Name: Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Aprende inmunohistoquímica de fluorescencia multicolor para analizar subpoblaciones de células T en carcinoma orofaríngeo usando tejido fijado en formol y embebido en parafina. Esta técnica permite visualizar múltiples biomarcadores simultáneamente.

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Simone Punt recibió el apoyo de la subvención UL2010-4801 de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer. Agradecemos a todos los coautores del documento original que este protocolo JoVE esté basado en: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter y Sjoerd van Der Burg.

Las muestras de pacientes se manejaron de acuerdo con las directrices éticas médicas descritas en el Código de Conducta para el Uso Secundario Adecuado del Tejido Humano de la Federación Holandesa de Sociedades Científicas Biomédicas (www.federa.org). 1. Prepare diapositivas <ol><li> Obtenga material de tejido resecado (cualquier tipo de tejido) de un departamento de patología después de obtener permiso del comité médico ético para usar material resecado. NOTA: Para el experimento actual, se obtuvieron muestras de tumor pretratamiento de tumores orofaríngeos primarios diagnosticados en el Centro Médico de Leiden University, Leiden, Holanda entre 1970 y 2011, seleccionados como se describió anteriormente (n = 162) 13 . El tamaño del tejido sólo estaba limitado por el requisito de una cantidad suficiente de tejido tumoral para tomar de forma fiable 4 imágenes microscópicas dentro del tumor. </li><li> Fijar el tejido en formalina tamponada al 4% durante un mínimo de 12 h. Deshidratar el tejido en agRadicado serie de etanol. Lavar en xileno e incrustar en cera de parafina con un procesador de tejido automatizado. </li><li> Corte secciones de tejido de 4 μm de espesor, fijadas con formalina, embebidas en parafina (FFPE) sobre placas de vidrio usando un microtomo. Coloque el bloque de tejido en el soporte de tejido de microtona utilizando procedimientos estándar. <ol><li> Corte las cintas de tejido y colóquelas en la superficie de un baño de agua que contenga agua desionizada a 45 ºC. Utilice una diapositiva adecuada para la tinción inmunohistoquímica para pescar una sección colocando la diapositiva en el agua directamente debajo de la sección. Mueva con cuidado la corredera hacia arriba en un ángulo, sacando la sección del agua y pegándola en la corredera. </li></ol></li><li> Deje que los portaobjetos se sequen durante una noche a 37ºC. </li><li> Desparafinar los portaobjetos de FFPE sumergiéndolos completamente en 100% de xileno fresco, tres veces durante 5 min cada uno. Rehidratar los portaobjetos sumergiéndolos dos veces en etanol 100% fresco, etanol al 70% y etanol al 50% durante 5 minutos cada uno. </li></ol> 2. Realizar la recuperación de antígeno <ol><li> Lavar los portaobjetos en agua desionizada durante 5 min. </li><li> Precalentar el tampón de ácido tris-etilendiaminotetraacético (EDTA) (Tris 10 mM más EDTA 1 mM, pH 9,0) hasta la temperatura de ebullición usando un microondas. Realice la recuperación del antígeno sumergiendo los portaobjetos en el tampón EDTA precalentado y manteniendo el tampón a esta temperatura durante 10 minutos en el microondas. NOTA: Se puede utilizar cualquier microondas con una potencia de 900 W. </li><li> Deje que los portaobjetos se enfríen en el amortiguador durante 2 h. </li></ol> 3. Mancha las diapositivas del tejido <ol><li> Lavar las placas dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante 5 min cada una. </li><li> Dibuje un círculo alrededor del tejido con una pluma hidrófoba para