Name: Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: Aprenda a inducir ojo seco autoinmune crónico en ratas mediante inmunización subcutánea e inyecciones de extracto de glándula lagrimal. Este modelo permite evaluar terapias que suprimen células T y cuantificar infiltración linfocitaria ocular.

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Los autores desean agradecer a la Sra. Tin Min Qi ya la Dra. Veluchamy Amutha Barathi ya su equipo por su ayuda en el manejo de los animales. Este trabajo fue apoyado por NHIC-I2D-1409007, Fundación SingHealth SHF / FG586P / 2014, y NMRC / CSA / 045/2012.

Los animales fueron manejados de acuerdo a las pautas institucionales y la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en la Investigación Oftálmica y de la Visión. El protocolo del estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de SingHealth. 1. Preparación del extracto de glándula lacrimal NOTA: Las ratas se anestesiaron con la inyección intraperitoneal de ketamina (75 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg). La anestesia adecuada fue confirmada por el pinzamiento de la punta y el pellizco de la cola. Se aplicó gel oftálmico a los ojos de rata para prevenir la sequedad después de cada procedimiento. Las ratas anestesiadas se colocaron bajo luces infrarrojas lejanas para mantener a los animales calientes hasta que se recuperaron completamente. Durante los procedimientos y el tiempo de recuperación, los animales fueron vigilados de cerca por los investigadores. Todos los materiales y herramientas quirúrgicas estaban estériles antes de su uso. Al final del experimento, las ratas fueron eutanasiadas por la inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg / kg).La eutanasia completa se verificó por falta de pulso cardiaco y ningún reflejo parpadeante al tocar el globo ocular. Las ratas se alojaron en condiciones estándar: temperatura ambiente, 21-23ºC; Humedad relativa, 30-70%; Ciclo luz-oscuridad, alternando 12 h (7 AM a 7 PM). <ol><li> Coloque las ratas Sprague-Dawley hembra eutanasia (rango de edades de 8 semanas a 16 semanas) de forma plana, con un oído contra la mesa y el otro hacia arriba. Haga una incisión de 10 mm superior-inferiormente bajo el oído expuesto con un par de tijeras de resorte. Retire la glándula lagrimal diseccionándola del tejido conectivo circundante y del conducto de drenaje. <ol><li> Guarde las glándulas a -80 ° C hasta que se requiera. Descongele las glándulas en hielo. Triture tan finamente como sea posible en hielo con tijeras. Añadir 150 μL de PBS con 1x inhibidor de proteasa por glándula lagrimal. </li></ol></li><li> Sonicar las muestras en hielo durante 5 min a 20 kHz con el sonicador establecido a 10 s on, 10 s off a 30% de amplitud. Centrifugar al hijoDurante 20 minutos a 13.000 xg y 4 ° C. </li><li> Pipetar el sobrenadante y transferirlo a un tubo nuevo. Alícuota del sobrenadante a tubos de 1,5 ml y almacénelos a -80 ° C. Mida la concentración de proteína con un ensayo de ácido bicinconínico 22 , según las instrucciones del fabricante. </li></ol> 2. Preparación de la emulsión y toxina de la tos ferina <ol><li> Emulsión <ol><li> Añadir 40 mg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra, eliminado por calor, en 10 ml de adyuvante de Freund completo que contiene 1 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra y mezclar bien. NOTA: El adyuvante completo de Freund contiene 5 mg / ml de Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> Pesar la ovoalbúmina, disolverla en PBS y preparar una mezcla de antígenos que contenga 2 mg / ml de ovoalbúmina y 10 mg / ml de extracto de glándula lagrimal. Con el objetivo de obtener un volumen de inyección de 200 μl para cada animal, preparar una mezcla maestra bSobre el número de animales. </li><li> Transferir el adyuvante de Freund incompleto o el adyuvante de Freund completo a un tubo de 50 ml, asegurando que el volumen de adyuvante a la mezcla de antígenos esté en una proporción de 1: 1. Añadir la mezcla de antígeno gota a gota al adyuvante mientras se agita con la velocidad más alta que no da lugar a derrames. Continuar vortexing durante 5 min después de todo el antígeno se ha añadido. </li><li> Transferir la emulsión a una jeringa de 5 ml y vincularla con otra jeringa de 5 ml a través de un conector de jeringa. Empuje la emulsión de una jeringa a la otra para mezclarla. NOTA: La emulsión está lista si una sola gotita permanece como una esfera cuando se coloca en agua. Sólo debe usarse emulsión o emulsión recién preparada almacenada durante la noche a 4ºC. </li></ol></li><li> Toxina pertussis <ol><li> Reconstituir 50 μg de toxina pertussis en 500 μl de agua para obtener una concentración final de 100 ng / μl. Votex el contenedor durante 30 s para asegurarse de que el tLa oxina se disuelve completamente. NOTA: No esterilice por filtración, ya que esto resultará en una pérdida de material. No congelar. Esta solución permanece activa durante al menos 6 meses a 4 ° C. </li><li> Diluir 100 ng / μl de toxina pertussis a 3 ng / μl usando PBS. Transferir 100 μL de la toxina de pertussis diluida a una jeringa de inyección Luer-lock de 1 ml con una aguja de 27 G. </li></ol></li></ol> 3. Inmunización de las ratas Lewis <ol><li> El día 0, mezcle la emulsión unas cuantas veces. Distribuir 200 μl de la emulsión, que contiene 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en adyuvante completo de Freund, en jeringas de 1 ml de Luer con agujas de 27G. Inyectar la emulsión subcutáneamente en la base de las colas de rata sin anestesia. NOTA: La