Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un Bacillus -conservado Nucleótido Pirofosforilasa, BcMazG

El objetivo general de este procedimiento es preparar proteínas recombinantes a partir de bacterias no patógenas para facilitar los estudios biofísico-químicos, como la cristalografía de rayos X de proteínas o la cinética enzimática. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo preparar proteínas recombinantes de interés utilizando bacterias no patógenas para la caracterización biofísica preliminar. La principal ventaja de esta técnica es que la caracterización biofísica de proteínas de interés se puede realizar en cualquier laboratorio equipado con instrumentos comunes, como incubadoras de cultivos celulares y espectrofotómetros.

Para comenzar este procedimiento, prepare la reacción de ligadura como se describe en el protocolo de texto. Pipetear tres microlitros de la reacción de ligadura preparada en un tubo que contenga 50 microlitros de células alfa de E. coli DH5 químicamente competentes. Con una pipeta, mezcle suavemente la solución.

Congela la solución durante 30 minutos. A continuación, choque térmico durante 45 segundos a 42 grados centígrados. Después de esto, agregue un mililitro de medio LB y haga crecer las células mientras agita vigorosamente a 250 rotaciones por minuto, a 37 grados centígrados durante 45 minutos.

Extienda 100 microlitros de células transformadas en una placa de barrena LB suplementada con 100 microgramos por mililitro de kanamicina. Incubar durante 18 horas a 37 grados centígrados. Con una punta estéril, recoja las colonias del plato.

Cultive las células en tres mililitros de medio LB suplementado con agitación vigorosa a 250 rotaciones por minuto a 18 grados centígrados durante 18 horas. A continuación, prepare el ADN plasmático y confirme la secuencia de nucleótidos como se describe en el protocolo de texto. Después de retransformar la cepa de E. coli BL21, seleccione una colonia con una punta estéril e inocule 10 mililitros de medio LB que contenga 150 microgramos por mililitro de kanamicina.

Incubar a 37 grados centígrados durante 18 horas con agitación vigorosa a 250 rotaciones por minuto. A continuación, transfiera los 10 mililitros de cultivo durante la noche a un litro de medio LB y kanamicina. Crece a 37 grados centígrados hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcanza 0,7.

A continuación, sumerja el cultivo en agua helada durante 15 minutos. Agregue IPTG al cultivo, de modo que la concentración final sea de un milimolar. Incube a 18 grados centígrados durante 16 a 18 horas adicionales.

Después de esto, centrifugar a 5.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Retire con cuidado el sobrenadante. Resuspender las células en 50 microlitros de PBS que contienen 10 milimolares de imidazol.

A continuación, lise las células dos veces en hielo como se detalla en el protocolo de texto. Centrifugar a 25.000 veces G durante 30 minutos a cuatro grados centígrados para limpiar el lisado celular. Luego, mezcle tres mililitros de perlas de níquel y 47 mililitros de PBS que contienen 10 milimolares de imidazol en un tubo cónico de 50 mililitros.

Flujo por gravedad: el tampón adicional para asentar las perlas equilibradas en una columna de cromatografía de vidrio de 2,5 por 10 centímetros. Con una pipeta, transfiera el sobrenadante a la columna. Incubar a cuatro grados centígrados durante dos horas en una rueda giratoria a 20 rotaciones por minuto.

Después de esto, permita que el sobrenadante se drene por gravedad. Lave las perlas de níquel tres veces con 100 mililitros de PBS que contenga 10 milimolares de imidazol para cada lavado. A continuación, aplique cinco mililitros de PBS que contengan 250 milimolares de imidazol para eluir la proteína RBC 1531.

Analice 15 microlitros de la elución a través de SDS Page como se describe en el protocolo de texto. Pipetear las fracciones recolectadas en un tubo de diálisis. Coloque el tubo en un vaso de precipitados que contenga cuatro litros de tampón compatible con la escisión de la trombina a cuatro grados centígrados durante la noche.

Al día siguiente, use una pipeta para transferir las fracciones a un tubo cónico de 15 mililitros. Mida la absorbancia a 280 nanómetros para estimar la concentración de proteínas como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera 50 microlitros de proteína RBC 1531 a varios tubos.

Agregue una cantidad diferente de trombina a cada tubo e incube a 20 grados centígrados durante tres horas. Después de determinar la cantidad mínima de trombina necesaria, agregue 10 miligramos de proteína y 60 unidades de trombina a un tubo de 15 mililitros. Incubar a 20 grados centígrados durante tres horas.

