis of IC50 data. isirv Antiviral Group (isirv-AVG). , Available from:
 <a target="_blank" href="https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data">https://isirv.org/site/index.php/methodology/analysis-of-ic50-data</a> (2016).</li>
<li>Sleeman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R292K+substitution+and+drug+susceptibility+of+influenza+A%28H7N9%29+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Emerg+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">R292K substitution and drug susceptibility of influenza A(H7N9) viruses.</a> Emerg Infect Dis. 19 (9), 1521-1524 (2013).</li>
<li>Gubareva, L. V., Robinson, M. J., Bethell, R. C., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytic+and+framework+mutations+in+the+neuraminidase+active+site+of+influenza+viruses+that+are+resistant+to+4-guanidino-Neu5Ac2en%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Catalytic and framework mutations in the neuraminidase active site of influenza viruses that are resistant to 4-guanidino-Neu5Ac2en.</a> J Virol. 71 (5), 3385-3390 (1997).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La supervisión global de la susceptibilidad del virus influenza a los inhibidores de NA actualmente está siendo realizado por una serie de laboratorios ya sea utilizando ensayos fluorescentes o de inhibición de NA quimioluminiscente 11, 12. El ensayo de fluorescencia se utiliza más comúnmente que el ensayo quimioluminiscente. Aunque ambos ensayos son robustos y reproducible, los valores de CI50 obtenidos a partir del ensayo basado en la fluorescencia son a menudo más alto que el ensayo basado en quimioluminiscencia, haciendo una comparación directa de los datos de los dos ensayos difíciles 13. Incluso con el uso del mismo protocolo, los datos generados de un laboratorio pueden variar de otro. Debido a estas variaciones entre los laboratorios, el Grupo de Trabajo de la OMS sobre Vigilancia de Influenza Antiviral Susceptibilidad produjo una guía para ayudar en las comparaciones entre laboratorios. En lugar de comparar los absolutos valores de CI50, este uso directrizcomparación sa basado en el IC 50 veces de diferencia a la mediana IC 50 de los virus de la gripe de NI ensayados en cada laboratorio particular. La capacidad de comparar los datos de los cinco centros de colaboración se ha traducido en la publicación anual de la gripe mundial de datos de susceptibilidad antiviral 2, 3, 4. La disponibilidad de la gran cantidad de datos de susceptibilidad de la influenza en el dominio público permite a los investigadores comparar IC 50 datos de los estudios con la generada en sus propios laboratorios. Otros ensayos de inhibición de NA que adoptan un concepto similar también están disponibles comercialmente. Estos kits comerciales que contienen reactivos listos para el uso (NA no inhibidores incluido) son igualmente reproducible. Sin embargo, la casa en ensayo de inhibición de NA es sustancialmente más barato que los kits comerciales, porque la mayoría de los reactivos puede ser hecho en casa encantidades más grandes y el sustrato Muñana, lo que hizo previamente el mayor costo del ensayo, ahora se pueden adquirir de diversas fuentes a precios competitivos. El costo de las pruebas de una cepa de la gripe por fármaco es de aproximadamente $ 1 (USD). Al Melbourne WHOCCRRI, se han realizado mejoras para el ensayo de inhibición de la casa NA después de la incorporación de una plataforma robótica para los componentes de manejo de líquidos del ensayo. Aparte de la preparación manual de diluciones de virus, la mayoría de los procedimientos se llevan a cabo usando el robot de manejo de líquidos. Esto no sólo reducir al mínimo la manipulación manual, pero también aumenta el número de ensayos que se pueden ejecutar en un día. Aunque el ensayo de inhibición de NA es muy resistente, hay una serie de pasos críticos que deben completarse con la atención adicional. En primer lugar, cualquier irregularidad en las concentraciones de inhibidor de NA pueden desplazar las curvas de inhibición y los valores IC 50; Por lo tanto, una cuidadosa atención debe serpagado en la preparación de las concentraciones de inhibidor de NA. En segundo lugar, los períodos de pipeteado y de incubación precisa precisos son cruciales para mantener resultados consistentes a través de ensayos; esto se puede lograr mediante el uso de pipetas y temporizadores calibrados. La inclusión de los virus de control en cada ensayo también permite la supervisión del rendimiento del ensayo de ensayo a ensayo y durante largos períodos de tiempo. En tercer lugar, debido a que la actividad de la enzima NA de los virus de la gripe estacional es óptima a pH 6,5, el pH correcto del tampón de ensayo es importante. Algunos informes han encontrado que el uso de condiciones más bajos de pH pueden mejora la identificación de variantes de la gripe, tales como la variante A (H7N9) que contiene la mutación R292K 14, 15. Sin embargo, la modificación del pH del tampón de ensayo se desplazará los valores de IC 50, y esto puede complicar la comparación de los datos dentro de los laboratorios y entre laboratorios. Otras modificaciones y solución de problemas que puede ser performed se enumeran en la Tabla 5. Los inhibidores de la NA son la única clase de antivirales aprobados que están actualmente eficaces contra los virus de influenza en circulación. Hasta que otras clases de antivirales estén disponibles para uso clínico, la vigilancia de la susceptibilidad antiviral del virus de la gripe circulantes se centrará en inhibidores de la NA solo. Debido a la simplicidad y reproducibilidad de los resultados, el uso del ensayo de inhibición de NA para evaluar la susceptibilidad del virus influenza a los inhibidores de NA continuará.

La hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) son los dos principales glicoproteínas de superficie de influenza virus A y B. HA se une al ácido siálico-galactosa de las glicoproteínas de la superficie celular o glicolípidos, mientras que la NA libera virus mediante la escisión del ácido siálico de la galactosa sobre la superficie celular 1. Los inhibidores de la NA son una clase de antivirales contra la influenza que fueron racionalmente diseñados para unirse fuertemente al sitio activo NA enzimática, lo que impide la liberación y la propagación de la progenie de virus. Oseltamivir y zanamivir son dos inhibidores de la NA que han sido aprobados en muchos países en todo el mundo para el tratamiento y profilaxis de la gripe. En los últimos años, dos inhibidores adicionales NA, peramivir y Laninamivir, han sido aprobados para su uso en un número limitado de países. Proyección de virus de la gripe para la susceptibilidad a inhibidores de NA y la identificación de mutaciones que confieren resistencia son importantes en la determinación y el control de la effectiveness de esta clase de antivirales. En los últimos 16 años, el ensayo de inhibición de NA basado en la fluorescencia ha sido realizada de forma rutinaria en el Centro Colaborador para Referencia e Investigación sobre la Gripe, Melbourne (Melbourne WHOCCRRI) para supervisar el cambio de tendencia de la susceptibilidad antiviral entre los virus de influenza circulante. Anualmente, más de 2.000 virus de la gripe se prueban para la susceptibilidad antiviral. En la mayoría de las temporadas de gripe,&gt; 98% de los virus son sensibles a los cuatro inhibidores de la NA 2, 3, 4, aunque durante la temporada hemisferio norte influenza 2007-2008, hubo un aumento en el número de ex virus estacionales A (H1N1) que habían reducido la susceptibilidad a oseltamivir 5. Este grupo de virus, que contenía el H275Y sustitución de aminoácidos NA, se extendió al resto del mundo a finales de 2008, haciendo inappropri oseltamivircomió a nivel mundial para el tratamiento de este virus. La gran mayoría de los virus influenza B, influenza A (H3N2) y la influenza A (H1N1) cepas pdm09 son susceptibles a oseltamivir, aunque grupos de comunidades de A (H1N1) variantes pdm09 que contienen el H275Y sustitución de aminoácidos NA que confiere oseltamivir reduce y susceptibilidad peramivir, se han reportado en diversas partes del mundo, 6, 7. Debido a la necesidad de un suficientemente alto título de virus, los especímenes clínicos (incluyendo los lavados nasales de los animales) se deben a pases en cultivo celular, ya sea o huevos de pollo antes de la prueba de susceptibilidad antiviral embrionados. El ensayo de inhibición de NA descrito en este artículo se puede dividir en tres secciones: La determinación de la gama lineal para el producto fluorescente 4-metilumbeliferona (4-MU) en un fluorómetro en particular Debido a las diferencias inherentes entre fluorómetros, tél intervalo lineal para el producto final fluorescente, 4-MU, y la unidad de fluorescencia relativa (RFU), necesita ser establecido. Una vez establecido el intervalo lineal para 4-MU, se selecciona la señal objetivo óptimo, a la que se ajusta la concentración de los virus de la gripe en el ensayo de actividad de NA. Una vez completado para un fluorómetro particular, esto no debería ser necesario repetir. La determinación de la actividad de NA de los virus El ensayo de actividad de NA es un ensayo simple que implica la adición de la 2 &#39;- (4-metilumbeliferil)-D- -α N ácido -acetylneuraminic (Munana) de sustrato a los virus diluido en serie. La cantidad de fluorescencia del producto final 4-MU generada a partir de la escisión de Munana por la NA se mide usando un fluorómetro. La dilución de virus apropiado para utilizar en el ensayo de inhibición de NA se selecciona mediante el trazado de unidades de fluorescencia frente a la dilución de virus. De la curva sigmoidal producido, el punto medio de la sección lineal debe corresponder ael intervalo lineal 4-MU del fluorómetro determina en el apartado 1 e informará a la concentración apropiada de virus para ser utilizado en la sección 3. La evaluación de la susceptibilidad del virus a los inhibidores de NA utilizando el ensayo de inhibición de NA Para evaluar la susceptibilidad de los virus a un inhibidor de NA en particular, los virus a la dilución determina en el apartado 2 se incuban con una gama de concentraciones de inhibidor de NA. Después de una incubación posterior con Munana, el 4-MU generada por virus no inhibidas se mide en RFU por el fluorómetro. El efecto inhibidor del inhibidor de NA sobre la actividad enzimática de NA de un virus se calcula de acuerdo a la concentración de inhibidor NA requerida para reducir el 50% de la actividad de NA, dada como un valor de CI50.

