Name: Uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Aprende a fabricar biosensores de transmisión óptica extraordinaria para detectar troponina cardíaca en suero humano. Este método de litografía por nanoimpresión permite diagnósticos de punto de atención sin equipos ópticos complejos.

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AP agradece el apoyo de Prof T Venkatesan, Director, NUS Nanociencia y nanotecnología iniciativa y oficina del Presidente del diputado (Universidad Nacional de Singapur) (R-398-000-084-646). CLD reconoce el apoyo de la Singapur Ministerio de salud nacional Consejo de investigación médica bajo su médico científico esquema de financiación, NMRC/CSA/035/2012 y la Universidad Nacional de Singapur. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito.

1. fabricación de los sensores y adquisición de los datos
<ol>
	<li>Preparación del molde de níquel
	<ol>
		<li>Capa una capa de nm de grosor 220 de haz de electrones negativos resistir en una oblea de 600 μm de espesor 4 en silicio. Escriba la matriz nanohole diseñado sobre esta oblea mediante un sistema de litografía de haz de electrón.<ol>
			<li>Para acelerar el haz e escribir, escribir los patrones con un dotmap bajo (N) de 20k para cada tamaño de campo de 300 μm (A) (es decir, allí son 0,4 billones puntos asignados en cada área de2 300 μm, y cada punto o bien ser expuesto por e-beam o no dependiendo del diseño del patrón). La dosis de exposición de resistir e la viga para resistir a μC 110 cm−2 y escribir a una corriente (I) de 800 PA. Nota: En la escritura de e-beam, la dosis de exposición (D) es controlada por el tiempo de exposición para cada punto (puntode T), calculada por <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/55597/55597eq1.jpg"> </img>. Para la dosis de exposición a 110 μC cm−2, el tiempo de vivienda e la viga en cada punto expuesto es 0,5 μs12. Puesto que la matriz de captura un área de 1,8 mm2, hay un total de 36 parches de 300 μm2 zonas suturan a forma un array de nanohole grande, oro.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Desarrollar la resistencia sumergiendo la oblea de silicio de 4 pulgadas en la solución de revelado para 10 s y dejando la oblea seca en aire.</li>
		<li>Depositar una capa de la semilla de un metal, tales como níquel, cobre o aluminio, en la oblea de silicio.</li>
		<li>Electrochape la oblea en un sistema de revestimiento en un baño de Sulfamato de níquel. Llevar a cabo la electrodeposición en dos pasos. En el primer paso, duración 95 min, utilizar una densidad de corriente de 0.7 A dm−2; esta completamente llena la nanopatrones níquel. En el segundo paso, duración 125 minutos, utilizar 12 A dm−2 para llegar a 300 μm como el espesor de molde final níquel (20 nm). Que el valor de pH a 3.5-3.8 y que la temperatura es entre 52 y 54 ° C.</li>
		<li>Separar el molde de níquel del substrato de silicio mediante la aplicación de fuerza mecánica suave. Sumerja el molde de níquel en 100 mL de reactivo de retiro photoresist positivo durante la noche para lavar el residuo de resistir e-beam.</li>
		<li>El molde de níquel de alimento en un horno y seco a 100 ° C para 3 h limpiar en un plasma aguafuerte sistema con gas de2 O a 10 sccm y 100 W durante 3 minutos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fabricación de la nanoestructura oro
	<ol>
		<li>150 μL de heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrodecyl triclorosilano (FDTS) de la capa en el molde de níquel en una uno mismo-montaje máquina de capa de monocapa (SAM) a 80 ° C. Nota: Esto formará una capa de anti-pegamento, que permitirá la separación del molde de la fotoresistencia ("desmoldeo") después de completar el paso de nanoimprinting. El tiempo de vaporización debe ser 180 s y el tiempo de reacción debe ser 900 s.</li>
		<li>Pie de imprenta nanopatrones sobre un 4 - en oblea de vidrio que ha sido recubierta con una capa de nm de espesor 300 de foto-curable NIL resistir utilizando a un imprinter nano a una presión de 10 bar y una temperatura de 40 ° C durante 10 minutos.</li>
		<li>Transferir el molde, la fotoprotección y la oblea del vidrio a la luz UV curado sistema y photocure con 75 mW cm-2 de la exposición UV de 30 s. Nota: Si se han seguido todos los pasos correctamente, el molde de níquel debe fácilmente ser demolded de la fotoresistencia.</li>
