Expresión de Proteínas Recombinantes, Cristalización y Estudios Biofísicos de un

El objetivo general de este procedimiento es preparar proteínas recombinantes a partir de bacterias no patógenas para facilitar estudios químicos y biofísicos, como la cristalografía de proteínas por rayos X o la cinética enzimática. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre cómo preparar la proteína recombinante de interés utilizando bacterias no patógenas para su caracterización biofísica preliminar. La principal ventaja de esta técnica es que la caracterización biofísica de la proteína de interés puede realizarse en cualquier laboratorio equipado con instrumentos comunes, como incubadoras para cultivo celular y espectrofotómetros.

Para comenzar este procedimiento, prepare la reacción de ligación según se describe en el protocolo escrito. Pipete tres microlitros de la reacción de ligación preparada en un tubo que contenga 50 microlitros de células de E.coli DH5 alpha químicamente competentes. Usando una pipeta, mezcle suavemente la solución.

Enfríe la solución en hielo durante 30 minutos. A continuación, aplique un choque térmico durante 45 segundos a 42 grados Celsius. Después de esto, agregue un mililitro de medio LB y cultive las células agitando vigorosamente a 250 rotaciones por minuto, a 37 grados Celsius durante 45 minutos.

Extender 100 microlitros de células transformadas sobre una placa de agar LB suplementada con 100 microgramos por mililitro de kanamicina. Incubar durante 18 horas a 37 grados Celsius. Usando una punta estéril, seleccionar colonias de la placa.

Cultive las células en tres mililitros de medio LB suplementado con agitación vigorosa a 250 rotaciones por minuto a 18 grados Celsius durante 18 horas. Luego, prepare el ADN plasmídico y confirme la secuencia de nucleótidos según se describe en el protocolo del texto. Después de retransformar la cepa E.coli BL21, seleccione una colonia utilizando una punta estéril e inocule 10 mililitros de medio LB que contenga kanamicina a 150 microgramos por mililitro.

Incubar a 37 grados Celsius durante 18 horas con agitación vigorosa a 250 rotaciones por minuto. A continuación, transferir los 10 mililitros de cultivo nocturno a un litro de medio LB con kanamicina. Incubar a 37 grados Celsius hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance 0,7.

Luego, sumerja el cultivo en agua helada durante 15 minutos. Añada IPTG al cultivo, de modo que la concentración final sea de un milimolar. Incube a 18 grados Celsius durante 16 a 18 horas adicionales.

Después de esto, centrifugue a 5.000 × g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Retire cuidadosamente el sobrenadante. Reuspenda las células en 50 microlitros de PBS que contenga 10 milimolares de imidazol.

A continuación, lise las células dos veces en hielo según se describe en el protocolo escrito. Centrifugue a 25.000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius para clarificar el lisado celular. Luego, mezcle tres mililitros de perlas de níquel y 47 mililitros de PBS que contienen 10 milimolares de imidazol en un tubo cónico de 50 mililitros.

Deje escurrir por gravedad el tampón sobrante para asentar las perlas equilibradas en una columna de cromatografía de vidrio de 2,5 por 10 centímetros. Mediante una pipeta, transfiera el sobrenadante a la columna. Incube a cuatro grados Celsius durante dos horas en una rueda giratoria a 20 rotaciones por minuto.

Después de esto, permita que el sobrenadante drene por gravedad. Lave las perlas de níquel tres veces utilizando 100 mililitros de PBS que contenga 10 milimolar de imidazol para cada lavado. Luego, aplique cinco mililitros de PBS que contenga 250 milimolar de imidazol para eluir la proteína RBC 1531.

Analice 15 microlitros de la elución mediante SDS Page según se describe en el protocolo del texto. Pipetee las fracciones recolectadas en un tubo de diálisis. Coloque el tubo en un vaso que contenga cuatro litros de tampón compatible con la escisión por trombina a cuatro grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, utilice una pipeta para transferir las fracciones a un tubo cónico de 15 mililitros. Mida la absorbancia a 280 nanómetros para estimar la concentración de proteína según se indica en el protocolo escrito. A continuación, transfiera 50 microlitros de la proteína RBC 1531 a varios tubos.

Agregue una cantidad diferente de trombina a cada tubo e incube a 20 grados Celsius durante tres horas. Después de determinar la cantidad mínima de trombina necesaria, agregue 10 miligramos de proteína y 60 unidades de trombina a un tubo de 15 mililitros. Incube a 20 grados Celsius durante tres horas.