evitar que los anticuerpos diluidos se derrame de la diapositiva. Lavar una vez más con PBS; Esto es opcional. </li><li> Incubar el tejido con anticuerpos primarios (anti-CD3 1:50, anti-FoxP3 1: 200 y anti-IL-17 1:50) diluido en suero bovino al 1% p / v aLbumin (BSA) en PBS a temperatura ambiente durante la noche. NOTA: El volumen por diapositiva depende del tamaño del tejido, pero típicamente es de 50-150 μl. Sustituir los anticuerpos primarios con anticuerpos de la misma clase de isotipo con una especificidad desconocida para las diapositivas de control negativo a la misma dilución que los anticuerpos CD3, CD8 y FoxP3 ( es decir, anticuerpo de control del isotipo de Ig de conejo, anticuerpo de control de isotipo de IgG1 de ratón y cabra IgG). </li><li> Lavar los portaobjetos tres veces con PBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Incubar el tejido con una combinación de anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente dirigidos a las especies de anticuerpos primarios y / o isotipos ( es decir, 1: 200 burro anti-cabra IgG Alexa 488, burro anti-conejo IgG A546, y burro anti-ratón A647) diluido en 1% de BSA en PBS a temperatura ambiente durante 1 h. NOTA: El volumen por diapositiva depende del tamaño del tejido, pero típicamente es de 50-150 μl. <ol><li> DespuésAñadiendo el anticuerpo secundario, mantenga los portaobjetos protegidos de la luz tanto como sea posible almacenándolos en una caja oscura o envolviendo la caja en papel de aluminio. </li></ol></li></ol> 4. Montar y ajustar las diapositivas del tejido <ol><li> Lavar los portaobjetos tres veces en PBS durante 5 minutos cada uno. </li><li> Montar los portaobjetos utilizando un medio de soporte anti-desvanecimiento acuoso que contenga un contra-tinción nuclear ( por ejemplo, DAPI). Analizar las diapositivas con un microscopio fluorescente lo antes posible (dentro de dos semanas). Guarde los portaobjetos en la oscuridad a 4 ° C hasta su análisis. </li></ol> 5. Analizar las diapositivas de tejidos teñidos <ol><li> Obtenga cuatro imágenes de cada diapositiva usando un microscopio de fluorescencia equipado con un objetivo de 20-25X. Tomar imágenes en lugares aleatorios a lo largo del área total del tumor incluida en la diapositiva para capturar una fracción representativa del tumor. NOTA: Debe usarse una ampliación estándar de 250X. Cualquier fluorescente oR microscopio de escaneado láser, siempre que tenga los filtros y láser necesarios para visualizar los fluorocromos utilizados. <ol><li> Para la visualización de Alexa 488, utilice un máximo de excitación de 490 y un máximo de emisión de 525; Para la visualización de Alexa 546, utilice un máximo de excitación de 556 y un máximo de emisión de 573; Para la visualización de Alexa 647, utilice un máximo de excitación de 650 y un máximo de emisión de 665; Y para la visualización de DAPI, utilice un máximo de excitación de 358 y un máximo de emisión de 461. </li><li> Guarde las imágenes como archivos de imagen ( es decir, jpeg y tiff) en el software disponible para el usuario. </li></ol></li><li> Discriminar entre epitelio tumoral y áreas de estroma tumoral basadas en las formas nucleares y celulares de las células epiteliales tumorales frente a las células estromales después de consultar a un patólogo. <ol><li> Para determinar la superficie total del estroma, trace una línea alrededor de todas las áreas ocupadas por células estromales (en lugar de células tumorales) y recorD la superficie utilizando el software de análisis de imágenes proporcionado por el fabricante del microscopio. <ol><li> Haga clic en la pestaña &quot;Superposición&quot; debajo de la