		<li>En un ion reactivo aguafuerte sistema (RIE), realizar un etch en blanco de la fotoresistencia en el substrato de cristal, con un flujo de gas de2 O de 10 sccm, 50 W 2 s para exponer el vidrio en las áreas de sangrado.</li>
		<li>Depositar una capa de nm de espesor 5 de cromo (Cr) para la adherencia del metal y una capa de 100 nm de oro (Au) para el sensor plasmónica en la oblea del vidrio en una máquina de deposición de haz de electrones. Utilice una tasa de deposición de 1 Å s−1 para Cr y 2 Å s−1 para Au.</li>
		<li>Realizar el despegue de la fotoresistencia por plasma de2 O grabado por 3 min, seguida por un paso de Sonificación del 15-s en acetona.</li>
		<li>Cortar la muestra en fichas de 5 x 5 mm. La matriz nanohole ocupará la central 2 mm × 2 mm de la viruta.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Adquisición de los datos
	<ol>
		<li>Configurar el aparato para realizar mediciones ópticas tal que un haz de luz blanca que sale a través del extremo de la fibra óptica de transmisor es colimado y es incidente sobre la superficie del sensor (nanohole array) a 90°. Nota: La luz es transmitida a través de la matriz nanohole todo.</li>
		<li>Recoger la señal transmitida con el receptor de fibra óptica y grabarlo con un espectrómetro UV-visible de funcionamiento dentro de la gama de 300 a 1000 nm.</li>
		<li>Configurar el tiempo de adquisición para cada fotograma a 20 ms. promedio 100 marcos para obtener el espectro final para reducir el ruido en las mediciones.</li>
		<li>Utilizar software de trazado para analizar los datos basándose en los picos de transmisión previamente identificado (utilizando un método basado en Lorentz).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. sensor prueba de sensibilidad a granel
<ol>
	<li>Depositar el líquido estándar de la RI en la célula del líquido, con el RI varía de 1.31 a 1,39.</li>
	<li>Sumerja la viruta del sensor en el estándar líquido de RI y alinearse con el haz de luz blanca. Obtener el espectro de transmisión.</li>
	<li>Limpiar la viruta del sensor después de cada medición con un reactivo de limpieza tensoactivos y secarla con gas nitrógeno.</li>
</ol>
3. sensor modificación superficial
<ol>
	<li>Antes de las modificaciones químicas, limpie las virutas del sensor por inmersión secuencial en isopropanol, acetona y agua desionizada. Seco a temperatura ambiente en una corriente de gas nitrógeno seco.</li>
	<li>Incubar las virutas del sensor en una solución de etanol de 0,4 mM 10-carboxi-1-decanethiol y 1,6 mM 1-octanethiol de 12 h a temperatura ambiente. Nota: Esto formará una amina reactiva autoensamblaje monocapa (SAM).</li>
	<li>Utilizar el etanol para enjuagar bien y secar a temperatura ambiente.</li>
	<li>Hacer una mezcla de 75 mM sulfo-N-hydroxysuccinimide (sulfo-NHS) y 15 mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimida (EDC). Sumerja las fichas en esta mezcla durante 15 minutos. Nota: Esto activará el grupo carboxílico del SAM.</li>
	<li>Spot 50 μl de 200 solución de anticuerpo anti-troponina μg/mL en un tampón de acetato pH 4.5 en la superficie del sensor e incubar durante 30 minutos.</li>
	<li>Desactivar los ésteres sumergiendo la viruta del sensor en la solución de etanolamina-HCl de 1 M durante 15 min.</li>
	<li>Enjuague el chip con agua desionizada y secar en una corriente de gas nitrógeno seco a temperatura ambiente.</li>
</ol>
4. ensayo de cTnI
<ol>
	<li>Bloquear cualquier atascamiento no específico telescopio 100 μl de solución de albúmina de suero bovino (BSA) de 1% sobre la superficie.</li></ol>Incubar durante 15 minutos.
	<li>Enjuague las virutas del sensor tres veces con tampón fosfato una solución salina (PBS). Inserte el chip en la celda de medición para registrar el espectro de transmisión. Nota: Este es el espectro de referencia.</li>
	<li>Spot 50 μl de estándar sobre la superficie del chip de cTnI e incubar en un ambiente húmedo durante 30 minutos.</li>
	<li>Enjuague las virutas del sensor tres veces en solución de PBS e introducirlo en la celda de medición para registrar el espectro de transmisión. Nota: Este es el espectro de enlace después.</li>
	<li>Sumerja las virutas en 50 mM glicina-HCl (pH 2) durante 1 minuto y luego enjuague en solución de PBS tres veces para regenerar la superficie del chip. Medir el espectro de transmisión en PBS para verificar el éxito de la etapa de regeneración.</li>