<table><tbody><tr><td>Virus de la influenza A y B</td><td>Cultivados en células MDCK u óvulos embrionados de 9 días libres de patógenos</td><td></td> específicos (SPF) Células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) ATCC PTA-6500 2-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MUNANA)&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosynth AG</td><td>M-5507</td><td></td></tr><tr><td>ácido 2-(4-metilumbeliferil)-a-D-N-acetilneuramínico (MUNANA)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8639</td><td></td></tr><tr><td>4-Metilumbelliferona (4-MU)</td><td>Sigma</td><td>M1381-25G</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-[N-morfolino]etanolónico (hidrato MES) (ácido libre)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M8250-250G</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio (Ca Cl2)&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem&nbsp;</td><td>127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Surfactant-Amps-NP-40 (solución al 10%)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>PIE28324</tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>482-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto&nbsp;</td><td>APS AJAX Finechem</td><td>214-2.5L GL</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo plano transparente de 96 pocillos</td><td>NUNC</td><td>456537</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo en U de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;</td><td></td><td></td>4650101</tr><tr><td>Bloque de pozos profundos de 8 canales</td><td>Productos de laboratorio del Pacífico</td><td>RES-MW8-HP</td><td></td></tr><tr><td>Placas de 96 pocillos de profundidad, pocillos cuadrados de 2,0 mL Productos de</td><td>laboratorio del Pacífico</td><td>P-2ML-SQ-C</td><td></td></tr><tr><td>Selladores de placas</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>236366</tr><tr><td>Sistema de filtro de vacío en la parte superior de la botella (membrana de celulosa (nitrato), tamaño de poro 0,2 &mu; m, área de membrana 33,2 cm2, capacidad de filtro 500 mL)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430758-12EA</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas monocanal (1 y micro; L - 1.000 y micro; L)</td> <td>Variedad de proveedores (p. ej. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas multicanal</td><td>Variedad de proveedores (p. ej. Eppendorf, Sartorius)</td><td>Pipeta electrónica y manual de 8 o 12 canales (5 - 1250 y micro; Volumen L)</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta (1 y micro; L - 1.250 y micro; L)</td> <td>Variedad de proveedores (p. ej. Eppendorf, Sartorius)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas desechables (10 mL y 25 mL)</td><td>Greiner Bio-one&nbsp;</td><td>P7740-200EA y P7865-200EA</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de pipetas</td><td>Eppendorf</td><td>4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga 50 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Tubos en estantería</td><td>Scientific Specialties, Inc.</td><td>1750-00</td><td></td></tr><tr><td>Fluorímetro con ajuste de longitud de onda de excitación de 355 nm y un ajuste de longitud de onda de emisión de 460 nm</td><td>Software TermoFisher Scientific</td><td>ASCENT FL 374</td><td></td></tr><tr><td>Ascent TermoFisher</td><td>Scientific</td><td>5185410CD</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora a 37 &deg; C</td><td>Lab Supply</td><td>Biocell 1000</td><td></td></tr><tr><td>Zanamivir</td><td>GlaxoSmithKline</td><td>Solicite directamente a la empresa</td><td></td></tr><tr><td>Carboxilato de oseltamivir</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Peramivir (BCX-1812)</td><td>BioCryst</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laninamivir (R-125489)</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; JASPR v1.2</td><td>División de Influenza en los CDC Atlanta, EE. UU.&nbsp;</td><td>Disponible gratuitamente bajo petición (fluantiviral@cdc.gov)</td><td></td></tr></tbody></table>

la neuraminidasa ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a el inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

Fluorescence-based Neuraminidase Inhibition Assay to Assess the Susceptibility of Influenza Viruses to The Neuraminidase Inhibitor Class of Antivirals

Los inhibidores de la neuraminidasa (NA) son la única clase de antivirales aprobados para el tratamiento y profilaxis de la gripe que son eficaces contra las cepas que circulan actualmente. Además de su uso en el tratamiento de la gripe estacional, los inhibidores de NA han sido almacenadas por un número de países para uso en el caso de una pandemia. Por tanto, es importante controlar la susceptibilidad de los virus circulantes de la gripe a esta clase de antivirales. Hay diferentes tipos de ensayos que se pueden utilizar para evaluar la susceptibilidad de los virus de la gripe a los inhibidores de la NA, pero los ensayos de inhibición de la enzima usando un sustrato fluorescente o un sustrato quimioluminiscente son los más ampliamente usado y recomendado. Este protocolo describe el uso de un ensayo basado en fluorescencia para evaluar la susceptibilidad del virus influenza a los inhibidores de NA. El ensayo se basa en la enzima NA escindir el 2 &#39;- (4-metilumbeliferil) -α-D- ácido -acetylneuraminic N (Munana) Sustrato para liberar el producto fluorescente 4-metilumbeliferona (4-MU). Por lo tanto, el efecto inhibidor de un inhibidor de NA en el virus de la gripe NA se determina basándose en la concentración del inhibidor de NA que se requiere para reducir el 50% de la actividad de NA, dada como un valor de CI50.

