Usando una técnica fluorescente PCR-capilar Electroforesis en gel con el genotipo CRISPR / Cas9 mediada Knockout mutantes en un formato de alto rendimiento

El objetivo general de esta técnica es genotipar de manera de alto rendimiento clones mutantes de inserción-deleción inducidos por CRISPR/Cas9. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la genética, como el efecto fenotípico de la interrupción de un gen particular en un modelo SAIL de elección. La principal ventaja de esta técnica es que permite un cribado de bajo a alto rendimiento que es multiflexible.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la genética del cáncer humano, también puede aplicarse a otros sistemas, como células humanas, células madre y células primarias, o células de origen no humano. Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando realizamos ensayos de tipificación de repeticiones tandem cortas o STR. Para comenzar el procedimiento, transfecte las células seleccionadas con un plásmido que exprese simultáneamente una etiqueta fluorescente cas9 y el ARN guía simple.

Realice la tripsinización de las células y seleccione aproximadamente 3 500 clones marcados con fluorescencia. Siembre los clones en porciones de 500, 1 000 y 2 000 células en placas de 10 centímetros con ocho mililitros de medio de crecimiento suplementado con penicilina y estreptomicina. Incube las células en una atmósfera de 5 % CO₂ a 37 grados Celsius, reemplazando el medio cada cinco días hasta que las colonias derivadas de una sola célula sean visibles a simple vista.

Luego aspire colonias individuales en una pipeta de 200 microlitros con aproximadamente cinco microlitros de medio de crecimiento. Transfiera cada colonia a un pocillo separado que contenga 200 microlitros de medio de crecimiento. Pipetee repetidamente cada mezcla hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células.

Incube las células en las condiciones descritas previamente hasta que alcancen una confluencia del 50 al 90 %. Retire el medio de cultivo excedente de los pocillos y agregue 25 microlitros de tripsina-EDTA al 0,05 % sin rojo de fenol a cada pocillo. Incube las células a 37 grados Celsius durante 7 minutos.

Luego, pipetee repetidamente las mezclas hacia arriba y hacia abajo para resuspender las células tratadas con tripsina. Inspeccione los pocillos bajo un microscopio para verificar que las células se hayan desprendido de las paredes de los pocillos. Para preparar réplicas de los clones individuales, transfiera cinco microlitros de cada suspensión celular a una placa de cultivo de 96 pocillos vacía.

Añada 200 microlitros de medio de crecimiento a cada pocillo. Luego, cargue los pocillos de una placa PCR de 96 pocillos vacía con 10 microlitros de tampón de lisis. Transfiera otros cinco microlitros de cada suspensión celular a esta placa de 96 pocillos.

Centrifugar brevemente la placa hasta que el líquido se asiente en el fondo de los pocillos. Añadir 200 microlitros de medio de crecimiento a los 15 microlitros restantes de cada suspensión celular. Almacenar la suspensión original y los replicados bajo las condiciones de incubación para verificar posteriormente el estado de knockout de los clones.

Luego, utilice ciclado térmico para lisar completamente las células en tampón de lisis. Centrifugue brevemente los lisados. Diluya los lisados con 40 microlitros de agua libre de nucleasas.

Vortex y centrifugar brevemente los lisados diluidos. Antes de realizar la PCR fluorescente, diseñar y probar la especificidad de varios pares de cebadores sin marcar en células silvestres lisadas. Identificar el par de cebadores óptimo y obtener los cebadores directos marcados con fluoróforo y el cebador inverso sin marcar.

Asegúrese de probar la especificidad de los cebadores utilizando células vortexeadas y lisándolas con el tampón de lisis casero, ya que los resultados pueden variar en comparación con el uso de ADN genómico purificado. Con los cebadores marcados, realice reacciones de PCR fluorescente de 20 microlitros con tres microlitros de los lisados diluidos para amplificar las regiones diana. Evalúe el tamaño y las cantidades relativas de los amplicones de PCR resolviendo cinco microlitros de los amplicones en un gel de agarosa al 1%.

Para comenzar la preparación de la muestra, utilice agua libre de nucleasas para diluir los amplicones de ADN de tipo silvestre y dirigidos con CRISPR/Cas9 hasta una concentración aproximada de 2,5 nanogramos por microlitro. Mezcle volúmenes iguales de las muestras de ADN diluidas de tipo silvestre y dirigidas. Cargue los pocillos de una placa de PCR de 96 pocillos con nueve microlitros de una mezcla de 29 a 1 de formamida desionizada y estándar de tamaño marcado con colorante, y un microlitro de los amplicones mezclados.

Cierre herméticamente la placa y caliente las muestras a 95 grados celsius durante tres minutos con un termociclador PCR. Inmediatamente después del calentamiento, enfríe la placa en hielo durante tres minutos. Realice electroforesis en gel capilar con un analizador genético.

Una vez finalizada la electroforesis, importe los datos al software de análisis y represente gráficamente los datos. Verifique la calidad del patrón de tamaño revisando los datos en el canal de colorante correspondiente. Luego exporte los valores del canal de colorante para los controles salvajes no dirigidos y los clones dirigidos en formato txt.

De este archivo, importe las identidades del colorante, los nombres de los archivos de muestra, los tamaños de los fragmentos y los valores de altura de pico al software de hoja de cálculo. Calcule la diferencia en el tamaño del fragmento entre el clon diana y el control de tipo salvaje no diana en cada muestra. Identifique los clones con mutaciones de inserción-deleción que no sean múltiplos de tres pares de bases.

Expanda sucesivamente los clones seleccionados a partir de los replicados almacenados. Realice secuenciación Sanger y análisis de sangre occidental para determinar los genotipos de los clones y verificar el estado de knockout de los mismos. La línea celular de carcinoma hepatocelular HEPG2 fue dirigida con un constructo CRISPR/Cas9 contra el gen Nap1L1.

Los alelos salvajes no dirigidos y los alelos dirigidos mediante CRISPR/Cas9 se amplificaron por PCR utilizando cebadores marcados con fluoróforos verde y azul, respectivamente. Mediante el uso de un protocolo de PCR fluorescente específicamente optimizado, se obtuvieron los amplicones de los clones dirigidos con buen rendimiento. No se observó interferencia entre los colorantes fluorescentes verde y azul dentro de las muestras de clones individuales.

El análisis de los tamaños de los fragmentos, determinados mediante electroforesis capilar en gel, reveló la eliminación de un par de bases y de 10 pares de bases en los dos clones mostrados aquí. Los resultados del secuenciamiento de Sanger fueron consistentes con el análisis de electroforesis capilar en gel. El análisis de sangre periférica confirmó que los clones seleccionados no expresaban NAP1L1.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar etiquetar cuidadosamente sus muestras, ya que hay muchas muestras involucradas, y también minimizar el tiempo de exposición del amplicón marcado con el fluoróforo, ya que son sensibles a la luz. Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como RT-PCR cuantitativa, análisis sanguíneo por western blot y secuenciación de Sanger para responder preguntas adicionales, como cuáles son los genes de interés y si se han eliminado por completo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo genotipar clones mutantes inducidos por CRISPR/Cas9 de manera de alto rendimiento utilizando PCR fluorescente acoplada a electroforesis en gel capilar.