5. medición de resonancia (SPR) de plasmón superficial
<ol>
	<li>Ejecutar el chip de sensor SPR multiplexado en el sistema SPR con tampón PBS-T. Nota: La composición del tampón de PBS-T es fosfato de Na de 20 mM, 150 mM NaCl y 0.05% Tween 20. El pH es 7.4.</li>
	<li>Utilizar estándar de cTnI y el anticuerpo, como se describe en el paso 4.</li>
	<li>Activar 3 de los 6 canales disponibles con una mezcla de (0,2 M) de EDC y sulfo-NHS (0,05 M) por 5 min realizar una inyección de 5 min de 50 μg/mL de anticuerpo 560 y una inyección de 5 min de la solución de etanolamina-HCl de 1 M.</li>
	<li>Girar 90° la viruta del sensor e inyectar los estándares de cTnI a diferentes concentraciones (75 30, 7.5 y 2.5 ng/mL).</li>
	<li>Observa la conjugación del anticuerpo en los puntos de interacción en el chip en tiempo real a través de la lectura de la SPR.</li>
	<li>Regenerar el chip mediante la inyección de 50 mM glicina-HCl (pH 2) durante 1 minuto.</li>
</ol>

<ol><li>Ebbesen, T. W., Lezec, H. J., Ghaemi, H., Thio, T., Wolff, P. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nature/journal/v391/n6668/abs/391667a0.html">Extraordinary optical transmission through sub-wavelength hole arrays.</a> Nature. 391 (6668), 667-669 (1998).</li>
<li>Krishnan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0030401801015589">Evanescently coupled resonance in surface plasmon enhanced transmission.</a> Optics Comm. 200 (1), 1-7 (2001).</li>
<li>Yang, J. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+optical+transmission+mediated+by+localized+plasmons+in+anisotropic%2C+three-dimensional+nanohole+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+letters%22%5BJournal%5D)">Enhanced optical transmission mediated by localized plasmons in anisotropic, three-dimensional nanohole arrays.</a> Nano letters. 10 (8), 3173-3178 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., Moyer, P. J. <a target="_blank" href="http://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.2355468?journalCode=apl">Transmission characteristics of metallic equilateral triangular nanohole arrays.</a> Appl Phys Lett. 89 (12), 121106(2006).</li>
<li>Liu, H., Lalanne, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscopic+theory+of+the+extraordinary+optical+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microscopic theory of the extraordinary optical transmission.</a> Nature. 452 (7188), 728-731 (2008).</li>
<li>Shon, Y. -S., Choi, H. Y., Guerrero, M. S., Kwon, C. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s11468-009-9079-1">Preparation of nanostructured film arrays for transmission localized surface plasmon sensing.</a> Plasmonics. 4 (2), 95-105 (2009).</li>
<li>Xiang, G., Zhang, N., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+surface+plasmon+resonance+biosensing+with+large+area+of+gold+nanoholes+fabricated+by+nanosphere+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Res+Lett%22%5BJournal%5D)">Localized surface plasmon resonance biosensing with large area of gold nanoholes fabricated by nanosphere lithography.</a> Nanoscale Res Lett. 5 (5), 818(2010).</li>
<li>Valsecchi, C., Brolo, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Periodic+metallic+nanostructures+as+plasmonic+chemical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Periodic metallic nanostructures as plasmonic chemical sensors.</a> Langmuir. 29 (19), 5638-5649 (2013).</li>
<li>Gates, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+approaches+to+nanofabrication%3A+molding%2C+printing%2C+and+other+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">New approaches to nanofabrication: molding, printing, and other techniques.</a> Chem Rev. 105 (4), 1171-1196 (2005).</li>
<li>Guo, L. J. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adma.200600882/abstract">Nanoimprint lithography: methods and material requirements.</a> Adv Mater. 19 (4), 495-513 (2007).</li>
<li>Wong, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+high+yield+nanofabrication+of+precisely+designed+gold+nanohole+arrays+for+fluorescence+enhanced+detection+of+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">High throughput and high yield nanofabrication of precisely designed gold nanohole arrays for fluorescence enhanced detection of biomarkers.</a> Lab on a Chip. 13 (12), 2405-2413 (2013).</li>
<li>Deng, J., Wong, T. I., Sun, L. L., Quan, C., Zhou, X. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167931716303975">Acceleration of e-beam lithography by minimized resist exposure for large scale nanofabrication.</a> Microelect Eng. 166, 31-38 (2016).</li>
<li>Wu, L., Bai, P., Li, E. P. <a target="_blank" href="https://www.osapublishing.org/josab/abstract.cfm?uri=josab-29-4-521">Designing surface plasmon resonance of subwavelength hole arrays by studying absorption.</a> JOSA B. 29 (4), 521-528 (2012).</li>
<li>Ding, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+a+cardiac+biomarker+in+human+serum+using+extraordinary+optical+transmission+%28EOT%29%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Quantification of a cardiac biomarker in human serum using extraordinary optical transmission (EOT).</a> PloS one. 10 (3), 0120974(2015).</li>
<li>Im, H., Sutherland, J. N., Maynard, J. A., Oh, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanohole-based+surface+plasmon+resonance+instruments+with+improved+spectral+resolution+quantify+a+broad+range+of+antibody-ligand+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanohole-based surface plasmon resonance instruments with improved spectral resolution quantify a broad range of antibody-ligand binding kinetics.</a> Anal Chem. 84 (4), 1941-1947 (2012).</li>
<li>Bhagawati, M., You, C., Piehler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+imaging+of+protein-protein+interactions+by+LSPR+detection+with+micropatterned+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time imaging of protein-protein interactions by LSPR detection with micropatterned gold nanoparticles.</a> Anal Chem. 85 (20), 9564-9571 (2013).</li>
</ol>