El uso de directrices normalizadas del Grupo de Trabajo de la OMS sobre Vigilancia de Influenza Antiviral Susceptibilidad 9, se informó de la susceptibilidad de los virus de la gripe a los inhibidores de la NA utilizando los términos inhibición normal (Ni), inhibición reducida (RI), y altamente reducido de inhibición (HRI) . Virus de NI son aquellos con valores de IC50 de menos de 10 veces en comparación con la mediana de referencia del IC 50 para virus de influenza A (o menos de 5 veces para el virus de influenza B). Virus de RI son aquellos con valores de CI50 entre 10 y 100 veces por encima de la mediana de referencia del IC 50 para los virus de influenza A (o de 5 y de 50 veces para la gripe B). Virus HRI son aquellos con valores de IC50 de 100 veces por encima de la mediana de referencia del IC 50 para virus de influenza A (o por encima de 50 veces para el virus de influenza B); véase la Tabla 2. CI50 para A (H1N1) pdm09, A (H3N2), y los virus B Yamagata / B Victoria se calculan y actualizan anualmente en el Melbourne WHOCCRRI para reflejar los cambios menores en los valores de IC50 de cepas de la gripe circulantes a los inhibidores de NA (Tabla 3). La mediana de los valores de IC50 en la influenza A (H1N1) virus pdm09 son casi los mismos en los cuatro inhibidores de la NA, pero el zanamivir mediana y Laninamivir valores de CI50 para los virus A (H3N2) son de 2 a 4 veces mayor en comparación con oseltamivir y peramivir valores de CI50 (Tabla 3). El oseltamivir mediana IC 50 valor de virus de influenza B es generalmente de 5 a 10 veces mayor que el zanamivir, peramivir, y Laninamivir valores de CI50 (Tabla 3). El ensayo de inhibición de NA es un ensayo fenotípico que no proporciona información sobre los cambios genéticos Associado con RI o HRI. Por lo tanto, es importante que el análisis genético se realiza después de la identificación de los virus con RI o HRI. Al Melbourne WHOCCRRI, el gen NA de variantes se analizó utilizando la secuenciación de Sanger y piro-secuenciación. Una lista representativa de sustituciones de aminoácidos que se pueden encontrar en el gen NA de los virus con variantes de RI y HRI se presenta en la Tabla 4. Una lista más extensa de sustituciones de aminoácidos que puede alterar NAI susceptibilidad también está disponible en el sitio web de la OMS 10. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig1.jpg" /> Figura 1: RFU frente a la concentración de 4-MU. (A) Curva estándar de RFU contra 4-MU concentración (M). La caja de puntos muestra el intervalo lineal de 4-MU para el fluorómetro. Las señales de fluorescencia por encima del rango lineal puede ser saturado, y por tanto, cualquier scambios en la fluorescencia de centros comerciales no pueden ser detectadas por el fluorímetro. (B) sección lineal Primer plano de la curva estándar de la figura 1a para la identificación de la &quot;señal objetivo óptimo.&quot; El fluorómetro en el Melbourne WHOCCRRI tiene un rango lineal de 2,5-40? M 4-MU y una señal objetivo óptimo de ~ 30? M 4-MU, que corresponde a ~ 1.500 RFU. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig2.jpg" /> Figura 2: Ejemplo de las curvas de actividad de NA de los virus de influenza. El valor medio de fondo de 50,61 RFU se ha restado de cada punto de dilución en las curvas de actividad de NA. Las flechas indican la dilución de virus apropiado para utilizar en el ensayo de inhibición de NA para cada virus. Para la preparación más fácilaración de diluciones de virus, se puede elegir para llevar a cabo una dilución 1/100 para VIRUS 3 en lugar de una dilución 1/96. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55570/55570fig3.jpg" /> Figura 3: disposición de la placa para la configuración del ensayo de inhibición de NA. Cada placa incluye la última columna, que actúa como un control negativo que no contiene virus pero tampón de ensayo solamente 1x (AB), inhibidor de NA, Munana, y solución de parada. NOTA: JASPR utiliza las lecturas de la columna 12 de cada placa para determinar la señal en blanco promedio se utiliza en el cálculo de los valores de CI50. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 4: Ejemplo de una curva de inhibición e IC 50 valor de una A (H1N1) virus pdm09, A / Perth / 82/2015. El software JASPR presenta la curva de inhibición como fluorescencia (RFU) en contra de la creciente concentración (nM) de inhibidor de NA, con cada ajuste punto dentro de la curva. Sobre la base de la curva de inhibición, el valor de IC 50 se determina como la concentración de inhibidor de NA para reducir el 50% de la actividad de NA de virus. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55570/55570fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Virus </td><td> dilución de virus requiere </td><td> 1x volumen de tampón de ensayo (l) </td><td> Tensioactivo-Amps-NP-40 (10%) (ml) </td><td> volumen Virus (mL) </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 1/20 </td><td> 940 </td><td> 10 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 1/40 </td><td> 965 </td><td> 10 </td><td> 25 </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 1/100 </td><td> 890 </td><td> 10 </td><td> 10 </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Preparación de diluciones de virus para el virus de 1, 2, y 3 en el ensayo de inhibición de NA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tipo de Virus / subtipo / linaje </td><td> la inhibición de la normalidad </td><td> la inhibición reducida </td><td> inhibición altamente reducida </td></tr><tr><td> (NI) </td><td> (RHODE ISLAND) </td><td> (HRI) </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> &lt;10 veces </td><td> 10-100 veces </td><td> &gt; 100 veces </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> y# 60; 10 veces </td><td> 10-100 veces </td><td> &gt; 100 veces </td></tr><tr><td> B