Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

El objetivo general de este procedimiento es inducir las características clínicas de la disfunción lagrimal y la inflamación de la glándula lagrimal en ratas mediante inmunización subcutánea e inyección subconjuntival e intralagrimal de extractos de glándulas lagrimales para la evaluación de terapias en el ojo seco autoinmune. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el ojo seco, como si los medicamentos que suprimen las células T en las enfermedades autoinmunes son eficaces. La principal ventaja de esta técnica es que produce signos de enfermedad ocular similares al ojo seco humano y también cuantifica las células T que infiltran la glándula lagrimal y el ojo.

Las implicaciones de este modelo animal se extienden hacia la comprensión del tráfico de linfocitos, ya que se pueden estudiar el bazo y los ganglios linfáticos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la falta de instrumentación adecuada para documentar los cambios en el ojo de la rata pequeña. La demostración visual de este método es fundamental, ya que ciertos pasos son difíciles de aprender debido al rápido secado del ojo de rata y la falta de parpadeos después de la anestesia.

Después de sacrificar a una rata Sprague Dawley hembra de acuerdo con el protocolo de texto, coloque al animal plano con una oreja contra la mesa y la otra hacia arriba. Con unas tijeras, haga una incisión de 10 milímetros de arriba a abajo de la oreja expuesta. Luego, extirpe la glándula lagrimal diseccionándola del tejido conectivo circundante y del conducto de drenaje.

A continuación, con unas tijeras, pica el pañuelo lo más finamente posible sobre hielo. A continuación, añadir 150 microlitros de PBS con 1X inhibidor de la proteasa por glándula lagrimal. Con el sonicador configurado a 10 segundos encendido, 10 segundos apagado y 30% de amplitud, sonique las muestras en hielo a 20 kilohercios durante cinco minutos.

A continuación, centrifugar las muestras sonicadas a 13.000 veces g y cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. Luego, alícuota el sobrenadante en tubos de 1,5 mililitros y guárdelos a menos 80 grados centígrados.

Transfiera el adyuvante de Freund completo que contenga cinco miligramos por mililitro de Mycobacterium tuberculosis H37Ra o el adyuvante de Freund incompleto a un tubo de 50 mililitros, asegurándose de que el volumen de adyuvante de la mezcla de antígenos esté en una proporción de uno a uno. Agregue la mezcla de antígenos que contiene dos miligramos por mililitro de ovoalbúmina y 10 miligramos por mililitro de extracto de glándula lagrimal gota a gota a la solución adyuvante mientras se agita el vórtice con la velocidad más alta que no resulte en derrame. Continúe el vórtice durante cinco minutos después de que se haya agregado todo el antígeno.

Transfiera la emulsión a una jeringa de cinco mililitros y use un conector de jeringa para conectarla con otra jeringa de cinco mililitros. Luego, empuje la emulsión de una jeringa a la otra para mezclarla. El día cero, distribuya 200 microlitros de la emulsión, que contiene un miligramo de extracto de glándula lagrimal y 200 microgramos de ovoalbúmina en el adyuvante completo de Freund, en jeringas Luer lock de un mililitro, y equipe las jeringas con agujas de calibre 27.

Sin usar anestesia, inyecte la emulsión por vía subcutánea en la base de las colas de rata. Luego, el día 14, de manera similar, inyecte 200 microlitros del mismo antígeno en el adyuvante de Freund incompleto. El mismo día, inyecte intraperitonealmente 300 nanogramos de toxina pertussis en 100 microlitros de PBS.

En el día 48, pesar la cantidad requerida de ovoalbúmina y disolverla en PBS. Luego, combine la ovoalbúmina con el extracto de glándula lagrimal descongelado preparado anteriormente en este video, haciendo una solución de antígeno que contiene un miligramo por mililitro de ovoalbúmina y un miligramo por mililitro de extracto de glándula lagrimal. Después de anestesiar a la rata, inyecte cinco microlitros de antígeno en la subconjuntiva forniceal del ojo.

