Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

El objetivo general de aislar gotas de lípidos para la espectrometría de masas cuantitativa es comprender la función de estos orgánulos, por ejemplo, en la replicación de patógenos como el virus de la hepatitis C. Este método puede responder a preguntas clave en el campo de las enfermedades infecciosas, como por qué los patógenos se unen a las gotitas para replicarse. El aislamiento de las gotas de lípidos se puede realizar en seis o siete horas.

Y durante este procedimiento, es importante evitar la contaminación de la queratina. Para comenzar, retire 50 mililitros de cada frasco de medio DMEM y agregue 50 mililitros de suero de ternera fetal dializado. A continuación, disuelva 50 miligramos de lisina marcada con carbono 13 y 50 miligramos de arginina marcada con carbono 13 en un mililitro de medio.

Mezcle bien y agregue los aminoácidos al medio DMEM más FCS. A continuación, añada PenStrep y sustituto de glutamina. Filtre el medio estéril con un filtro de 0,45 micras y etiquete el frasco como medio SILAC pesado.

Para preparar el medio ligero, repita estos pasos usando 50 miligramos de arginina y 50 miligramos de lisina. Etiquete el frasco como medio SILAC ligero. Tripsinar las células y dividirlas en dos pocillos de una placa de cultivo de seis pocillos.

Un pocillo debe contener dos mililitros del medio SILAC pesado y el otro, dos mililitros del medio SILAC ligero. Cultive las células durante al menos seis pasajes. Después de seis pasajes, la incorporación de los aminoácidos pesados debe ser más del 95%Coseche un millón de células de las poblaciones celulares marcadas pesadas y ligeras para analizar la eficacia de la incorporación.

Después del lavado de las células en 1X PBS, peléquelas por centrifugación durante cinco minutos a 160 veces g y cuatro grados centígrados. Vuelva a suspender los gránulos de celda en 150 microlitros de tampón MS. A continuación, incuba las células en hielo durante 30 minutos.

A continuación, lisar las células por sonicación a cuatro grados centígrados. Retire los restos celulares por centrifugación durante 10 minutos a 11.000 veces g y cuatro grados centígrados. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo y determine la concentración de proteínas con un ensayo de proteínas compatible con detergentes.

A continuación, mezcle 75 microgramos de proteína con seis tampones de muestra. Después de hervir a 95 grados centígrados durante cinco minutos, separe las proteínas por SDS-PAGE en el tampón de funcionamiento SDS a 180 pernos durante aproximadamente una hora. Después de la tinción de Coomassie, extirpar la misma banda de proteínas y analizar la eficacia de la incorporación mediante análisis de MS.

Infectar la población ligera de células con el virus reportero de la hepatitis C incubándolas con reservas fibrosas durante cuatro horas a 37 grados centígrados. Amplíe las células ligeras infectadas por el VHC y las células pesadas no infectadas, tal como se describe en el protocolo de texto. Si usa una cepa de VHC que porta un gen de resistencia a la blasticidina, agregue 10 microgramos por mililitro de blasticidina S al medio claro para seleccionar las células positivas para el VHC.

Un día antes del aislamiento de las gotas de lípidos, lavar las células con PBS, probar y volver a suspender en el medio ligero o pesado correspondiente. Cuente las células utilizando una cámara de recuento de Neubauer. Luego, siembre siete millones de células de cada población en una placa de cultivo celular de 150 centímetros cuadrados.

Prepare al menos cinco platos por población de células ligeras y pesadas. Cultive las células en 30 mililitros de medio por placa durante la noche. Al día siguiente, retire el medio y lave las células en 1X PBS.

Separe las celdas en 1X PBS usando un raspador de celdas. Después de contar ambas poblaciones de células como antes, extraiga números iguales de células en tubos de centrífuga de 50 mililitros. Granular las células por centrifugación durante cinco minutos a 160 veces g y cuatro grados centígrados.