imagen; Elija la forma &quot;Cerrada Poly-line&quot; y haga clic en ella. Demarque la frontera entre los campos epiteliales y estromales del tumor haciendo clic alrededor del área hasta alcanzar el primer punto nuevamente. Esto proporciona una medida para esa área. NOTA: Una vez que la forma esté cerrada, aparecerá un número junto a la forma que rodea el área de la superficie de la imagen seleccionada (A = x μm 2 ). </li></ol></li><li> Restar este área de superficie de la superficie total de la imagen (proporcionado en las propiedades de la imagen) para calcular el área de la superficie epitelial. Excluya áreas vasculares, necróticas y autofluorescentes dibujando una línea alrededor de ellas, registrando el tamaño del área proporcionada y restando el área epitelial. </li><li> Guarde todos los números de área de superficie en un archivo de hoja de cálculo para calcular lasNúmero de células por diapositiva. </li><li> Usando el software de análisis de imágenes, determine si las células son individuales, dobles o triples positivas comprobando la fluorescencia de los cuatro canales. <ol><li> Contar las células simples, dobles y triples positivas en cada imagen usando ImageJ. <ol><li> Descargar ImageJ. Abra una imagen haciendo clic en &quot;Archivo&quot; y &quot;Abrir&quot; y seleccionando la imagen a analizar. Haga clic con el botón derecho del ratón en la &quot;Herramienta de punta&quot; (un cuadrado rojo en el centro de cuatro líneas) y seleccione la &quot;Herramienta multipunto&quot;. Haga doble clic en &quot;Multi-Point Tool&quot; y cuente el número de tipos de celdas diferentes en la imagen seleccionando un número de contador diferente para cada tipo de celda. NOTA: Cuente todas las celdas de cada tipo de célula diferente, tal como se identifica por la presencia de uno, dos o los tres colores fluorescentes. Excluir DAPI, ya que este counterstain nuclear está presente en todas las células y se utiliza para discriminar las células tumorales de las células inmunes. Cada tipo de célula se cuentaUtilizando un número de contador diferente. Cuente el número de células de cada tipo de célula por separado en las áreas epiteliales y estromales tumorales eligiendo un número de contador diferente cada vez. No cuente las células dentro de los vasos sanguíneos y áreas en gran parte autofluorescentes. </li><li> Registre el número de celdas analizadas en cada compartimiento para cada imagen en un archivo de hoja de cálculo. </li><li> Divida el número total de células para cada tipo de célula sobre la superficie total del epitelio tumoral y el estroma tumoral analizado. </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 6. Análisis estadístico NOTA: Todos los análisis estadísticos deben ser discutidos con un estadístico para asegurar la calidad de los datos. Para estadísticas generales, use cualquier guía de estadísticas médicas 14 . <ol><li> Prueba de las correlaciones entre las frecuencias celulares utilizando una correlación de Spearman rho test de correlación. </li><li> Pruebe las diferencias estadísticas en el número de células positivasLs entre los grupos de pacientes que utilizan la prueba de Wilcoxon Mann-Whitney. </li><li> Pruebe las correlaciones entre el número de células y la supervivencia libre de enfermedad ( es decir, tiempo desde el diagnóstico hasta la recidiva local o distante de la muerte o enfermedad) dividiendo a los pacientes en grupos basados ​​en un número de corte de células usando la generación de curva Kaplan-Meier y log Análisis de rango 15 . </li><li> Realizar análisis multivariante utilizando análisis de regresión proporcional de riesgo de Cox. </li></ol>