cola no necesita ser precalentada antes de la inyección. Cada rata se inmuniza con 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en adyuvante completo de FreundH 500 μg de Mycobacterium tuberculosis H37Ra. </li><li> En el día 14, inyectar 200 μl de la emulsión, que contiene 1 mg de extracto de glándula lagrimal y 200 μg de ovoalbúmina en adyuvante incompleto de Freund, de la misma manera que el día 0. Inyectar 300 ng de toxina pertussis en 100 μl de PBS intraperitonealmente Por rata en el mismo día. </li></ol> 4. Inyección de la Mezcla de Antígenos en la Subconjuntiva Forniceal y la Glándula Lacrimal para Reclutamiento de las Células Inmunes Específicas del Antigeno y Causa de Inflamación Local <ol><li> Calcular la cantidad de ovoalbúmina y extracto de glándula lagrimal basándose en el número de ratas en el experimento. Pesar la cantidad requerida de ovoalbúmina y combinarla con el extracto de glándula lacrimal descongelado preparado en el paso 1, haciendo que la solución de antígeno contenga 1 mg / ml de ovoalbúmina y 1 mg / ml de extracto de glándula lagrimal. </li><li> Anestesiar las ratas con ketamina (75 mg / kg) y xilazina (10 mg / kg) por inyección intraperitoneal. Pellizcar elDe ratas para asegurar que se ha logrado la anestesia adecuada ( es decir, no se observa movimiento de respuesta después de la pinzadura). Inyectar 5 μl de antígeno en la subconjuntiva forniceal del ojo. Inyectar 20 μl de antígeno en la glándula lagrimal. </li></ol> 5. Evaluación de las características de los ojos secos NOTA: Para los pasos 5.1-5.3, las ratas anestesiadas deben mantenerse suavemente con una mano enguantada en posición vertical sobre una superficie plana para evitar el movimiento. <ol><li> Mida el volumen de lágrima con hilo rojo de fenol. <ol><li> Utilice un par de pinzas para sujetar el hilo y otro para tirar del párpado inferior de la rata. Coloque el hilo en la esquina proximal del fórnix inferior durante 1 minuto y luego retire el hilo. NOTA: Las lágrimas hacen que la parte húmeda del hilo sea de color rojo. </li><li> Tome una imagen de la longitud de la parte mojada del hilo junto a una regla con marcas milimétricas. Mida la longitud húmeda hasta la décima parteFa milímetro utilizando un software de imagen ( por ejemplo, ImageJ). </li></ol></li><li> Medir la lentitud de la córnea / desgarro. <ol><li> Coloque la rata bajo un estereomicroscopio equipado con un iluminador de anillo y una cámara. Aplique 5 μL de solución salina a la córnea de la rata. Parpadea pasivamente moviendo los párpados superior e inferior con los dedos enguantados ~ 5 veces para esparcir la solución salina. </li><li> Enfoque el iluminador de anillo en el centro de la superficie de la córnea con una ampliación de 1,6x. Adquirir imágenes fotográficas después de 10 s. NOTA: El iluminador de anillo proyecta dos filas circulares de imágenes de puntos en las córneas del animal. El espaciamiento regular de los puntos no distorsionados sugiere una capa córnea / lágrima lisa. </li></ol></li><li> Mida el daño corneal con tinción fluoresceína. <ol><li> Añadir 2 μl de fluoresceína al 0,2% a la córnea de la rata. Abra y cierre los párpados de la rata tres veces con un dedo enguantado para esparcir el colorante de fluoresceína en la superficie del ojo. </li><lI&gt; Después de 1 min, extraer 1 ml de solución salina con una jeringa de 3 ml (sin ningún accesorio de la aguja), colocar la jeringa unos 2-3 mm antes de la córnea, y propulsar suavemente la solución salina sobre el ojo. </li><li> Adquirir imágenes bajo el filtro azul cobalto ( es decir, ~ 400 nm) de un microscopio de imágenes oculares con las luces de fondo apagadas. NOTA: Las imágenes fueron posteriormente analizadas por un sistema de clasificación modificado de publicaciones anteriores 23 . Las imágenes se analizaron mediante la clasificación subjetiva del número, área e intensidad de las manchas verdes de 0 a 2, donde 0 indica su ausencia, 1 indica tinción puntiforme de menos de 50 puntos, y 2 indica tinción puntiforme de más de 50 puntos. </li></ol></li><li> Eutanasia de las ratas a través de la inyección intraperitoneal de pentobarbital (80 mg / kg). Quite los párpados superior e inferior usando las tijeras. Fijar y prolapso de los globos oculares empujando hacia abajo en los tejidos perioculares con fórceps. Libera el globo cortando tLos músculos extraoculares, el nervio óptico y la conjuntiva forniceal. </li><li> Fije la posición del globo ocular de la rata con fórceps y ábralo con una incisión circunferencial a lo largo del ecuador. Retire la lente y vítreo. Coloque los ojos disecados en tubos de 1,5 mL en hielo. </li><li> Recoger las glándulas lacrimales, como se describe en el paso 1.1. Trasladar inmediatamente los tejidos del globo ocular disecados y las glándulas lagrimales al laboratorio para preparar el análisis de citometría de flujo. </li><li> Aislado las células inmunes con colagenasa y dispase II métodos de digestión 24 , 25 . Proceder a utilizar la citometría de flujo para perfil de la subpoblación de células T en los tejidos del globo ocular [ 26] . Los anticuerpos anti-CD45APC-Cyanine7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Cyanine7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22), anti -CD62 PE (HRL1), anti-CD44 FITC (OX-50), y el colorante celular de viabilidad 7-AAD. Entre los CD45 + CD3 <sup&gt; + 7AAD - células de la memoria de efector (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ), naïve (CD3 + CD45RC + ) y memoria central (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) . </li></ol>