Yamagata y B Victoria </td><td> &lt;5 veces </td><td> 5-50 veces </td><td> &gt; 50 veces </td></tr></tbody></table> Tabla 2: El Grupo de Trabajo antiviral directrices de la OMS recomienda para la clasificación de la susceptibilidad al virus de la gripe inhibidores de la NA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> Tipo de Virus / subtipo / linaje </td><td rowspan="2"> norte </td><td> zanamivir </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> La mediana (rango) IC 50 nM </td><td> La mediana (rango) IC 50 nM </td><td> La mediana (rango) IC 50 nM </td><td> La mediana (rango) IC 50 nM </td></tr><tr><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1326 </td><td> 0,42 (0,1 a 3,43) </td> &lt;td&gt; 0,36 (0,01 a 3,48) </td><td> 0,19 (0,07 a 1,60) </td><td> 0,55 (0,05 a 2,29) </td></tr><tr><td> A (H3N2) </td><td> 1654 </td><td> 0,9 (0,11 a 4,0) </td><td> 0,38 (0,01 a 3,65) </td><td> 0,33 (0,12 a 3,06) </td><td> 1,38 (0,01 a 9,38) </td></tr><tr><td> B Yamagata y B Victoria </td><td> 1115 </td><td> 2,2 (1,24 a 10,72) </td><td> 15,12 (2.39-70.75) </td><td> 1,36 (0,57 a 6,67) </td><td> 2,89 (1,62 a 9,15) </td></tr></tbody></table> Tabla 3: La mediana de IC 50 y IC 50 gama de inhibición normal (NI) los virus de 2015 derivó en la CCRIG de la OMS, Melbourne. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"> sustitución de aminoácido </td><td rowspan="2"> Tipo / subtipo / linaje </td><td colspan="4"> IC 50 veces de cambio compared para hacer referencia a la mediana de los valores de CI50. </td></tr><tr><td> zanamivir </td><td> oseltamivir </td><td> peramivir </td><td> Laninamivir </td></tr><tr><td> H275Y </td><td> A (H1N1) pdm09 </td><td> 1 </td><td> 557 (HRI) </td><td> 123 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> E119V </td><td> A (H3N2) </td><td> 1 </td><td> 63 (RI) </td><td> 1 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> H134Y </td><td> B Victoria </td><td> 1 </td><td> 4 </td><td> 76 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> N151T </td><td> B Victoria </td><td> 4 </td><td> 4 </td><td> 42 (HRI) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> G104E </td><td> B Victoria </td><td> 1220 (HRI) </td><td> 87 (HRI) </td><td> 17724 (HRI) </td><td> 701 (HRI) </td></tr><tr><td> E105K </td><td> B Victoria </td><td> 3 </td><td> 5 (RI) </td><td> 59 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> I222T </td><td> B Victoria </td><td> 2 </td><td> 7 (RI) </td><td> 8 (RI) </td><td> 3 </td></tr><tr><td> H273Y </td><td> B Yamagata </td><td> 1 </td><td> 230 (HRI) </td><td> 377 (HRI) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> D197N </td><td> B Yamagata </td><td> 4 </td><td> 7 (RI) </td><td> 32 (RI) </td><td> 3 </td></tr></tbody></table> Tabla 4: Lista representativa de sustituciones de aminoácidos unidos a la reducción de la inhibición (RI) o muy reducido de inhibición (HRI) a los inhibidores de NA. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Posibles razones) </td><td> Solución (s) </td></tr><tr><td rowspan="2"> No o baja actividad de NA </td><td> Ningún virus fue el rendimiento de virus presente o baja. </td><td> Espécimen clínicos deben ser cultivados en líneas celulares (es decir, células de riñón Madin-Darby Canine) o en huevos de gallina embrionadosa una carga de virus más alta para su uso en el ensayo de inhibición de NA. </td></tr><tr><td> Algunos virus mutantes tienen una actividad muy baja a pesar de NA a carga alta de virus. </td><td> Utilice concentración de virus ordenada para la prueba. Tampón de ensayo pH inferior (por ejemplo pH 5,3) puede ser utilizado. Sin embargo, se debe tener cuidado al comparar los datos. </td></tr><tr><td rowspan="3"> No o baja actividad de NA en ensayo de inhibición de NA </td><td> No se añadió el virus. </td><td> Vuelva a diluir el virus. Asegúrese de que el virus se añade directamente en el tampón de ensayo 1x. </td></tr><tr><td> se usó dilución de virus incorrecto. </td><td> Repetir el ensayo de actividad de NA. </td></tr><tr><td> tiempo de incubación insuficiente. </td><td> Asegúrese de que el tiempo de incubación es seguida. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Los puntos de datos caen fuera de la curva IC 50 </td><td rowspan="2"> La contaminación cruzada de inhibidor de NA de mayor concentración. </td><td> Asegúrese de que las puntas no están en contacto con la inhibi NAtor al dispensar virus diluido en la placa de 96 pocillos. </td></tr><tr><td> Si se ha utilizado un depósito 8 de pozo profundo, deseche y re-dispensar la NA concentraciones de inhibidor en un depósito de pozo profundo fresco 8. </td></tr><tr><td> El volumen del inhibidor de NA o Munana o virus diluido no se añadió igualmente en cada pocillo. </td><td> Repetir el ensayo con una pipeta multicanal calibrada. Asegúrese de un volumen igual de cada reactivo se dispensa en cada pocillo. </td></tr><tr><td rowspan="3"> Inusualmente altos valores de CI50 </td><td> se añadió demasiado alta concentración de virus. </td><td> Repetir el ensayo de actividad de NA y ensayo de inhibición de NA. </td></tr><tr><td> Muestra de ensayo contenía mezclas de influenza A e influenza B. </td><td> Realizar PCR en tiempo real para identificar la presencia de mezclas de virus. </td></tr><tr><td> La contaminación bacteriana en la muestra </td><td> virus Cultura en la condición estéril con la presencia de antibiótico. </td></tr><tr><td rowspan="2"> señal de fluorescencia de fondo alto </td><td> sustrato Munana puede degradarse con el tiempo. </td><td> Utilizar un nuevo lote de Muñana subtrate. </td></tr><tr><td> La detección de fluorescencia de los pozos vecinos. </td><td> Utilizar el negro placas de 96 pocillos de fondo plano </td></tr></tbody></table> Tabla 5: Solución de problemas para los problemas potenciales en el ensayo de inhibición de NA.