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<li>Jordanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+leukocyte+antigen+class+I%2C+MHC+class+I+chain-related+molecule+A%2C+and+CD8%2B%2Fregulatory+T-cell+ratio%3A+which+variable+determines+survival+of+cervical+cancer+patients%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?</a> Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).</li>
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<li>Punt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+beneficial+tumor+microenvironment+in+oropharyngeal+squamous+cell+carcinoma+is+characterized+by+a+high+T+cell+and+low+IL-17%28%2B%29+cell+frequency%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunol+Immunother%22%5BJournal%5D)">A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency.</a> Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).</li>
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<li>Kleinbaum, D. G., Klein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKleinbaum%2C+DG+%22Survival+Analysis%3A+A+Self-Learning+Text%22">Survival Analysis: A Self-Learning Text</a>. , 2nd ed, Springer. (2005).</li>
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<li>Feng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multispectral+imaging+of+formalin-fixed+tissue+predicts+ability+to+generate+tumor-infiltrating+lymphocytes+from+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma.</a> J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).</li>
</ol>

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses comercial o financiero.

Para el protocolo descrito, una de las etapas más críticas es determinar la dilución correcta de los anticuerpos primarios utilizados. La dilución de los anticuerpos secundarios marcados fue de 1: 200, según lo recomendado por el fabricante de estos anticuerpos específicos marcados con Alexa. La dilución de los anticuerpos primarios debe determinarse entonces mediante una dilución en serie, preferiblemente utilizando dos muestras diferentes del tipo de tejido deseado (en este caso, OPSCC). La dilución óptima de trabajo ...

Los carcinomas de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) son un grupo heterogéneo de cánceres de células escamosas que se originan en la orofaringe. Los factores de riesgo para OPSCC incluyen la infección por el virus del papiloma humano (VPH) y el consumo de alcohol y tabaco 1 , 2 . El papel de la respuesta inmune y cómo usar esto en un entorno clínico está empezando a ser explorado. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunes que son atraídas al sitio del cáncer. Aunque una alta frecuencia de células T citotóxicas CD8 + se ha correlacionado con la supervivencia mejorada en pacientes OPSCC 3 , el papel de otros subconjuntos de células T, incluyendo Tregs y células Th17, todavía no está claro 4 . Mientras que las células Th1 y Th17 se supone para ayudar en la respuesta inmune dirigida a las células tumorales, Tregs son bien conocidos por sus capacidades para suprimir la actividad de otras células T [ 5] . Sin embargo, la presencia de TRegs ha demostrado que se correlaciona con respuestas favorables y desfavorables en diferentes tipos de tumores [ 6] . Dado que no todas las células inmunitarias presentes en la sangre se infiltran en el tumor en la misma medida, el estudio del microambiente local del tumor proporciona la medida más fiable de la respuesta inmune dirigida contra el tumor. El objetivo de este estudio es determinar la correlación entre los números y tipos de células inmunes y el resultado clínico. Se utilizó cuatro colores de fluorescencia IHC de imágenes para analizar el número y la localización de varias subpoblaciones de células T en humanos OPSCC. Nos centramos en el total de linfocitos T (CD3 + ), Th17 células, y inmunosupresores FoxP3 + Tregs, cuya diferenciación vía está estrechamente relacionado con Th17 células. Las células Th17 se caracterizan por la combinación de CD3 e IL-17. La citocina IL-17 también puede ser producida por células no T 7 . Se determinó la distribución de intra-epitCélulas T heliales y estromales, Tregs, Th17, e IL-17 + células no T en una gran serie de casos OPSCC y analizaron las correlaciones con la supervivencia del paciente. Se usó fluorescencia multicolor IHC para identificar la expresión de CD3, Foxp3 e IL-17, en combinación con un contraste de DAPI. Este ensayo permitió la identificación fácil y clara de ambas células tumorales (usando tinción nuclear DAPI) y las poblaciones de células T infiltrantes (usando una combinación de diferentes marcadores). Después de la preparación de la muestra y la tinción, un microscopio fluorescente y software de imágenes se utilizaron para separar los diferentes colores fluorescentes utilizados y para determinar el número y el tipo de células presentes tanto en el epitelio tumoral y el estroma asociado al tumor. Un análisis alternativo para cuantificar y fenotipo de poblaciones de células inmunitarias es el análisis de citometría de flujo, o análisis de citometría por tiempo de vuelo (CyTOF), de muestras tumorales o periféricas ( es decir, sangre o ascitis). Usando esto, Se pierde toda la información sobre localización y distribución relativa de los diferentes tipos de células. El uso y análisis de muestras periféricas tampoco proporciona información sobre qué células son capaces de infiltrarse en el microambiente tumoral. Los análisis de sangre y ascitis de células inmunes se han demostrado no para reflejar el fenotipo y la frecuencia de infiltración de células inmunes del tejido tumoral 8, 9. Otra alternativa es el uso de microscopía de campo brillante. Una ventaja de esta técnica sobre la formación de imágenes de fluorescencia es la ausencia de autofluorescencia del tejido. Aunque algunas muestras contienen más autofluorescencia, particularmente eritrocitos, pero también otros tipos de células, incluyendo granulocitos neutrófilos, estas áreas pueden ser fácilmente eliminadas en el análisis de casi todas las muestras. La inmunofluorescencia ofrece la ventaja de analizar marcadores múltiples en una muestra usando un panel de fluoresce dirigidoNt longitudes de onda. Esto es actualmente imposible en la misma medida para la microscopía de campo brillante debido a la falta de un número suficiente de marcadores y de isotipos de anticuerpos comercialmente disponibles para un antígeno particular. La técnica de fluorescencia multicolor IHC descrita aquí se ha usado en muchos tipos diferentes de cáncer y combinaciones de anticuerpos para estudiar diferentes poblaciones de células inmunitarias, así como moléculas de células tumorales expresadas, tales como antígenos de leucocitos humanos (HLA) y PD-L1 10 , 11 , 12 . El protocolo se ha establecido y validado utilizando muchos tipos diferentes de muestras y anticuerpos.