Los autores tienen intereses financieros que compiten.

Simulación de la interacción entre la luz del incidente y las nanoestructuras permite identificar el pico correspondiente (en el espectro de transmisión), cuyo cambio puede grabarse como una función de la concentración del analito. Es importante tener en cuenta que la localización de las bandas con respecto a la estructura del sensor es fundamental para la elección de la banda derecha, cuyo cambio puede realizar un seguimiento para detectar el analito. La visualización se logra a través de simulaciones. Esto también es f...

Sensores químicos basados en arreglos de discos de nanohole han sido objeto de numerosas investigaciones desde que se publicó el primer informe sobre transmisión óptica extraordinaria (EOT) por Ebbesen et en 19981. Cuando la luz incide sobre arreglos periódicos de nanohole estructuras de dimensiones sub-longitud de onda, mayor la transmisión ocurre a longitudes de onda específicas. Esto ocurre cuando la luz del incidente parejas con onda de Bloch superficie polaritones (BW-SPP) o localizada plasmones de superficie (LSP)2.
El principio físico subyacente aprovechado cuando biodetección con tales matrices periódicas es simple. Adsorción de moléculas sobre o cercana a la interfase del metal cambia la constante dieléctrica del medio en contacto con el metal, a su vez cambiando la ubicación de las bandas de transmisión en el espectro. El espectro se puede ajustar por nano-ingeniería de la forma, tamaño y separación distancia3,4,5. Por diseño, sensores basados en EOT tienen bandas características en sus espectros que facilitan tareas específicas6,7,8 durante la investigación de eventos de enlace molecular. Esto es una ventaja crucial sobre plataformas de resonancia (SPR) de plasmón superficial disponible en el mercado.
Sensores con EOT típicamente involucran una fuente de luz alineada ópticamente tal que un haz colimado es incidente sobre la superficie de detección. Técnicas para generar nanohole grandes superficies, como plantillas de copolímero e interferencia y litografía nanosphere, tienen pobre reproducibilidad9. Debido a estas limitaciones en la fabricación precisa de grandes superficies que muestran el fenómeno EOT, un microscopio óptico fue requerido para posicionar correctamente el detector y la fuente de luz. Para simplificar la técnica, la litografía de alta calidad nanoimprinting fue empleado (NIL)10 . Esto permitió la producción de sensores grandes superficies11 (escala de mm), eliminando la necesidad de un microscopio buscar la superficie de detección en un chip. En cambio, este sensor se podría interconectar fácilmente con un cable óptico de fibra estándar.
Desde los picos de transmisión para esta matriz nanohole están contenidos en el espectro visible a la región del infrarrojo cercano (NIR), se adapta perfectamente a la detección de eventos de enlace de biomoléculas en un ambiente acuoso. Se simuló el comportamiento óptico de la matriz nanohole. El resultado entonces se verificó a través de estudios con líquidos estándar índices de refracción (RI). Esta matriz entonces fue utilizada para medir la concentración de troponina cardíaca I (cTnI) en el complejo fondo de suero humano. cTnI es el criterio clínico para el diagnóstico de infarto agudo de miocardio.
Con este sensor, es posible detectar y cuantificar la cTnI en suero humano en un límite de detección (LOD) de 0.55 ng/mL, que es clínicamente relevante. La detección es mucho más rápida que la más utilizada la tecnología en este dominio, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Además, la superficie de detección puede fácilmente ser regenerada y por lo tanto reutilizados. Por lo tanto, este trabajo demuestra la promesa de nanohole matrices como viable tecnología point-of-care (POC) para biodetección en biofluidos complejo.