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Los autores no tienen conflictos de interés. LT recibió financiamiento previo y / o regalos de Alcon, Allergan, Santen, Bausch y Lomb, Eyelens y Eyedetec.

Un paso crítico de este protocolo es asegurar la homogeneidad de la emulsión. En emulsiones bien preparadas, los antígenos están completamente recubiertos con aceite, lo que garantiza la liberación lenta del antígeno inyectado y la estimulación inmune continua. Otra característica crítica de este protocolo es el uso de ratas Lewis. Lewis ratas son más sensibles al desarrollo de la enfermedad autoinmune que otras cepas [ 27] . Este protocolo ha sido modificado a partir de dos protocolos publicados anteriormente, que ya sea sólo lagarto glándula extracto o recombinante Klk1b22 [ 20 , 21] . En el protocolo actual, la ovoalbúmina más extracto de glándula lagrimal se utilizan como el antígeno, y las células inmunitarias específicas del antígeno se atraen a la superficie ocular y la glándula lagrimal, induciendo daño de tejido local. El ojo seco se desarrolla lentamente, alcanzando ~ 85% al ​​día 48 después de la inmunización inicial. Desafío antigénico alOjo y glándula lagrimal en el día 48 exacerba el ojo seco y asegura su cronicidad hasta el día 70. Comparado con el Klk1b22 recombinante en el modelo DED inducido por Klk, el extracto de glándula lagrimal y la ovoalbúmina usados ​​en el modelo actual son más baratos y más fáciles de obtener. El extracto de glándula lagrimal contiene también otras proteínas, aparte de Klk, que pueden inducir autoinmunidad, por lo que este extracto es teóricamente más potente que el método Klk para inducir DED. También hemos tratado de inmunizar a las ratas sólo con extracto de glándula lagrimal; Aunque estas ratas inmunizadas desarrollaron DED, no hubo un aumento significativo de las células T de memoria efectoras en tejidos del globo ocular en comparación con los controles. La limitación de esta técnica es que se tarda 70 días en alcanzar el modelo. Las células T de memoria efectoras son los subconjuntos principales de células T en el ojo normal de rata. En este modelo, DED autoinmune da lugar a un aumento en células T de memoria efectoras CD3 + en el globo ocular. Los medicamentos queSuprimen de forma eficaz las células T de memoria efectoras, tales como inhibidores selectivos del canal de potasio Kv1.3, pueden por lo tanto tener un beneficio terapéutico en el DED 28 autoinmune.