<table><tbody><tr><td>Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor</td><td>Milestone e Histostar</td><td></td><td>Procesador de tisú automatizado</td></tr><tr><td>Histostar</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Máquina de inclusión de bloques de tejidos</td></tr><tr><td>Formaldehído</td><td>Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milliQ agua</td><td>Elaga Purelab Chorus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera de parafina/Paraclean</td><td>Klinipath</td><td>5079A Soporte de</td><td></td></tr><tr><td>pañuelo para micrótomo</td><td>Leica</td><td>RM225</td><td></td></tr><tr><td>Flex IHC lado</td><td>Dako</td><td></td><td>Portaobjetos de tejido</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Merk-Milipore</td><td>1.083.821.000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Baker</td><td>1073</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Bio-Rad</td><td>BUF036A</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Conejo anti-CD3</td><td>Abcam</td><td>ab828</td><td>Titulación necesaria dilución de anticuerpos</td></tr><tr><td>Ratón IgG1 anti-FoxP3</td><td>Abcam</td><td>ab20034</td><td>Titulación necesaria dilución de anticuerpos</td></tr><tr><td>Cabra IgG anti-IL-17</td><td>R& D Systems</td><td>AF-317-NA</td><td>Titulación requerida dilución de anticuerpos</td></tr><tr><td>Anticuerpo de control de isotipo Ig de conejo</td><td>Abcam</td><td>ab27472</td><td>Úselo a la misma concentración final que anti-CD3</td></tr><tr><td>Anticuerpos de control de isotipo IgG1 de ratón</td><td>Abcam</td><td>ab91353</td><td>Uso a la misma concentración final que anticuerpo de control de isotipo IgG de cabra anti-FoxP3</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>02-6202</td><td>Úselo a la misma concentración final que anti-IL-17</td></tr><tr><td>Burro anti-conejo IgG A546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10040</td><td>Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Burro anti-ratón-A647</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A31571</td><td>Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>Burro anticabra IgG A488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A11055</td><td>Diluido 1:200 en 1% BSA/PBS</td></tr><tr><td>VectaShield que contiene DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal LSM700&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objetivo</td><td>Zeiss</td><td>420852-9972-720</td><td></td></tr><tr><td>LSM Zen Software</td><td>Zeiss</td><td>versión 2009</td><td></td></tr><tr><td>LSM Image Browser</td><td>Zeiss</td><td>versión 4.2.0.121</td><td>Disponible para descargar en www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html.</td></tr><tr><td>SPSS</td><td>IBM Corp.</td><td>versión 20.0</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td>versión 1.50i</td><td>Disponible para descargar en http://rsb.info.nih.gov/ij.</td></tr></tbody></table>

inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células t en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina

Four-color Fluorescence Immunohistochemistry of T-cell Subpopulations in Archival Formalin-fixed, Paraffin-embedded Human Oropharyngeal Squamous Cell Carcinoma Samples