<table><tbody><tr><td>Configuración de litografía por haz de electrones</td><td>Elionix ELS 700</td><td></td><td></td></tr><tr><td>o-Xileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>95662</td><td></td></tr><tr><td>EB resist</td><td>Sumitomo</td><td>NEB-22A2</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo revelador</td><td>Shipley Company</td><td>Microposit MF 321</td><td></td></tr><tr><td>Máquina de galvanoplastia</td><td>Technotrans AG RD 50</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Decapante fotorresistente&nbsp;</td><td>Materiales electrónicos de Rohm y Haas&nbsp; LLC</td><td>Microposit Remover 1165</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de grabado</td><td>Trion Phantom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heptadecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrodecil)triclorosilano&nbsp;</td><td>Gelest (PA, EE. UU.)</td><td>78560-44-8</td><td></td></tr><tr><td>Recubridor SAM&nbsp;</td><td>Sorona Inc.</td><td>AVC 150M</td><td></td></tr><tr><td>fotocurable NIL resist</td><td>micro resist technology GmbH</td><td>mr-UVCur21-300nm</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de fotocurado</td><td>Dymax&nbsp;</td><td>Modelo 2000 Flood Máquina</td><td></td></tr><tr><td>de deposición de haz E</td><td>E</td>, espectrómetro UV-visible Denton Explorer<td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Óptica oceánica HR2000+ (Dunedin, FL, EE. UU.)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Líquidos con índice de refracción estándar&nbsp;</td><td>Cargill Inc (Cedar Grove, EE. UU.)</td><td>18032</td><td></td></tr><tr><td>Software de trazado</td><td>Origin</td><td>Origin Pro 9</td><td></td></tr><tr><td>10-carboxi-1-decanethiol&nbsp;</td><td>Laboratorios Dojindo (Japón)</td><td>C385-10</td><td></td></tr><tr><td>1-octanethiol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, MO, EE. UU</td><td>. 471386</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-N-hidroxisuccinimida y 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida&nbsp;</td><td>BioRad (CA, EE. UU.)</td> <td>1762410</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-troponina 560</td><td>Hytest (Finlandia)</td><td>4T21</td><td></td></tr><tr><td>Solución de etanolamina-HCl</td><td>BioRad (CA, EE. UU.)</td> <td>1762450</td><td></td></tr><tr><td>Configuración de resonancia de plasmón de superficie</td><td>BioRad XPR36 (Haifa, Israel)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chip SPR multiplexado</td><td>BioRad</td><td>GLC</td><td></td></tr><tr><td>Estándar de cTnI humano</td><td>Phoenix Productos farmacéuticos</td><td>EK -311-05</td><td></td></tr><tr><td>Glicina-HCl</td><td>BioRad (CA, EE. UU.)</td><td>1762221</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Para que una plataforma de biosensores para tener importancia clínica en ajustes de point-of-care (POC), análisis de sensibilidad, reproducibilidad y capacidad de vigilar confiablemente los analitos con el trasfondo de suero humano son cruciales.
Nanoimprinting litografía (NIL) se utilizó para fabricar, a bajo costo, detección de áreas tan grandes como 1,5 x 1,5 mm. La superficie de detección fue hecha de arreglos de discos de alta fidelidad de nanoholes, cada uno con un área de alrededor de 140 nm2. La gran reproducibilidad de NIL posible emplear una estrategia de un chip, una medida de 12 superficies fabricadas individualmente, con mínima variación chip a chip. Estos chips de resonancia (LSPR) nanoimprinted localizada plasmón superficial fueron probados extensivamente en su capacidad para medir fiablemente un bioanalyte en concentraciones que varían desde 2.5 a 75 ng/mL en el fondo de un complejo biofluid-en este caso suero humano. La alta fidelidad de NIL permite la generación de grandes zonas de detección, que a su vez elimina la necesidad de un microscopio, este biosensor puede ser interconectado fácilmente con una fuente de luz de laboratorio comúnmente disponibles. Estos biosensores pueden detectar troponina en suero con una sensibilidad alta, en un límite de detección (LOD) de 0.55 ng/mL, que es clínicamente relevante. También muestran baja variación chip a chip (debido a la alta calidad del proceso de fabricación). Los resultados son conmensurables con análisis ampliamente utilizado enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA)-basado en ensayos, pero la técnica conserva las ventajas de una plataforma de detección LSPR-basado (es decir, receptividad a la miniaturización y la multiplexación, lo que más factible para las aplicaciones POC).