La enfermedad ocular seca (DED) es una enfermedad multifactorial de las lágrimas y la superficie ocular que resulta en síntomas de malestar, alteración visual y la inestabilidad de la película lagrimal, que puede causar daño a la superficie ocular. Se acompaña de una mayor osmolaridad de la película lagrimal y de inflamación de la superficie ocular 1 . Los síntomas asociados con DED son ardor, picadura, ronquera, sensación de cuerpo extraño, desgarro, fatiga ocular y sequedad 2 , 3 . Las dos principales causas de DED son la reducción de la producción de lágrimas por la glándula de secreción lagrimal y la evaporación excesiva de la película lagrimal 4 . En pacientes con enfermedades autoinmunes, como el síndrome de Sjögren, el lupus eritematoso sistémico y la artritis reumatoide, el daño inmune a las glándulas meibomianas reduce la expresión de lípidos esenciales para la estabilidad del desgarro. Además, el daño inmunológico a la superficie ocularDe las mucinas importantes para la humectabilidad superficial. Juntos, estos procesos acumulativamente causan el ojo seco crónico 5 , 6 , 7 . El reemplazo de lágrimas y la terapia anti-inflamatoria son los pilares de la terapia. Sin embargo, las actuales terapias anti-inflamatorias para DED ( es decir, corticosteroides y ciclosporina) son ampliamente inmunosupresoras, lo que conduce a graves efectos adversos [ 8 , 9 , 10] . Existe la necesidad de un modelo animal adecuado para ensayar nuevos agentes inmunomoduladores para tratar el ojo seco autoinmune. Los ratones con defectos genéticos específicos 11 , 12 , 13 , ratones que carecen de genes específicos 14 , 15 , y ratones transgénicos sobreexpresar inmunorreguladorOry genes se han utilizado como modelos de ojo seco autoinmune 16 , 17 . También se han descrito modelos animales autoinmunes inducidos por antígeno en ratones 18 , conejos 19 y ratas 20 , 21 . Aquí, describimos un modelo inducido por antígeno de ojo seco autoinmune crónica. Este modelo es una modificación de dos modelos anteriores; Uno usó extractos de glándula lagrimal y el segundo usó un autoantígeno ( es decir, klk1b22) de las glándulas lagrimales 20 , 21 . La enfermedad se indujo por inmunización subcutánea de ratas Lewis hembra de 6 a 8 semanas de edad con ovoalbúmina, adyuvante completo de Freund, y una emulsión que contenía extractos de glándula lagrimal de ratas Sprague-Dawley ( Figura 1 ). Una segunda inmunización con el mismo antígeno en adyuvante incompleto de Freund fueAdministrado dos semanas más tarde. Para reclutar células inmunitarias específicas de antígenos a la glándula lagrimal y la superficie ocular, se inyectó una mezcla de extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina (1 mg / ml) en la subconjuntiva forniceal y en las glándulas lacrimales de la 6ª a la 7ª semana ( Figura 1 ). Más del 85% de las ratas desarrollaron rasgos característicos del ojo seco 70 días después de la primera inmunización. Estas características incluyen la reducción de la producción de lágrimas ( Figura 2 ], el aumento de coloración de la fluoresceína corneal ( Figura 3 ], y la disminución de la estabilidad al desgarro ( Figura 4 ]. El perfil inmune de las células T en los globos oculares de ratas normales mediante citometría de flujo revela una preponderancia de células T de memoria efectora CD3 + ( Figuras 5 y 6 ). Las ratas con DED autoinmune muestran un aumento en las células T de memoria efectoras CD3 + y una disminución correspondiente en las células T naïve y de memoria central ( Figura 6 </stroNg&gt;).

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos</fuerte>cóctel de</td> inhibidores de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>la proteasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2714-1BTL</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td><td>Thermal Scientific</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37Ra&nbsp;</td><td>Becton, Dickinson y compañía</td><td>231141</td><td></td></tr><tr><td>el adyuvante completo de Freund</td><td>Becton, Dickinson y compañía</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>ovoalbúmina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-10G</td><td></td></tr><tr><td>adyuvante de Freund incompleto&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5506-6X10ML</td><td></td></tr><tr><td>toxina de la tos ferina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7208-50UG</td><td></td></tr><tr><td>solución de fluoresceína sódica</td><td>Bausch & Lomb U.K Limited</td><td>NA</td><td></td></tr><<tr><td>strong>Name</strong</td><td>>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics&nbsp;</td><td>Vibra-Cell</td><td></td></tr><tr><td>fenol hilo rojo</td><td>Tianjin Jingming Nuevo desarrollo tecnológico Co. LTD.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico NA con iluminador de luz anular y cámara</td><td>Carl Zeiss</td><td>Microscopio NA</td><td></td></tr><tr><td>Micro IV&nbsp;</td><td>Laboratorios de Investigación de Phoenix</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células t de memoria efector en tejido de globo ocular

A Chronic Autoimmune Dry Eye Rat Model with Increase in Effector Memory T Cells in Eyeball Tissue

