Aislamiento gotas de lípidos para el análisis cuantitativo de Espectrometría de Masas

El objetivo general de aislar gotas lipídicas para espectrometría de masas cuantitativa es comprender la función de estas organelas, por ejemplo, en la replicación de patógenos como el virus de la hepatitis C. Este método puede responder preguntas clave en el campo de las enfermedades infecciosas, como por qué los patógenos se asocian a las gotas para replicarse. El aislamiento de gotas lipídicas puede realizarse en seis a siete horas.

Y durante este procedimiento, es importante evitar la contaminación con queratina. Para comenzar, retire 50 mililitros de cada botella de medio DMEM y agregue 50 mililitros de suero de ternera fetal dializado. A continuación, disuelva 50 miligramos de lisina marcada con carbono 13 y 50 miligramos de arginina marcada con carbono 13 en un mililitro de medio.

Mezcle bien y agregue los aminoácidos al medio DMEM más FCS. Luego agregue PenStrep y el sustituto de glutamina. Filtre estérilmente el medio utilizando un filtro de 0,45 micrones y etiquete el frasco como medio SILAC pesado.

Para preparar el medio ligero, repita estos pasos utilizando 50 miligramos de arginina y 50 miligramos de lisina. Etiquete el frasco como medio SILAC ligero. Tripsinice las células y divídalas en dos pocillos de una placa de cultivo de seis pocillos.

Un pocillo debe contener dos mililitros del medio SILAC pesado y el otro, dos mililitros del medio SILAC ligero. Cultive las células durante al menos seis pasajes. Después de seis pasajes, la incorporación de los aminoácidos pesados debe ser superior al 95 %. Recoleccione un millón de células de las poblaciones celulares marcadas con etiqueta pesada y ligera para analizar la eficacia de incorporación.

Después de lavar las células en PBS 1X, pelarlas mediante centrifugación durante cinco minutos a 160 ×g y cuatro grados Celsius. Suspender nuevamente los pellets celulares en 150 microlitros de tampón MS. A continuación, incubar las células en hielo durante 30 minutos.

A continuación, lise las células por sonicación a cuatro grados Celsius. Elimine los restos celulares mediante centrifugación durante 10 minutos a 11.000 ×g y cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo y determine la concentración de proteína con un ensayo de proteína compatible con detergentes.

Luego, mezcle 75 microgramos de proteína con tampón de muestra seis x. Después de hervir a 95 grados Celsius durante cinco minutos, separe las proteínas mediante SDS-PAGE en tampón de corrida SDS a 180 voltios durante aproximadamente una hora. Tras la tinción con Coomassie, excise la misma banda proteica y analice la eficacia de incorporación mediante análisis por MS.

Infecte la población ligera de células con el virus reportero del virus de la hepatitis C incubándolas con cultivos fibrosos durante cuatro horas a 37 grados Celsius. Amplíe las células ligeras infectadas con VHC y las células pesadas no infectadas según se describe en el protocolo del texto. Si utiliza una cepa de VHC que porta un gen de resistencia a blasticidina, añada 10 microgramos por mililitro de blasticidina S al medio ligero para seleccionar células positivas para VHC.

Un día antes del aislamiento de gotas lipídicas, lave las células con PBS, realice tripsinización y re-suspenda en el medio ligero o pesado correspondiente. Cuente las células utilizando una cámara de conteo de Neubauer. A continuación, siembre siete millones de células de cada población en un recipiente de cultivo celular de 150 centímetros cuadrados.

Prepare al menos cinco placas por cada población celular ligera y pesada. Incube las células en 30 mililitros de medio por placa durante la noche. Al día siguiente, retire el medio y lave las células con PBS 1X.

Desprenda las células en PBS 1X utilizando un raspador celular. Después de contar ambas poblaciones celulares como antes, retire iguales números de células en tubos cónicos de 50 mililitros. Pelote las células mediante centrifugación durante cinco minutos a 160 veces g y cuatro grados Celsius.