La técnica de inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores (IHC) es un método para cuantificar las poblaciones de células de interés, teniendo en cuenta su distribución relativa y su localización en el tejido. Esta técnica ha sido ampliamente aplicada para estudiar el infiltrado inmune en diversos tipos de tumores. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunitarias que son atraídas hacia el sitio del tumor. Se ha descubierto que diferentes poblaciones de células inmunes juegan diferentes papeles en el microambiente tumoral y tienen un impacto diferente en el resultado de la enfermedad. Este manuscrito describe el uso de la fluorescencia multiparamétrica IHC en carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) como ejemplo. Esta técnica puede extenderse a otras muestras de tejidos y tipos de células de interés. En el estudio presentado, se analizó el compartimento intraepitelial y estromal de una cohorte OPSCC grande (n = 162). Nos centramos en los linfocitos T totales (CD3 + ), inmunodepresores(TREGs, es decir, FoxP3 + ), y células T auxiliar 17 (Th17) ( es decir, IL-17 + CD3 + ) utilizando un contraste nuclear para distinguir el epitelio tumoral del estroma. Se encontró que un alto número de células T estaba correlacionado con una supervivencia libre de enfermedad mejorada en pacientes con un número bajo de células IL-17 + no-T intratumoral. Esto sugiere que las células no-T de IL-17 + pueden estar correlacionadas con una respuesta inmune pobre en OPSCC, lo que está de acuerdo con la correlación descrita entre IL-17 y la mala supervivencia en pacientes con cáncer. Actualmente, se están desarrollando nuevas técnicas de IHC de fluorescencia multiparámetro que utilizan hasta 7 fluorocromos diferentes y permitirán la caracterización y localización más precisas de las células inmunitarias en el microambiente tumoral.

Se tiñó una serie de muestras tumorales de pretratamiento de FFPE obtenidas a partir de tumores orofaríngeos primarios diagnosticados en el Leiden University Medical Center de Leiden, Países Bajos entre 1970 y 2011, seleccionadas como se describió anteriormente (n = 162), usando el protocolo descrito 13 . Se analizaron de una a cuatro imágenes aleatorias de cada diapositiva ( Figura 1 ). Se indican algunas células autofluorescentes, q...

La inmunohistoquímica de fluorescencia multiparamétrica puede usarse para evaluar el número, la distribución relativa y la localización de las poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral. Este manuscrito describe el uso de esta técnica para analizar las subpoblaciones de células T en el cáncer orofaríngeo.

Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina

The four-color fluorescence immunohistochemistry (IHC) technique is a method to quantify cell populations of interest while taking into account their ...

