Análisis Electrofisiológico de Cardiomiocitos Pluripotentes Humanos Pluripotentes (hPSC-CMs) Usando Matrices Multi-Electrodo (MEAs)

El objetivo general de este procedimiento es disociar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas y colocarlos en matrices de electrodos múltiples para medir y cuantificar la duración y la frecuencia de su señal eléctrica típica, también llamada potencial de campo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo, como cuáles son las diferencias electrofisiológicas entre los cardiomiocitos portadores de mutaciones y los controles. La principal ventaja de esta técnica es que permite el cribado de fármacos en cardiomiocitos humanos derivados de células de pacientes.

La demostración visual de este método es fundamental. Como los pasos de disociación y enchapado son esenciales para el éxito de la grabación de señales eléctricas. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la identificación de señales eléctricas de buena o mala calidad no es trivial y el análisis del potencial libre requiere experiencia.

Para comenzar este procedimiento, coloque las virutas limpias en una placa de Petri estéril de plástico estándar de 10 centímetros de diámetro. A continuación, agregue ocho mililitros de agua destilada estéril a la placa de Petri para formar una cámara humidificada que evitará que el pequeño volumen de medio de cultivo en el chip se extraiga cuando se coloque en la incubadora. A continuación, utilice anillos de politetrafluoroetileno hechos a medida para garantizar la colocación de los cardiomiocitos en el centro del chip donde se encuentra la guía de electrodos.

En la campana de cultivo, retire los anillos del etanol. Colóquelos en una placa de Petri estéril sin tapa y deje que los anillos se sequen en la campana. A continuación, coloque un anillo seco dentro de un chip MEA utilizando unas pinzas esterilizadas con llama.

Cubra los electrodos agregando 50 microlitros de fibronectina de 40 microgramos por mililitro dentro del anillo. Después de eso, cubra la placa de Petri con la tapa y transfiera con cuidado la placa que contiene el chip MEA a una incubadora. A continuación, transfiera la placa que contiene el chip MEA a la campana de cultivo celular.

Antes de usar el chip MEA, aspire 50 microlitros de fibronectina usando una pipeta P200 o un sistema de vacío en la campana sin desplazar el anillo de PTFE. Asegúrese de que ningún objeto sólido toque los electrodos manteniendo la punta en ángulo. A continuación, añada suavemente 950 microlitros de medio LI-BPEL asegurándose de que se distribuya uniformemente y de que el anillo no flote.

Posteriormente, regrese el plato a la incubadora. Este es el cultivo inicial de los cardiomiocitos latentes. En una campana de cultivo de tejidos, aspire el medio del pocillo de cultivo de hPSC-CMs.

Agregue de uno a dos mililitros de PBS sin calcio y magnesio a cada pocillo para lavar el cultivo y aspirar el PBS. A continuación, añada 500 microlitros de la enzima de disociación a cada pocillo. Incubar la muestra durante 5 minutos a 37 grados centígrados.

Después de cinco minutos, agregue un mililitro de LI-BPEL a cada pocillo para diluir la enzima. Separe la monocapa de hPSC-CM rascándola suavemente con una pipeta P1000. A continuación, recoge la suspensión de la célula en un tubo de 15 mililitros.

A continuación, enjuague el pocillo con un mililitro de LI-BPEL para recoger todas las células restantes y los grupos de células. Agregue otros dos a tres mililitros de LI-BPEL para alcanzar un volumen final de alrededor de cinco a seis milímetros y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces con una pipeta de cinco mililitros para disociar los grupos de células. A continuación, centrifugar las células a temperatura ambiente durante tres minutos a 300 veces g.

Después de eso, retire el sobrenadante sin desalojar la pelletza de la celda. A continuación, vuelva a suspender el pellet de celda en 250 microlitros de LI-BPEL. Posteriormente, distribuya 50 microlitros de suspensión de celda por MEA pipeteando la suspensión de celda directamente en el centro del anillo de PTFE en la parte superior de la guía de electrodos.