Elimine el PBS y re-suspenda el botón celular en un mililitro de tampón de sacarosa. Transfiera la suspensión celular a un homogenizador Ounce de ajuste hermético antes de lisar las células con 200 movimientos sobre hielo. Luego, transfiera el lisado a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y centrifugue los núcleos y los restos celulares durante 10 minutos a 1.000 ×g y cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, almacene una alícuota de 25 microlitros de la fracción posnuclear, o PNS, a menos 20 grados Celsius como control de entrada. Coloque el resto de la fracción PNS en el fondo del tubo de centrifugación y superponga con aproximadamente tres mililitros de tampón de lavado de gotas lipídicas. Centrifugue durante dos horas a 100.000 ×g y cuatro grados Celsius.

Después de la centrifugación, recolecte la fracción de gotas lipídicas flotantes desde la parte superior del tubo utilizando una cánula roma doblada. A continuación, coloque la fracción de gotas lipídicas en un tubo de centrífuga, cúbrala con tampón de lavado de gotas lipídicas y repita el paso de centrifugación. La recolección de las gotas lipídicas desde la parte superior del gradiente requiere experiencia.

Y es más fácil cuanto mayor sea la fracción. Puede usar células grasas para practicar. O puede alimentar sus células con oleato para aumentar la cantidad de gotas lipídicas.

Nuevamente, recolecte la fracción de gotas lipídicas flotantes utilizando una cánula roma doblada desde la parte superior del tubo. Transfiera las gotas lipídicas a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y agregue 500 microlitros de tampón de lavado de gotas lipídicas. Luego, centrifugue la muestra durante 20 minutos a 21.000 ×g y 4 grados Celsius.

Retire el tampón de lavado subjacente utilizando una punta de pipeta para carga de geles y repita el paso de lavado tres veces. Después de la eliminación final del tampón de lavado, mezcle cinco microlitros de fracciones de gotas lipídicas con 10 microlitros de tampón de lisis NP-40 para la determinación del contenido proteico. Incube la muestra en hielo durante una hora para inactivar el virus si está trabajando con material infeccioso.

En este momento, las fracciones de gotas lipídicas se pueden almacenar a menos 20 grados Celsius. A continuación, mezcle el volumen que corresponda a al menos 35 microgramos de proteína con colorante de carga 4x. Incube la mezcla en hielo durante una hora para inactivar el virus si se trabaja con material infeccioso.

Hervir la muestra a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Luego, realizar una electroforesis SDS-PAGE seguida de tinción con Coomassie para preparar la muestra para cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en tándem, como se describe en el protocolo del texto. Para analizar la pureza de las gotas lipídicas, diluir alícuotas de las fracciones de gotas lipídicas, de una a dos, con tampón de lisis NP-40.

Diluya las fracciones de control de entrada uno a diez con el mismo tampón. Incube las muestras en hielo durante una hora para inactivar el virus si está trabajando con material infeccioso. A continuación, determine el nivel de proteína mediante un ensayo de proteína compatible con detergentes.

Luego, mezcle cantidades iguales de proteína con tampón de muestra 6x e incube las muestras en hielo durante una hora para inactivar el virus si trabaja con material infeccioso. Finalmente, continúe con SDS-PAGE y transfiera las proteínas a una membrana de nitrocelulosa mediante electrotransferencia en tanque a 80 voltios durante 90 minutos. Aquí se muestra un análisis representativo por inmunotransferencia de fracciones postnucleares y de gotas lipídicas.

El western blot muestra claramente un enriquecimiento de las proteínas marcadoras de gotas lipídicas perilipina dos y perilipina tres en las fracciones de gotas lipídicas, y el agotamiento de marcadores de otros compartimentos celulares. Las fracciones posnucleares y de gotas lipídicas pueden analizarse adicionalmente mediante tinción con azul de Coomassie y plata. Este mapa de calor ilustra el número de péptidos y el porcentaje de cobertura de proteínas de las proteínas identificadas en las fracciones de gotas lipídicas de las células analizadas.

El mapa de calor final muestra cómo la infección por VHC altera las gotas lipídicas por día. Las proteínas asociadas a gotas lipídicas enriquecidas se indican en rojo, y las proteínas asociadas a gotas lipídicas disminuidas se indican en azul. La ventaja principal de este método es que mezclamos las células antes del aislamiento y antes del aislamiento de las gotas lipídicas, y así podemos minimizar los errores que pueden ocurrir durante la lisis celular y durante los pasos de aislamiento.