A continuación, transfiera la proteína digerida por la trombina a un tubo de filtro centrífugo. Centrifugar a 3.000 veces G a cuatro grados centígrados para reducir el volumen a menos de cinco mililitros. Después de esto, aplique la proteína concentrada a una columna de cromatografía de exclusión de tamaño preparada.

Recoge 60 fracciones de eluto con 0,5 mililitros por tubo. Ejecute 15 microlitros de cada fracción en un gel de página 15%SDS como se describe en el protocolo de texto. A continuación, combine las fracciones que contienen la proteína RBC 1531.

Para comenzar, transfiera las fracciones combinadas a un tubo de filtro centrífugo. Centrifugar a 3.000 veces G a cuatro grados centígrados para concentrar la proteína a aproximadamente 18,5 miligramos por mililitro. A continuación, agregue 50 microlitros de cada solución de cribado de cristalización a los pocillos de una placa de cristalización de gota de 96 pocillos.

Agregue 0,5 microlitros de la solución de proteína concentrada en una cama para sentarse. Mezcle por separado la solución de proteínas con 0,5 microlitros de la solución de pocillo. Cubra la placa con una película adhesiva transparente.

Incubar a 18 grados centígrados y permitir la difusión del vapor. Con un microscopio óptico, escanee las gotas con un aumento de 20 a 40 veces para controlar la formación de cristales diariamente durante dos o tres semanas. Después de preparar los sustratos NTP, agregue cada uno a una placa de 96 pocillos.

Agregue 20 microgramos de proteína RBC 1531 a cada pocillo usando una pipeta para mezclar. Cubra la placa con su tapa e incube a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, transfiera la placa a un baño de agua a 70 grados Celsius durante 15 minutos para detener las reacciones catalíticas mediadas por RBC 1531.

A continuación, agregue un microlitro de pirofosfatasa inorgánica S. cerevisiae a cada pocillo. Incubar a 20 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue 16 microlitros de solución de ácido de molibdato a la placa de reacción para desarrollar el color.

Después de 15 minutos, lea la densidad óptica a 690 nanómetros. En este estudio se caracteriza a nivel molecular el producto proteico del gen B grave BC1531. Después de la purificación por cromatografía de afinidad de níquel, se realiza una estela de digestión de trombina.

Se considera que 0,3 unidades de trombina es la cantidad mínima necesaria para eliminar por completo la etiqueta de afinidad de RBC 1531. Después de la digestión, la proteína libre de etiquetas se purifica hasta aproximadamente el 99% de pureza, utilizando cromatografía de exclusión por tamaño. A continuación, se estima el estado oligomérico mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Debido a que RBC 1531 se eluye a aproximadamente 84 mililitros, su peso molecular se estima en 55 kilodaltons. El peso molecular calculado del monómero es de unos 13 kilodaltons. Por lo tanto, RBC 1531 se ensambla como un tetrámero.

A continuación, se realiza el cribado de cristalización utilizando un método de difusión de vapor de gota sentada. Los cristales se ven después de dos días con un molar de citrato de sodio y 20% de polietilenglicol 3.000, y con 0,1 molares de cacodilato de sodio y un molar de citrato de sodio. Después de esto, se determina la actividad de NTPasa.

No se observa ningún cambio de color visible después de agregar molibdato a la reacción de hidrólisis mediada por RBC 1531. Sin embargo, cuando se agrega pirofosfatasa, se observa que el color cambia a azul profundo. La densidad óptica a 690 nanómetros y la concentración de NTP se analizan mediante regresión no lineal.

Se determina que la enzima RBC 1531 tiene una velocidad máxima de 0,75 y una constante de Michaelis de 10 micromolares. Al intentar este procedimiento, es importante preparar muestras de proteínas sin demora y descartar las fracciones que contengan impurezas que impidan la cristalización de proteínas o introduzcan errores en los ensayos enzimáticos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enzimología y otras ciencias de las proteínas caracterizaran las proteínas de interés con espectrofotómetros que se decoran en la mayoría de los laboratorios.

Aunque este método puede proporcionar información sobre las ideas generales de la preparación de proteínas recombinantes, los filtros de cristalización y la cinética enzimática, también se puede aplicar al análisis biofísico químico de otras proteínas de nuestro interés. No olvide tener cuidado al trabajar con proteínas, ya que pueden ser extremadamente inestables. Será deseable tomar precauciones como dejar las muestras sobre el hielo y refrigerarlas a 80 grados para su almacenamiento a largo plazo.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo preparar proteínas recombinantes a partir de bacterias no patógenas para obtener cristales de proteínas para una determinación de la estructura mediante cristalografía de rayos X y cómo caracterizar la actividad enzimática utilizando un método colorimétrico.