El objetivo general de este experimento es realizar la visualización inmunohistoquímica multicolor y la enumeración de varias subpoblaciones de linfocitos T en secciones de tejido de archivo fijadas en formalina e incluidas en parafina de muestras de carcinoma de células escamosas orofaríngeas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la inmunooncología, como por ejemplo, si existe una relación entre el tejido tumoral, la infiltración de células inmunitarias, las subpoblaciones y el pronóstico del paciente. Con esta técnica, se pueden visualizar varios biomarcadores en una sección de tejido.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia del cáncer, ya que la evaluación simultánea de múltiples células inmunitarias o factores relacionados con la inmunidad podría ayudar en la estratificación de los pacientes para terapias inmunitarias específicas. Comience usando una microlengua para obtener secciones de tejido incrustadas en parafina fijadas en formalina de cuatro micrómetros de grosor, colocando las cintas de tejido en la superficie de un baño de agua desionizada a 45 grados centígrados a medida que se adquieren. Para capturar las secciones, coloque un portaobjetos de vidrio en el agua, directamente debajo de la muestra de tejido y mueva con cuidado el portaobjetos hacia arriba en ángulo.Esta sección se pegará a la superficie del vidrio a medida que el tobogán se levante fuera del agua. Después de secar las muestras durante la noche a 37 grados centígrados, desparafinar los tejidos con tres inmersiones totales de cinco minutos en xilol al 100%. Una vez finalizadas las secciones desparafinadas, rehidratar las muestras de tejido con tres inmersiones descendentes en etanol.Seguido de un lavado de cinco minutos en agua desionizada. A continuación, sumerja las muestras en tampón EDTA hirviendo durante 10 minutos en el microondas y deje que los portaobjetos se enfríen en el tampón durante dos horas. Para el etiquetado de los antígenos de interés, enjuague las muestras con dos lavados de PBS de cinco minutos.Después del segundo lavado, incubar los tejidos con los anticuerpos primarios y el interés diluido en albúmina sérica bovina al 1% en PBS a temperatura ambiente, durante la noche. A la mañana siguiente, enjuague las secciones con tres lavados de PBS de cinco minutos e incube las muestras con los anticuerpos secundarios apropiados diluidos en suero al 1% en PBS a temperatura ambiente durante una hora. Al final de la incubación, lave los portaobjetos tres veces en PBS como se acaba de demostrar y monte los portaobjetos utilizando un medio de montaje acuoso antidecoloración que contenga una contratinción nuclear.Para analizar las muestras, primero seleccione el objetivo de 20 a 25 veces en un microscopio de fluorescencia y capture cuatro imágenes por portaobjetos utilizando los filtros apropiados para los anticuerpos secundarios y la contratinción. Guarde las imágenes a medida que se obtengan. A continuación, en el software de análisis de imágenes adecuado, abra la primera imagen de interés y haga clic en la pestaña de superposición.Seleccione la forma de línea poligonal cerrada para demarcar el límite de la región de interés. Cuando la forma está cerrada, el área de superficie de medición aparecerá junto a la región de interés. Guarde todos los datos de superficie en el archivo de hoja de cálculo para calcular las áreas de superficie promedio y los números de sonido por diapositiva.Exporte la imagen como un archivo TIFF o JPG para abrirla en ImageJ. Luego, en ImageJ, abra la primera imagen de interés y seleccione el contador de celdas en el menú de complementos. Luego, haga clic en inicializar, haga clic en escriba uno y haga clic en cada celda designada como tipo uno.Seleccione un tipo diferente para cada tipo de celda para contar el número de diferentes tipos de células en la imagen de acuerdo con la expresión de fluorocromo. Por último, registre el número de celdas analizadas en cada bandeja de contador para cada imagen en el archivo de hoja de cálculo. En este experimento representativo, se analizaron cuatro imágenes aleatorias de una serie de muestras tumorales de pretratamiento fijadas en formol e incluidas en parafina obtenidas de tumores orofaríngeos primarios, diagnosticados en el Centro Médico de la Universidad de Leiden entre 1970 y 2011, que se prepararon como se acaba de demostrar.En esta muestra experimental, se observaron algunas células autofluorescentes, que se distinguen por su apariencia amarilla completa, mientras que los portaobjetos de control negativo no mostraron ninguna tinción específica por encima de la autofluorescencia del tejido de fondo. Se determinó que todas las muestras tumorales estaban infiltradas por un número variable de células T fox p3 positivas, CD3 positivas, con solo un pequeño subconjunto de células T que expresaban IL-17. Las muestras de pacientes con un alto número de linfocitos T CD3 positivos infiltrantes totales demuestran una tendencia hacia una correlación con una mejor supervivencia libre de enfermedad en comparación con las muestras de pacientes con miembros bajos de linfocitos T.Además, en muestras con un número bajo de células IL-17 positivas, un número alto de células T infiltrantes totales también se correlaciona con una mejor supervivencia libre de enfermedad, lo que sugiere que la infiltración tumoral efectiva de las células T en el carcinoma de células escamosas orofaríngeas puede estar relacionada con el bajo número de células positivas para IL-17 presentes. Una vez dominados, estos pasos de preparación de muestras se pueden completar en un día y medio para un máximo de 25 portaobjetos por sesión de tinción. Es muy importante desparafanizar la muestra, de lo contrario obtendrás una gran cantidad de antecedentes.Tras su desarrollo, esta técnica abrió el camino a los investigadores en los campos de la patología y la inmunología. Para explorar el microambiente para la localización de diversas subpoblaciones de células inmunitarias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar varias proteínas y tipos de células en una sola sección de tejido de archivo.No olvide que trabajar con silo es muy peligroso, siempre debe trabajar en un gabinete de flujo.