Se describe el uso de un ensayo de inhibición de la neuraminidasa basada en fluorescencia fenotípico para evaluar la susceptibilidad de los virus de influenza A y B a la clase de inhibidor de la neuraminidasa de los antivirales.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

The neuraminidase (NA) inhibitors are the only class of antivirals approved for the treatment and prophylaxis of influenza that are effective against ...

El objetivo general de esta metodología es evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza A y B frente a los inhibidores de la neuraminidasa mediante un ensayo basado en fluorescencia. Este método puede ayudar a determinar si un virus de la influenza es resistente o sensible a la clase de antivirales inhibidores de la neuraminidasa. El principio principal del ensayo consiste en observar si el antiviral inhibidor de la neuraminidasa bloquea la actividad enzimática de la neuraminidasa.Antes de realizar la prueba de susceptibilidad a antivirales, el virus debe cultivarse hasta alcanzar una alta titulación viral mediante pases en cultivos celulares, como las células MDCK, o en huevos de pollo embrionados. En esta demostración, utilizaré virus vivos de la influenza A de los subtipos H1N1 y H3N2. Comenzando con una placa de 96 pocillos con fondo en U, agregue 120 microlitros por pocillo de virus de influenza cultivados sin diluir en la columna uno.Y 60 microlitros de tampón de ensayo al 1x que contiene 0,1 % de NP40 en las 11 columnas restantes. Utilizando una pipeta multicanal, realice seriamente dos diluciones completas a través de la placa, dejando la columna 12 como blanco que contiene únicamente tampón de ensayo al 1x. Transfiera 50 microlitros de cada uno de los pocillos a una placa transparente de 96 pocillos con fondo plano.Añada 50 µL de MUNANA 300 µM por pocillo. Luego, golpee suavemente la placa para mezclar. A continuación, use un sellador de placas para cubrir la placa y prevenir la evaporación.Y incubar la placa a 37 grados Celsius durante una hora. Añadir 100 microlitros de solución de parada por pocillo para finalizar la reacción. Y agitar suavemente la placa para mezclar.Utilice un fluorómetro para leer la placa. Luego, después de trazar una gráfica de RFU frente a diluciones del virus según el protocolo descrito en el texto, determine la concentración adecuada de virus para evaluar la susceptibilidad viral a los inhibidores de la NA utilizando la señal objetivo óptima como punto de referencia, para seleccionar el punto medio de la sección lineal de las curvas de actividad de la NA del virus. Para preparar 300 micromolares en amivir, disuelva cinco miligramos de zanamivir en 50 mililitros de tampón de ensayo dos veces concentrado.Prepare oseltamivir carboxilato a 300 micromolares disolviendo 5,8 miligramos de oseltamivir carboxilato en 50 mililitros de tampón de ensayo dos veces. Disuelva 5,7 miligramos de peramivir trihidrato en 50 mililitros de tampón de ensayo dos veces para obtener una concentración stock de 300 micromolares. Luego prepare laninamivir a 300 micromolares disolviendo 5,2 miligramos en 50 mililitros de tampón de ensayo dos veces.A partir de los stocks maestros, prepare stocks de trabajo con diluciones de diez veces de los inhibidores de NA en tubos cónicos de 50 mililitros con las siguientes concentraciones. Se debe prestar atención al preparar la serie de concentraciones de los inhibidores de NA. Cualquier irregularidad en las concentraciones de los inhibidores de NA será evidente en las curvas de inhibición.Utilizando diluciones del virus basadas en la actividad de NA determinada anteriormente en este video, prepare dos mililitros de diluciones virales en un tampón de ensayo al uno por ciento que contenga el surfactante NP40 al 0,1 % en un bloque de placas de 96 pocillos profundos. Al diluir el virus, asegúrese de que se agregue directamente en el tampón de ensayo al uno por ciento. Esto es crucial especialmente cuando el volumen del virus es muy bajo.Dispense el volumen requerido de inhibidores de NA en un reservorio de ocho pocillos profundos. Luego dispense 50 microlitros de