A continuación, transfiera la proteína digerida con trombina a un tubo de filtro centrífugo. Centrifugue a 3.000 × g a cuatro grados Celsius para reducir el volumen a menos de cinco mililitros. Después de esto, aplique la proteína concentrada a una columna de cromatografía de exclusión por tamaño preparada previamente.

Recoger 60 fracciones de elución con 0,5 mililitros por tubo. Correr 15 microlitros de cada fracción en un gel de SDS-PAGE al 15 % según se describe en el protocolo del texto. Luego, combinar las fracciones que contienen la proteína RBC 1531.

Para comenzar, transfiera las fracciones combinadas a un tubo de filtro centrífugo. Centrifugue a 3.000 × g a cuatro grados Celsius para concentrar la proteína a aproximadamente 18,5 miligramos por mililitro. A continuación, agregue 50 microlitros de cada solución de cribado de cristalización a los pocillos de una placa de cristalización de gota suspendida de 96 pocillos.

Agregue 0,5 microlitros de la solución concentrada de proteína sobre un lecho en reposo. Mezcle por separado la solución de proteína con 0,5 microlitros de la solución del pozo. Cubra la placa con una película adhesiva transparente.

Incube a 18 grados Celsius y permita la difusión por vapor. Utilizando un microscopio de luz, examine las gotas con un aumento de 20 a 40 veces para monitorear diariamente la formación de cristales durante dos o tres semanas. Después de preparar los sustratos de NTP, añada cada uno a una placa de 96 pozos.

Agregue 20 microgramos de la proteína RBC 1531 a cada pocillo utilizando una pipeta para mezclar. Cubra la placa con su tapa e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de esto, transfiera la placa a un baño de agua a 70 grados Celsius durante 15 minutos para detener las reacciones catalíticas mediadas por RBC 1531.

A continuación, agregue un microlitro de pirofosfatasa inorgánica de S.cerevisiae a cada pocillo. Incube a 20 grados Celsius durante 30 minutos. Luego agregue 16 microlitros de solución de ácido molibdico a la placa de reacción para desarrollar el color.

Después de 15 minutos, lea la densidad óptica a 690 nanómetros. En este estudio, el producto proteico del gen B serious BC1531 se caracteriza a nivel molecular. Después de la purificación mediante cromatografía de afinidad por níquel, se realiza un ensayo de digestión con trombina.

Se observa que 0.3 unidades de trombina son la cantidad mínima necesaria para eliminar completamente la etiqueta de afinidad de RBC 1531. Después de la digestión, la proteína libre de etiqueta se purifica hasta una pureza aproximada del 99 % mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Luego, se estima el estado oligomérico mediante cromatografía de exclusión por tamaño.

Dado que RBC 1531 se eluye a aproximadamente 84 mililitros, su peso molecular se estima en 55 kilodaltons. El peso molecular calculado del monómero es de unos 13 kilodaltons. Por lo tanto, RBC 1531 se ensambla como un tetrámero.

Posteriormente se realiza una cribado de cristalización utilizando un método de difusión de vapor en gota sentada. Se observan cristales después de dos días con citrato sódico un molar y polietilenglicol 3,000 al 20%, y con cacodilato sódico 0,1 molar y citrato sódico un molar. Tras esto, se determina la actividad NTPasa.

No se observa un cambio de color visible después de agregar molibdato a la reacción de hidrólisis mediada por RBC 1531. Sin embargo, cuando se agrega pirofosfatasa, se observa un cambio de color a azul intenso. Luego, la densidad óptica a 690 nanómetros y la concentración de NTP se analizan mediante regresión no lineal.

Se determinó que la enzima RBC 1531 tiene una velocidad máxima de 0,75 y una constante de Michaelis de 10 micromolar. Al realizar este procedimiento, es importante preparar las muestras de proteínas sin demora y descartar las fracciones que contengan impurezas que puedan interferir con la cristalización de proteínas o introducir errores en los ensayos enzimáticos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la enzimología y otras ciencias de proteínas caracterizaran proteínas de interés mediante espectrofotómetros que se encuentran en la mayoría de los laboratorios.

Aunque este método puede proporcionar información sobre conceptos generales de preparación de proteínas recombinantes, cribados de cristalización y cinética enzimática, también puede aplicarse al análisis químico biofísico de otras proteínas de nuestro interés. No olvide tener cuidado al trabajar con proteínas, ya que pueden ser extremadamente inestables. Serán deseables precauciones como mantener las muestras sobre hielo y refrigerarlas a 80 grados para almacenamiento a largo plazo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar proteínas recombinantes a partir de bacterias no patógenas para obtener cristales de proteína destinados a la determinación de estructuras mediante cristalografía de rayos X, y de cómo caracterizar la actividad enzimática utilizando un método colorimétrico.