Transfiera con cuidado los MEA a la incubadora a 37 grados centígrados y deje que las celdas se adhieran durante la noche. Un día después del enchapado, retire con cuidado el anillo en un ambiente estéril con pinzas estériles. Enjuague el anillo con etanol al 80 por ciento.

Y guárdelo en un tubo de 50 mililitros que contiene un 80 por ciento de etanol fresco. A continuación, retire suavemente 500 microlitros de medio del chip MEA. Y añádele 500 micro litros de LI-BPEL fresco.

Estos son los cardiomiocitos que laten después de la extracción del anillo. Posteriormente, transfiera los MEA a la incubadora a 37 grados centígrados. A continuación, mida la actividad eléctrica de las hPSC-CM en los MEA a partir de un día después de la retirada del anillo y hasta una semana.

Ahora inicie el paquete de software vinculado a la configuración de MEA. A continuación, ajuste la temperatura a 37 grados centígrados en TCX-Control para registrar las mediciones. Después de eso, retire el plato que contiene el chip MEA de la incubadora.

Saque el chip MEA del plato y colóquelo sobre un pañuelo de papel para absorber el agua residual. Limpie cuidadosamente el contexto externo de la placa con un pañuelo de papel y límpielo con un hisopo de algodón humedecido con etanol al 100 por ciento para eliminar cualquier agua residual o residuo que pueda causar ruido de señal. A continuación, transfiera la placa MEA a una etapa de cabezal de registro a 37 grados centígrados para detectar la actividad espontánea.

Abra MC Rack y haga clic en editar para cargar el hardware MEA. Para crear un nuevo protocolo, use el menú desplegable editar para agregar diferentes ventanas de grabación y visualización al protocolo. A continuación, inicie el protocolo en modo de reproducción haciendo clic en el botón de reproducción.

Si las señales muestran picos R visibles y picos T claramente, espere de 10 a 15 minutos para concluir la fase de adaptación. Para iniciar el experimento, haga clic en grabar y, a continuación, en reproducir y adquirir datos durante 10 minutos en las condiciones de referencia para determinar el estado estable. Anote los electrodos que tuvieron la mejor señal para que puedan identificarse fácilmente y exportarse posteriormente para su análisis.

Para una evaluación de la respuesta al medicamento, agregue concentraciones crecientes del medicamento cada 10 minutos. Haga clic en detener para concluir la grabación al final del protocolo. A continuación se muestran las trazas representativas registradas con un MEA que muestran una traza de buena calidad con picos RQ y T claramente visibles con una alta relación señal/ruido.

Una traza de mala calidad sin picos RQ y T claramente visibles Y una traza ruidosa con picos RQ y T claramente visibles pero con una relación señal/ruido baja. Y aquí están los ejemplos representativos de trazas de potencial de campo de buena calidad con diferentes morfologías que se pueden registrar durante los experimentos de MEA utilizando hPSC-CM. El área sombreada representa el intervalo QT medido durante el análisis.

Dado que el potencial de campo en el MEA se asemeja a la primera derivada del potencial de acción, la integral de las trazas de potencial de campo se ha calculado como demostraciones teóricas de las ondas T que están cerca de las repolarizaciones completas del potencial de acción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe optar por el mayor número de electrodos para garantizar señales fiables y consistentes. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar otros métodos como la PCR cuántica de tiempo tibial o la pinza de parche de una sola célula para responder a preguntas adicionales como la expresión génica específica relacionada con el fenotipo eléctrico o las densidades específicas de corriente iónica.

Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino a los investigadores en el campo de las células madre, para explorar las arritmias cardíacas y la farmacología in vitro utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo disociar y colocar placas de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas en los MEA para mediciones electrofisiológicas y detección de medicamentos. No olvide que trabajar con medicamentos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como las BPL estándar al realizar este procedimiento.