inhibidores de NA en diluciones que varían desde cero hasta 30.000 nanomoles. Añada 50 microlitros de virus de prueba diluidos por pocillo en las columnas uno a once.Y 50 microlitros por pocillo de tampón de ensayo al 1× a la columna 12. Agite suavemente la placa para mezclar y cúbrala para prevenir la evaporación. Incube luego la placa a temperatura ambiente durante 45 minutos.Después de la incubación, agregue 50 microlitros de MUNANA 300 micromolar a cada pocillo. Luego, golpee suavemente la placa para mezclar y tápela. Incube la placa a 37 grados Celsius durante una hora.Añada 100 microlitros de la solución de parada a cada pocillo. Luego tape suavemente la placa para mezclarla. A continuación, utilice un fluorómetro para leer la placa.Para calcular los valores de IC50, copie y pegue los datos brutos generados por el fluorímetro en una hoja de cálculo en un formato de placa de 12 columnas, comenzando por la celda A1. Abra el software de ajuste y haga clic en la pestaña de experimento. Seleccione Alternativa 2-fármacos Fluoro 11 Muestras. Haga clic en la pestaña de opciones y marque Generar gráficos.Haga clic en opciones nuevamente y seleccione la pestaña Nueva clave. Luego guarde el archivo SEV de la clave de inhibición en la misma carpeta que el archivo de hoja de cálculo de datos brutos. En el archivo clave_inhibicion, liste todos los nombres de las muestras debajo de ID. Si se probaron cuatro inhibidores de NA, inserte espacios para dos filas adicionales debajo de oseltamivir y escriba peramivir y laninamivir.Guarde los cambios realizados en el archivo inhibition_key. Regrese a la ventana Ajuste de Curva de Inhibición de jasprv1.2 y seleccione el archivo de datos brutos como archivo de experimento, y el inhibition_key como archivo clave.Realice el análisis. Luego, guarde los resultados en formatos CSV y PDF. Inspeccione los valores de IS50 y las formas de las curvas generadas por el software.Todos los puntos de datos deben caer sobre la curva o cerca de ella. Si no es así, repita el ensayo de inhibición de NA. Como se muestra en esta curva de inhibición, se representa la fluorescencia frente a la concentración creciente del inhibidor de NA para un virus A(H1N1)pdn09, A/Perth/82/2015.Se indica aquí la IC50. Se asigna un resultado de inhibición normal, inhibición reducida o inhibición altamente reducida a los virus de prueba comparando la IC50 con la mediana. Los valores de IC50 mediana deben obtenerse en cada laboratorio utilizando datos generados a partir de pruebas con virus que presenten inhibición normal.Y un ejemplo de valores medianos de IC50 determinados en el Centro Colaborador de la OMS para la Influenza en Melbourne para los tipos y subtipos respectivos. Para los virus de la influenza A, los virus con inhibición normal son aquellos con valores de IC50 menores a 10 veces en comparación con la mediana de referencia de IC50 para su subtipo respectivo. Los virus con inhibición reducida son aquellos con valores de IC50 entre 10 y 100 veces superiores a la mediana de referencia de IC50 para sus subtipos respectivos.Mientras que los virus con inhibición altamente reducida tienen valores de IC50 cien veces superiores a la IC50 mediana de referencia. Para los virus de la influenza B, los virus con inhibición normal presentan valores de IC50 menores a cinco veces en comparación con la IC50 mediana de referencia. Los virus con inhibición reducida se sitúan entre cinco y cincuenta veces, y los virus con inhibición reducida importante (HRI) tienen valores cincuenta veces superiores a la IC50 mediana de referencia.Esta tabla presenta una lista de sustituciones de aminoácidos en la NA que se han detectado durante los últimos cinco años y que confieren una inhibición reducida frente a los inhibidores de la neuraminidasa. El ensayo de inhibición de la NA basado en fluorescencia que se muestra en este video es un ensayo altamente robusto y reproducible. Después de ver este video y leer el protocolo, debería tener una comprensión clara de cómo determinar la sensibilidad de los virus de la influenza frente a la clase de antivirales inhibidores de la neuraminidasa.

