Preparación y caracterización de nuevas nanopartículas que imitan las HDL para la encapsulación del factor de crecimiento nervioso

El objetivo general de este artículo es presentar los métodos de preparación y caracterización de nanopartículas que imitan a las lipoproteínas de alta densidad cargadas con factor de crecimiento nervioso. Se utilizó una homogenización sencilla para preparar nanopartículas normales que imitan a las lipoproteínas de alta densidad. El procedimiento es simple y fácil de escalar.

Además, la nanopartícula mejoró considerablemente la eficiencia de encapsulación, así como la de NGF y APOA1 en las nanopartículas. Se superaron diversos desafíos para caracterizar una nanopartícula, incluyendo la separación de NGF no cargado de las nanopartículas de NGF, la realización de estudios fiables de radio in vitro y la evaluación de la biodisponibilidad de las nanopartículas de NGF. Para comenzar, mezcle 10 microlitros de NGF con 10 microlitros de protamina USP en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y déjelo reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente para formar el complejo.

A continuación, agregue 59 microlitros de fosfatidilcolina y 11 microlitros de esfingomielina a un vial de vidrio. También agregue 4 microlitros de fosfatidilserina, 15 microlitros de oleato de colesterol y 45 microlitros de succinato de tocoferilo polietilenglicol. Mezcle y evapore el etanol bajo una corriente suave de nitrógeno durante aproximadamente cinco minutos.

Todos los excipientes deben formar una película delgada oleosa en el fondo del vial de vidrio. Añada un mililitro de agua ultrapura al vial y homogenice a 9.500 rpm durante cinco minutos a temperatura ambiente para formar las nanopartículas prototipo, o NP. Luego, añada el complejo preparado a las NP prototipo.

Incube la suspensión a 37 grados Celsius durante 30 minutos con agitación, utilizando una pequeña barra de agitación en el vial de vidrio. Enfríe las NP agitando a temperatura ambiente durante otros 30 minutos. Después del enfriamiento, agregue 106 microlitros de apolipoproteína A-1 y agite a temperatura ambiente durante la noche para formar las NP finales de HDL que imitan la NGF.

Mida el tamaño de las partículas y el potencial zeta utilizando un analizador de partículas según las instrucciones del fabricante. Se utiliza una columna cromatográfica de filtración en gel reticulada para separar el NGF no encapsulado de las nanopartículas que imitan las HDL con NGF y determinar la eficiencia de encapsulamiento del NGF. Para la preparación de la columna, transfiera 15 mililitros de suspensión de sepharosa 4B CL a un vaso de precipitados de 50 mililitros.

Agite la suspensión de perlas y vierta una cantidad en una columna. Dele ligeros golpes suaves a la columna para eliminar las burbujas. Permita que el disolvente escurra y que las perlas se sedimenten durante unos minutos.

Continúe agregando la suspensión restante. Enjuague la pared interna de la columna para limpiar las perlas. Drene el disolvente hasta que el nivel del disolvente esté ligeramente por encima de la parte superior de la fase estacionaria.

A continuación, lave y equilibre la columna con 20 mililitros de solución salina tamponada con fosfato 1X. Para medir la eficiencia de atrapamiento del NGF, cargue 200 microlitros de NPs que imitan las HDL con NGF en la columna y eluya con PBS 1X. Como antes, recoja un total de 12 fracciones de un mililitro cada una.

Pretender ocho tubos de diálisis siguiendo las instrucciones del fabricante. Añadir 30 mililitros de medio de liberación a un tubo cónico de 50 mililitros. A continuación, calentarlo hasta 37 grados Celsius en un agitador con una velocidad de agitación de 135 rpm.

Cierre el tubo de diálisis y colóquelo en el medio de liberación. Retire rápidamente 100 microlitros del medio de liberación desde el exterior del tubo de diálisis como muestra para el tiempo cero. Coloque inmediatamente la muestra a menos 20 grados Celsius para su análisis posterior.

Añada 100 microlitros de medio de liberación fresco al tubo de centrífuga para reemplazar la muestra retirada. Luego, inicie el cronómetro. A las 1, 2, 4, 6, 8, 24, 48 y 72 horas, retire 100 microlitros del medio de liberación y reemplácelos con 100 microlitros de medio fresco.

Coloque inmediatamente las muestras extraídas a menos 20 grados Celsius para su análisis posterior. Después de una homogeneización de tres minutos, se obtuvieron tamaños de partículas consistentes para las nanopartículas prototípicas. Las nanopartículas finales de NGF tuvieron un tamaño de partícula de 170 nanómetros con una distribución de tamaños estrecha y monodispersa.

El NGF sin carga y las nanopartículas se separaron completamente en la columna de filtración en gel. Las nanopartículas se eluyeron en las fracciones dos a cuatro. La medición mediante ELISA indicó que el NGF libre se eluyó en la fracción 7 a la fracción 10.

La eficiencia de encapsulación calculada para el NGF fue aproximadamente del 66 %. Aquí se muestra la liberación in vitro de nanopartículas de NGF. Al agregar PBS y BSA al medio de liberación, el NGF libre atravesó la membrana de diálisis con una recuperación superior al 85 %. Por el contrario, las nanopartículas de NGF mostraron un perfil de liberación lenta, con alrededor del 10 % del NGF liberado de las nanopartículas durante 72 horas. Las nanopartículas de NGF estimularon el crecimiento de neuritas en células PC12 en un grado similar al del NGF libre.

El crecimiento de neuritas se observó claramente al microscopio para ambos grupos cuando se administraron 50 nanogramos por mililitro. Las nanopartículas de NGF aumentaron considerablemente la concentración plasmática y disminuyeron la captación de NGF en el hígado, riñón y bazo de los ratones. Las nanopartículas que imitan las HDL ayudaron al NGF, permitiendo una semivida prolongada en la estabilidad in vivo.

Una vez dominado, se pueden preparar nanopartículas monodispersas en tres minutos utilizando un método de homogenización, siempre que se realice adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar una corriente suave de nitrógeno para evaporar el disolvente y asegurarse de que no quede ningún residuo lipídico adherido a la pared del recipiente después de la homogenización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo elaborar nanopartículas que imitan las HDL utilizando un método de homogenización y cómo caracterizar las nanopartículas cargadas con NGF.