La enfermedad de los ojos secos es una condición muy común que causa morbilidad y carga de salud y disminuye la calidad de vida. Existe la necesidad de un modelo de animal de ojo seco adecuado para ensayar terapias nuevas para tratar condiciones de ojo seco autoinmunes. Este protocolo describe un modelo de rata de ojo seco autoinmune crónico. Las ratas Lewis se inmunizaron con una emulsión que contenía extracto de glándula lagrimal, ovoalbúmina y adyuvante completo de Freund. Una segunda inmunización con los mismos antígenos en adyuvante incompleto de Freund se administró dos semanas más tarde. Estas inmunizaciones se administraron subcutáneamente en la base de la cola. Para aumentar la respuesta inmunológica en la superficie ocular y las glándulas lacrimales, se inyectaron extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina en las glándulas subconjuntivas y lagrimal forniceal 6 semanas después de la primera inmunización. Las ratas desarrollaron características de ojo seco, incluyendo producción de lágrima reducida, menor estabilidad al desgarro y mayor daño corneal. Inmune proLa presentación por citometría de flujo mostró una preponderancia de células T de memoria efectoras CD3 + en el globo ocular.

La figura 1 ilustra el diseño del experimento. Tanto en el día 48 como en el día 70, se evaluaron las características clínicas del ojo seco en las ratas inmunizadas. El volumen de lágrima está representado por la longitud de la parte húmeda del hilo rojo de fenol. La Figura 2 muestra imágenes representativas de hilos de rojo fenol de ratas control y DED. La longitud de los hilos de rojo fenol en el grupo DED es más corta que el grupo de control, indicando un menor volumen de lágrimas. La fluoresceína se une al epitelio corneal dañado. Por lo tanto, el daño de la córnea se mide mediante tinción con fluoresceína corneal. Las manchas de fluoresceína en la superficie corneal de las ratas DED se clasificaron de 0 a 2 y se compararon con las ratas de control. Las ratas con DED tienen más tinción con fluoresceína que las ratas control ( Figura 3 ), lo que sugiere daño corneal. La suavidad cornealEn las ratas DED y de control se evaluó mediante el iluminador de anillo. Si la superficie corneal es lisa, con alta estabilidad al desgarro, la imagen del anillo iluminador en la superficie ocular es redonda y perfecta. La distorsión de la imagen indica una suavidad corneal reducida y una película lagrimal inestable. El grado de distorsión del anillo se clasificó de 0 a 2. Se observó un nivel de distorsión de anillo más alto en el grupo DED ( Figura 4 ), indicando una menor estabilidad al desgarro. Las ratas se definen como tener ojo seco cuando al menos dos características clínicas del ojo seco son anormales. Entre las 24 ratas inmunizadas, 21 ratas desarrollaron DED al día 48. Los resultados fueron consistentes cuando se evaluaron al día 70. El análisis de citometría de flujo muestra que el subgrupo de células T predominante en tejidos normales de globo ocular de rata son células T de memoria efectoras ( Figura 5 ). En los globos oculares de las ratas DED, ~ 70% del CD3+ T son células T efectoras de memoria, mientras que en ratas control, este número es ~ 50%. Los globos oculares de las ratas DED tienen células T de memoria efectoras significativamente más altas que las de las ratas de control ( Figura 6 ). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig1.jpg" /> Figura 1: Esquema del Diseño Experimental. LG: glándula lagrimal; DED: enfermedad ocular seca; CFA: adyuvante completo de Freund; IFA: adyuvante incompleto de Freund. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig2.jpg" /> Figura 2: El hilo de rojo fenol mide el volumen de desgarro. El hilo rojo de fenol se coloca en la esquina proximal de ambos ojos de rata durante 1 minuto y luego se retira. RepresentativoSe muestran las imágenes del hilo rojo de fenol, junto con una regla, de los grupos control y DED. ImageJ se usó para medir la longitud de la parte húmeda de los hilos rojos de fenol. Barra de escala = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig3.jpg" /> Figura 3: Imágenes representativas del daño epitelial corneal medido por tinción con fluoresceína. Cada córnea de rata se tiñó con fluoresceína al 0,2% durante 1 min y se enjuagó con al menos 1 ml de solución salina. Las imágenes fueron tomadas bajo un microscopio de imágenes oculares con luz azul cobalto. La primera columna muestra imágenes representativas de las córneas de control. La segunda columna contiene imágenes representativas de tinción corneal de ratas con características de DED. Los puntos fluorescentes verdes indican epitelio corneal<html> L daño. Todas las imágenes fueron producidas en la misma escala de color. La cuantificación de la tinción con fluoresceína se realizó de acuerdo con el área y la densidad de las manchas verdes. Barra de escala = 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig4.jpg" /> Figura 4: Imágenes representativas de la córnea que muestran la reflexión del iluminador del anillo. La lentitud corneal / lágrima de la rata se midió mediante un iluminador de anillo. El grado de distorsión del anillo en las imágenes capturadas es una medida de la estabilidad relativa del desgarro. La columna de la izquierda muestra las imágenes representativas en los animales de control, y la columna de la derecha muestra imágenes representativas después de la inducción del ojo seco. Barra de escala = 1 mm.Ank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig5.jpg" /> Figura 5: Gráficos de puntos derivados del análisis de citometría de flujo. Las células T aisladas de tejidos del globo ocular se tiñeron con un panel de anticuerpos. En la CD45 + CD3 + 7AAD - población, CD3 + 7-AAD - T células fueron cerradas. Entre las células T CD3 + 7-AAD, se determinaron las poblaciones de linfocitos T de memoria central, y de memoria efectoras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55592/55592fig6.jpg" /> Figura 6: Perfil de subpoblación de células T en los globos oculares. CD3 + CD45RC+ Células T CD3 + CD45 - CD44 + CD62L - memoria T efectoras T (T EM ) y células CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + de memoria central T (T CM ) se presentan como el porcentaje de células T CD3 + . Los resultados son de 3 ratas de control y 6 de DED ratas. Se obtuvieron resultados similares a partir del análisis de células T de glándulas lacrimales aisladas (datos no mostrados). Se utilizó la prueba t de Student para la comparación estadística. Las barras de error representan el SD. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55592/55592fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este informe describe un método para inducir ojo seco autoinmune crónico en ratas Lewis mediante inmunización con una emulsión de extracto de glándula lacrimal de rata, ovoalbúmina y adyuvante completo de Freund, seguido de la inyección de extracto de glándula lagrimal y ovoalbúmina en la subconjuntiva forniceal y glándulas lacrimales Seis semanas después.

Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

Dry eye disease is a very common condition that causes morbidity and healthcare burden and decreases the quality of life. There is a need for a suitable ...

El objetivo general de este procedimiento es inducir características clínicas de disfunción lagrimal y de inflamación de la glándula lagrimal en ratas mediante inmunización subcutánea e inyección subconjuntival y en la glándula lagrimal de extractos de glándula lagrimal, para la evaluación de terapias en ojo seco autoinmune. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el ojo seco, como si los fármacos que suprimen los linfocitos T en enfermedades autoinmunes son eficaces. La principal ventaja de esta técnica es que produce signos de enfermedad ocular similares al ojo seco humano y también cuantifica los linfocitos T que infiltran la glándula lagrimal y el ojo.Las implicaciones de este modelo animal se extienden hacia la comprensión del tráfico de linfocitos, ya que se pueden estudiar el bazo y los ganglios linfáticos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades debido a la falta de instrumentos adecuados para documentar los cambios en el ojo pequeño de la rata. La demostración visual de este método es fundamental, ya que ciertos pasos son difíciles de aprender debido al secado rápido del ojo de la rata y a la ausencia de parpadeo tras la anestesia.Después de sacrificar una rata hembra Sprague Dawley según el protocolo descrito, coloque el animal boca arriba con una oreja contra la mesa y la otra orientada hacia arriba. Con un par de tijeras, realice una incisión de 10 milímetros de superior a inferior por debajo de la oreja expuesta. A continuación, retire la glándula lagrimal disecándola del tejido conectivo circundante y del conducto de drenaje.A continuación, usando tijeras, pique el tejido lo más finamente posible sobre hielo. Luego, agregue 150 microlitros de PBS con inhibidor de proteasas al 1X por glándula lagrimal. Con el sonicador ajustado a 10 segundos encendido, 10 segundos apagado y amplitud del 30%, sonique las muestras sobre hielo a 20 kilohercios durante cinco minutos.Luego, centrifugue las muestras sonicadas a 13.000 × g y cuatro grados Celsius durante 20 minutos. Transfiera el sobrenadante a un tubo nuevo. A continuación, alícuote el sobrenadante en tubos de 1,5 mililitros y almacénelos a menos 80 grados Celsius.Transfiera el adyuvante completo de Freund que contiene cinco miligramos por mililitro de Mycobacterium tuberculosis H37Ra o el adyuvante incompleto de Freund a un tubo de 50 mililitros, asegurándose de que el volumen de adyuvante respecto a la mezcla de antígeno esté en una proporción uno a uno. Añada la mezcla de antígeno que contiene dos miligramos por mililitro de ovoalbúmina y 10 miligramos por mililitro de extracto de glándula lagrimal, gota a gota, a la solución de adyuvante mientras se mezcla en vórtex a la velocidad más alta que no provoque derrames. Continúe mezclando en vórtex durante cinco minutos después de que se haya añadido todo el antígeno.Transfiera la emulsión a una jeringa de cinco mililitros y utilice un conector de jeringa para unirla a otra jeringa de cinco mililitros. A continuación, pase la emulsión de una jeringa a la otra para mezclarla. En el día cero, distribuya 200 microlitros de la emulsión, que contiene un miligramo de extracto de glándula lagrimal y 200 microgramos de ovoalbúmina en adyuvante completo de Freund, en jeringas Luer lock de un mililitro, y equipe las jeringas con agujas de calibre 27.Sin usar anestesia, inyecte por vía subcutánea la emulsión en la base de las colas de las ratas. Luego, en el día 14, inyecte de manera similar 200 microlitros del mismo antígeno en adyuvante de Freund incompleto. En el mismo día, inyecte por vía intraperitoneal 300 nanogramos de toxina pertúsica en 100 microlitros de PBS.El día 48, pese la cantidad necesaria de ovoalbúmina y disuélvala en PBS. Luego, combine la ovoalbúmina con el extracto de glándula lagrimal descongelado preparado anteriormente en este video, obteniendo una solución de antígeno que contenga un miligramo por mililitro de ovoalbúmina y un miligramo por mililitro de extracto de glándula lagrimal. Después de anestesiar la rata, inyecte cinco microlitros de antígeno en la subconjuntiva fórniceal del ojo.Luego, inyecte 20 microlitros de antígeno en la glándula lagrimal. Mientras sostiene una rata anestesiada según el protocolo descrito en el texto, para medir el volumen de lágrima con hilo de