fluorescence-based-neuraminidase-inhibition-assay-to-assess

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

El ensayo sialidasa es un enfoque simple técnica que dilucidar nuevo mecanismo molecular (s) de los sensores de TLR de las infecciones microbianas y la participación en las enfermedades inflamatorias a nivel del receptor en la superficie celular de los macrófagos en vivo.

Detección de actividad sialidasa Neu1 en la regulación de Toll-like receptor de activación

Un método sencillo slot blot fue desarrollado para la cuantificación de la hemaglutinina y la neuraminidasa viral de la gripe utilizando anticuerpos universales dirigidas a sus secuencias más conservadas identificados a través de análisis de la bioinformática. Este enfoque innovador puede ofrecer una alternativa útil para la determinación cuantitativa de todos los hemaglutinina y la neuraminidasa viral.

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Este método describe el uso de infrarrojos sistema colorante formación de imágenes basada para la detección de H1N1 en bronquioalveolar lavado (BAL) de líquidos de los ratones infectados en una alta sensibilidad. Esta metodología se puede realizar en un 96 - o 384-así placa, requiere &lt;10 l de volumen material de prueba y tiene el potencial para el cribado simultáneo de múltiples patógenos.

De alto rendimiento Método de detección de virus de la influenza

El video muestra un ensayo para cuantificar los virus de la influenza A y B. Este ensayo emplea la amplificación de endonucleasas con cebadores específicos para la influenza y la detección de objetivos mediante sondas de balizas moleculares.

Un ensayo molecular para cuantificar los virus de la influenza A y B

Este video muestra un ensayo que mide los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en una muestra de suero. Se añade una muestra de suero que contiene anticuerpos contra el NA a una placa de micropocillos recubierta de fetuina. Al agregar el virus, los anticuerpos evitan que el NA viral escinda la fetina y exponga su fracción de galactosa. A continuación, se añade una lectina conjugada con peroxidasa, que se une a la galactosa expuesta. El título de...

Un ensayo para medir los títulos de anticuerpos de inhibición de la neuraminidasa de la influenza

Utilizando una estrategia de microarrays de glicanos impresos, se miniaturizó un ensayo convencional de placa de 96 pocillos para analizar la avidez de hemaglutinina del virus de la influenza A y la especificidad de los receptores que contienen ácido siálico.

Un ensayo de microarrays miniaturizada glicanos para la evaluación de avidez y especificidad del virus de la gripe A Hemaglutininas

Se describe un ensayo rápido, a base de molecular Influenza A y B. El ensayo detecta la influenza cada objetivo en los 15 minutos mediante el empleo de amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. El ensayo de la gripe A y B es fácil de usar y requiere práctica en un mínimo de tiempo para llevar a cabo.

Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B

Describimos el ensayo de lectina ligado a enzimas (ELLA) para medir los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en sueros. El ensayo utiliza aglutinina de cacahuete para cuantificar los residuos de galactosa que se vuelven accesibles cuando la NA elimina el ácido siálico de las placas de 96 pocillos recubiertas de fetuina.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Este estudio describe una   -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

Anticuerpos neutralizantes de la gripe se correlacionan con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización medir anticuerpos neutralizantes en sueros humanos y se utilizan a menudo para serología humana de influenza. Se describe un ensayo de microneutralización con células MDCK-SIAT1 para medir títulos de anticuerpos neutralizantes a contemporáneos 3C.2a 3C.3a a (H3N2) virus y después de la vacunación contra la influenza o infección.

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

Aquí se informa un protocolo para la cuantificación de partículas virales infecciosas utilizando el monitoreo en tiempo real de la impedancia eléctrica de las células infectadas. Una aplicación práctica de este método se presenta mediante la cuantificación de la descomposición del virus de la influenza A bajo diferentes parámetros fisicoquímicos que imitan las condiciones ambientales.

Monitoreo de la supervivencia del virus de la influenza fuera del huésped mediante análisis celular en tiempo real

Aprenda a evaluar la susceptibilidad de virus influenza A y B a inhibidores de neuraminidasa mediante un ensayo fluorimétrico. Este método permite identificar cepas resistentes y calcular valores IC50 para guiar tratamientos antivirales efectivos.

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales (Video) | JoVE Journal

La neuraminidasa Ensayo de inhibición basado en la fluorescencia para evaluar la susceptibilidad de los virus de la influenza a El Inhibidor de la neuraminidasa clase de antivirales

Explorar más videos