Retire el PBS y vuelva a suspender el pellet de celda en un mililitro de tampón de sacarosa. Transfiera la suspensión de celdas a un homogeneizador de onzas ajustado antes de lisar las celdas con 200 golpes en hielo. A continuación, transfiera el lisado a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros y centrifuga los núcleos y los restos celulares durante 10 minutos a 1.000 veces g y cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, almacene una alícuota de 25 microlitros de la fracción postnuclear, o PNS, a menos 20 grados Celsius como control de entrada. Coloque el resto de la fracción PNS en el fondo del tubo de centrífuga y cúbralo con aproximadamente tres mililitros del tampón de lavado de gotas de lípidos. Centrifugar durante dos horas a 100.000 veces g y cuatro grados centígrados.

Después de la centrifugación, recoja la fracción de gotas lipídicas flotantes de la parte superior del tubo con una cánula roma doblada. Luego, coloque la fracción de gotas de lípidos en un tubo de centrífuga, cúbrala con tampón de lavado de gotas de lípidos y repita el paso de centrifugación. La recolección de las gotas de lípidos de la parte superior del gradiente requiere experiencia.

Y es más fácil cuanto más grande es la fracción. Puedes usar células grasas para practicar. O puede alimentar sus células con oleato para aumentar la cantidad de gotas de lípidos.

Una vez más, recoja la fracción de gota de lípidos flotante utilizando una cánula roma doblada de la parte superior del tubo. Transfiera las gotas de lípidos a un nuevo tubo de microfuga de 1,5 mililitros y agregue 500 microlitros de tampón de lavado de gotas de lípidos. A continuación, centrifugar la muestra durante 20 minutos a 21.000 veces g y cuatro grados centígrados.

Retire el tampón de lavado subyacente con una punta de pipeta de carga de gel y repita el paso de lavado tres veces. Después de la eliminación final del tampón de lavado, mezcle cinco microlitros de fracciones de gotas de lípidos con 10 microlitros de tampón de lisis NP 40 para determinar el contenido de proteínas. Incubar la muestra en hielo durante una hora para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso.

En este punto, las fracciones de las gotas de lípidos se pueden almacenar a menos 20 grados centígrados. A continuación, mezcle el volumen que corresponde a al menos 35 microgramos de proteína con un tinte de carga 4x. Incubar la mezcla en hielo durante una hora para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso.

Hervir la muestra a 95 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, realice SDS-PAGE seguido de la tinción de Coomassie para preparar la muestra para la cromatografia líquida acoplada a la espectronomía de masas en tándem como se describe en el protocolo de texto. Para analizar la pureza de las gotas de lípidos, diluya las alícuotas de las fracciones de las gotas de lípidos, de una a dos, con tampón de lisis NP 40.

Diluir las fracciones de control de entrada del uno al diez con el mismo tampón. Incubar las muestras en hielo durante una hora para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso. A continuación, determine el nivel de proteínas con un ensayo de proteínas compatible con detergentes.

A continuación, mezcle la misma cantidad de proteína con un tampón de muestra 6x e incube las muestras en hielo durante una hora para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso. Finalmente, proceda con SDS-PAGE y transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante transferencia en tanque a 80 voltios durante 90 minutos. Aquí se muestra un análisis representativo de Western blot de fracciones postnucleares y de gotas lipídicas.

El Western blot muestra claramente un enriquecimiento de las proteínas marcadoras de gotas lipídicas perilipina dos y perilipina tres en las fracciones de gotas lipídicas, y el agotamiento de marcadores de otros compartimentos celulares. Las fracciones postnucleares y de gotas lipídicas se pueden analizar adicionalmente mediante tinción con azul de Coomassie y plata. Este mapa de calor ilustra el número de péptidos y el porcentaje de cobertura proteica de las proteínas identificadas en las fracciones de gotas de lípidos de las células analizadas.

El mapa de calor final muestra cómo la infección por VHC cambia la gota de lípidos por día. Las proteínas asociadas a las gotas de lípidos enriquecidas se indican en rojo, y las proteínas asociadas a las gotas de lípidos empobrecidas se indican en azul. La principal ventaja de este método es que mezclamos las células antes del aislamiento y del aislamiento previo de las gotas lipídicas, y así podemos minimizar los errores que pueden ocurrir durante la lisis celular y durante las etapas de aislamiento.