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Investigación del cáncer

Aquí se describe un método para cuantificar la heterogeneidad molecular en los cortes histológicos de material tumoral mediante inmunofluorescencia cuantitativos, análisis de imágenes, y una medida estadística de la heterogeneidad. El método está pensado para su uso en el desarrollo de biomarcadores clínicos y estudios.

Mapeo de la heterogeneidad de la expresión de proteínas en los tumores utilizando inmunofluorescencia cuantitativa

Un protocolo detallado para un panel de inmunofluorescencia multiplex marcador seis es optimizado y realizado, utiliza un teñidor automático para resultados más consistentes y un menor tiempo de procedimiento. Este enfoque puede adaptarse directamente por cualquier laboratorio para estudios de inmuno-Oncología.

Panel de inmunofluorescencia Multiplex automatizado para estudios de inmuno-Oncología en los especímenes del tejido formalina-fijo Carcinoma

La hibridación in situ del ARN cromogénico del virus del papiloma humano (VPH) se considera una de las normas de oro para la detección activa de la infección por el virus del papiloma humano dentro de los tumores. Permite la visualización de la expresión de ARNm del VPH E6-E7 con localización y evaluación semicuantitativa de su señal.

Cromogénico In Situ Hybridization ss una herramienta para el diagnóstico de cáncer de cabeza y cuello relacionado con el VPH

Aquí, describimos una estrategia simple y accesible para visualizar, cuantificar y mapear células inmunitarias en secciones de tejido tumoral incrustado en parafina fija de formalina. Esta metodología combina las técnicas existentes de análisis de imágenes y digitales con el propósito de ampliar la capacidad de multiplexación y el análisis multiparámetro de ensayos de imágenes.

Visualización, cuantificación y mapeo de poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

En la era de la inmunoterapia contra el cáncer, el interés en dilucidar la dinámica del microambiente tumoral ha aumentado sorprendentemente. Este protocolo detalla una técnica de imagen de espectrometría de masas con respecto a sus pasos de tinción e imagen, que permiten un análisis espacial altamente multiplexado.

Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina

El presente protocolo describe un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN para localizar los lncRNAs en células de osteosarcoma humano.

Hibridación in situ de fluorescencia de ARN para la localización de ARN no codificante largo en células de osteosarcoma humano

Este protocolo experimental describe y optimiza un método de tinción de inmunohistoquímica múltiple (IHQ), principalmente mediante la optimización de las condiciones de incubación de anticuerpos de un solo canal y el ajuste de la configuración de anticuerpos y canales para resolver los problemas de autofluorescencia y diafonía de canales en tejidos de cáncer de pulmón de origen clínico.

Tinción inmunohistoquímica multiplex para tejido de cáncer de pulmón incluido en parafina

La inmunohistoquímica cíclica múltiple permite la detección in situ de múltiples marcadores simultáneamente mediante la incubación repetida antígeno-anticuerpo, el escaneo de imágenes y la alineación e integración de imágenes. En este trabajo se presenta el protocolo operativo para la identificación de sustratos de células inmunitarias con esta tecnología en muestras de cáncer de pulmón y metástasis cerebrales pareadas.

Inmunohistoquímica fluorescente cíclica multiplex

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Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Aprende inmunohistoquímica de fluorescencia multicolor para analizar subpoblaciones de células T en carcinoma orofaríngeo usando tejido fijado en formol y embebido en parafina. Esta técnica permite visualizar múltiples biomarcadores simultáneamente.

Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina (Video) | JoVE Journal

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