rojo fenol, utilice un par de pinzas para sostener el hilo y otro par para tirar del párpado inferior de la rata. Coloque el hilo en la esquina proximal del fórnix inferior durante un minuto, y luego retire el hilo.Luego, coloque el hilo junto a una regla con marcas milimétricas y tome una imagen de la longitud de la parte humedecida del hilo. Para medir la suavidad de las lágrimas en la córnea, coloque la rata bajo un microscopio estereoscópico equipado con un iluminador anular y una cámara. A continuación, aplique cinco microlitros de solución salina en la córnea de la rata.Con los dedos enguantados, parpadear pasivamente moviendo los párpados superior e inferior aproximadamente cinco veces para extender la solución salina. Bajo una ampliación de 1,6 veces, enfocar el iluminador anular en el centro de la superficie de la córnea. Luego, después de 10 segundos, adquirir imágenes fotográficas.Utilice el barrido con fluoresceína para medir el daño corneal, agregando dos microlitros de fluoresceína al 0,2 % a la córnea de la rata. Con un dedo enguantado, abra y cierre pasivamente los párpados de la rata tres veces para distribuir el colorante de fluoresceína sobre la superficie del ojo. Después de un minuto, use una jeringa de tres mililitros para extraer un mililitro de solución salina.Luego, coloque la jeringa aproximadamente de dos a tres milímetros anterior a la córnea y aplique suero salino suavemente sobre el ojo. Con la luz de fondo apagada, adquiera imágenes bajo el filtro azul de cobalto de un microscopio de imagen ocular. Después de sacrificar la rata según el protocolo descrito en el texto, use tijeras para retirar los párpados superior e inferior.Suelte el globo ocular seccionando los músculos extraoculares, el nervio óptico y la conjuntiva de fondo de saco. Haga una incisión para abrir el globo ocular. Retire el cristalino en el vítreo.Luego, coloque los ojos disecados en tubos de 1,5 mililitros sobre hielo. Finalmente, recolecte las glándulas lagrimales como se describió anteriormente en este video. Esta figura muestra imágenes representativas de los hilos de rojo de fenol de ratas control y con queratoconjuntivitis sicca (DED).La longitud de los hilos de rojo de fenol en el grupo con DEH es más corta que en el grupo control, lo que indica un menor volumen lagrimal. La fluoresceína se une al epitelio corneal dañado y, por lo tanto, se utiliza para medir el grado de daño. En este experimento, las manchas de fluoresceína en la superficie corneal de ratas con DEH se calificaron de cero a dos y se compararon con las de ratas control.Las ratas con DE tienen más tinción con fluoresceína que las ratas control, lo que sugiere daño corneal. Como se observa aquí, si la superficie corneal es lisa y con alta estabilidad lagrimal, la imagen del anillo iluminador sobre la superficie ocular es redonda y perfecta. La distorsión de la imagen indica una menor suavidad corneal y una película lagrimal inestable, tal como se observó con un grado mayor de distorsión en el grupo con DE.Este análisis de citometría de flujo muestra que el subconjunto predominante de linfocitos T en tejidos normales del globo ocular de rata son linfocitos T de memoria efectora. En los globos oculares de ratas con DED, aproximadamente el 70 % de los linfocitos T positivos para CD3 son linfocitos T de memoria efectora, mientras que en ratas control esta cifra es de aproximadamente el 50 %. Los globos oculares de ratas con DED tienen una proporción significativamente mayor de linfocitos T de memoria efectora que los de ratas control. Tras seguir este procedimiento, se puede realizar la tinción para otros tipos de células inmunitarias para responder preguntas adicionales.Por ejemplo, se puede teñir para células inmunitarias innatas o linfocitos B. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores comprendieran la inmunología de la superficie ocular y, además, estudiar el ojo seco en humanos y el síndrome de Sjögren. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir ojo seco autoinmune en ratas y cómo realizar una documentación rigurosa de los resultados.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica para inducir la enfermedad crónica experimental autoinmune del ojo seco en ratas. Al inyectar una emulsión adyuvante de antígenos que contiene autoantígenos y antígenos extraños en una rata a intervalos predefinidos, se induce una inflamación ocular crónica en la rata inmunizada inyectando los mismos antígenos en los tejidos de la superficie ocular.