A continuación, inyecte 20 microlitros de antígeno en la glándula lagrimal. Mientras sostiene una rata anestesiada de acuerdo con el protocolo de texto, para medir el volumen lagrimal con hilo rojo fenol, use un par de pinzas para sostener el hilo y otro para tirar del párpado inferior de la rata. Coloque el hilo en la esquina proximal del fórnix inferior durante un minuto y luego retire el hilo.

Luego, coloque el hilo junto a una regla con marcas milimétricas y tome una imagen de la longitud de la parte mojada del hilo. Para medir la suavidad del desgarro de la córnea, coloque a la rata bajo un microscopio estereoscópico equipado con un iluminador de anillo y una cámara. Luego, aplica cinco microlitros de solución salina en la córnea de la rata.

Con los dedos enguantados, parpadee pasivamente moviendo los párpados superior e inferior aproximadamente cinco veces para extender la solución salina. Con un aumento de 1,6 veces, enfoque el iluminador anular en el centro de la superficie de la córnea. Luego, después de 10 segundos, adquiera imágenes fotográficas.

Utilice la fluoresceína para medir el daño corneal mediante la adición de dos microlitros de fluoresceína al 0,2 % en la córnea de la rata. Con un dedo enguantado, abra y cierre pasivamente los párpados de rata tres veces para esparcir el tinte de fluoresceína en la superficie del ojo. Después de un minuto, use una jeringa de tres mililitros para extraer un mililitro de solución salina.

Luego, coloque la jeringa unos dos o tres milímetros por delante de la córnea y aplique suavemente solución salina sobre el ojo. Con la luz de fondo apagada, adquiera imágenes bajo el filtro azul cobalto de un microscopio de imágenes oculares. Después de sacrificar a la rata de acuerdo con el protocolo de texto, use tijeras para quitar los párpados superior e inferior.

Libera el globo cortando los músculos extraoculares, el nervio óptico y la conjuntiva forniceal. Haga una incisión para abrir el globo ocular. Retire el cristalino en el vítreo.

Luego, coloque los globos oculares disecados en tubos de 1,5 mililitros sobre hielo. Finalmente, recoja las glándulas lagrimales como se describió anteriormente en este video. Esta figura muestra imágenes representativas de hilos rojos de fenol de rata control y DED.

La longitud de los hilos de rojo fenol en el grupo DED es más corta que en el grupo de control, lo que indica un menor volumen de lágrima. La fluoresceína se une al epitelio corneal dañado y, por lo tanto, se utiliza para medir el grado del daño. En este experimento, las manchas de fluoresceína en la superficie de la córnea de ratas DED se clasificaron de cero a dos y se compararon con ratas de control.

Las ratas con DED tienen más tinción de fluoresceína que las ratas de control, lo que sugiere daño en la córnea. Como se ve aquí, si la superficie de la córnea es lisa con una alta estabilidad al desgarro, la imagen del anillo iluminador en la superficie ocular es redonda y perfecta. La distorsión de la imagen indica una suavidad corneal reducida y una película lagrimal inestable, como se observó en un mayor grado de distorsión en el grupo DED.

Este análisis de citometría de flujo muestra que el subconjunto de células T predominantes en los tejidos normales del globo ocular de rata son las células T efectoras de memoria. En los globos oculares de las ratas DED, aproximadamente el 70% de las células T CD3 positivas son células T de memoria efectoras, mientras que en las ratas de control este número es de aproximadamente el 50%. Después de este procedimiento, se puede realizar la tinción de otros tipos de células inmunitarias para responder preguntas adicionales.

Por ejemplo, se puede teñir para obtener células inmunitarias innatas o linfocitos B. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores comprendieran la inmunología de la superficie ocular y, más adelante, para estudiar el ojo seco en humanos y el síndrome de Sjögren. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir el ojo seco autoinmune en ratas y realizar una documentación sólida de los resultados.