Una técnica para inducir el ojo seco autoinmune crónico experimental en ratas

Sin usar anestesia, inyecte la emulsión por vía subcutánea en la base de las colas de rata. Luego, el día 14 de manera similar, inyecte 200 microlitros del mismo antígeno y el adyuvante de Freund incompleto. El mismo día, inyecte intraperitonealmente 300 nanogramos de toxina pertussis en 100 microlitros de PBS.

Este video muestra la prueba del hilo rojo fenol para determinar el volumen de lágrimas en un modelo autoinmune de rata de ojo seco. El hilo rojo de fenol ácido sensible al pH cambia de color cuando entra en contacto con las lágrimas alcalinas. La menor longitud del cambio de color en el hilo rojo fenol corresponde a un menor volumen de lágrima.

Cuantificación del volumen lagrimal en un modelo autoinmune de rata de ojo seco utilizando el hilo rojo fenol

Este video muestra un método para evaluar la suavidad de la córnea y la estabilidad de la película lagrimal en un modelo de rata autoinmune. Destaca el impacto de la disfunción de la glándula en la estabilidad de la película lagrimal, crucial para comprender la enfermedad del ojo seco.

Evaluación de la suavidad de la córnea y la lágrima en un modelo autoinmune de rata de ojo seco

Este video muestra la tinción de la córnea dañada utilizando tinte fluoresceína para evaluar el alcance de la enfermedad autoinmune del ojo seco en un modelo de rata. Las manchas verdes de fluorescencia de las fibras de colágeno teñidas indican células epiteliales corneales dañadas.

Tinción con fluoresceína en un modelo de rata autoinmune con ojo seco para examinar el daño corneal

Este artículo describe el desarrollo de un método para inducir la enfermedad aguda o crónica del ojo seco en conejos mediante la inyección de concanavalina A a todas las porciones del sistema de glándulas lagrimales orbitales. Este método, superior a los ya reportados, genera un modelo reproducible y estable de ojo seco adecuado para el estudio de agentes farmacológicos.

Un modelo de conejo de enfermedad ocular seca acuosa-deficiente inducida por la inyección de Concanavalin A en las glándulas lagrimales: Aplicación a estudios de eficacia de fármacos

En este informe presentamos un protocolo que permite al investigador generar un modelo murino de uveítis intraocular. Más comúnmente conocida como uveítis autoinmune experimental (EAU), este modelo establecido captura muchos aspectos de la enfermedad humana. Aquí, describiremos cómo inducir y monitorear la progresión de la enfermedad utilizando varias lecturas.

Uveítis autoinmune experimental: un modelo de ratón inflamatorio intraocular

Aquí, establecemos un modelo de rata de disfunción de la glándula lagrimal para proporcionar una base para el estudio del ojo seco con deficiencia acuosa.

Un modelo de ojo seco de rata con disfunción de la glándula lagrimal inducida por escopolamina

Aquí, presentamos un método para establecer un modelo de ratón de ojo seco acuoso-deficiente mediante la extirpación de las glándulas lagrimales extraorbitarias e infraorbitarias y evaluar los cambios en la superficie ocular en el ojo seco por deficiencia acuosa.

Establecimiento de un modelo de ratón de deficiencia acuosa de ojo seco

Aprenda a inducir ojo seco autoinmune crónico en ratas mediante inmunización subcutánea e inyecciones de extracto de glándula lagrimal. Este modelo permite evaluar terapias que suprimen células T y cuantificar infiltración linfocitaria ocular.

Un modelo de rata ocular seca autoinmune crónica con aumento de células T de memoria efector en tejido de globo ocular

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