La configuración óptica para medición se muestra en la figura 1A. Una imagen de la matriz nanohole real se da en la figura 1B. Para entender la física de conducir el proceso de detección, se utilizó el software de simulación de COMSOL para simular la distribución de la plasmónica campo en un ambiente acuoso. Los resultados de la simulación fueron entonces relacionadas con la medición real. Un estudio previamente publicado contien...

Este trabajo describe un método de litografía de nanoimprinting para fabricar matrices de detección alta calidad que trabajan en el principio de transmisión óptica extraordinaria. El biosensor es bajo costo, robusto, fácil de usar y puede detectar troponina I en suero en concentraciones clínicamente relevantes (99th percentil corte ∼10-400 pg/mL, según el ensayo).

Uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

El objetivo general de esta técnica consiste en medir biomarcadores presentes en un entorno complejo de fluidos biológicos a concentraciones clínicamente relevantes en un entorno de atención al paciente, sin necesidad de configuraciones ópticas o eléctricas elaboradas. Este método puede contribuir a hacer realidad los biosensores basados en transmisión extraordinaria en escenarios de atención al paciente. La principal ventaja de esta técnica es que no requiere configuraciones eléctricas ni ópticas complicadas.En nuestros experimentos, pudo detectar de manera confiable biomarcadores en concentraciones clínicamente relevantes. La fabricación del chip sensor se realiza en sala limpia y no puede ser filmada. A efectos de demostración, el procedimiento se representa aquí mediante una animación.Para la preparación del molde de níquel, depósitese una capa de 220 nanómetros de espesor de resistente negativo para haz de electrones sobre una oblea de silicio de cuatro pulgadas y 600 micrones de espesor. Escríbase la matriz de nano-orificios diseñada sobre esta oblea utilizando un sistema de litografía por haz de electrones. Para acelerar la escritura con haz de electrones, escríbanse los patrones con un mapa de puntos bajo de 20.000 para cada campo de tamaño de 300 micrones.Revele la resistencia sumergiendo la oblea de silicio de cuatro pulgadas en la solución reveladora durante 10 segundos y dejando que la oblea se seque al aire. Deposite una capa semilla de un metal, como níquel, cobre o aluminio, sobre la oblea de silicio. Luego, electrodepósitela en un sistema de galvanoplastia dentro de un baño de sulfamato de níquel en dos pasos.Separar el molde de níquel del sustrato de silicio aplicando una fuerza mecánica suave. A continuación, utilizando una nanoimpresora, imprimir los patrones nano en una oblea de vidrio de cuatro pulgadas que haya sido recubierta con una capa de 300 nanómetros de espesor de resistencia fotosensible para litografía por nanoimpresión. Transferir el molde, la resistencia fotosensible y la oblea de vidrio a un sistema de curado con luz UV y realizar el curado fotográfico.Si todos los pasos se han seguido correctamente, el molde de níquel debería desmoldarse fácilmente del fotoresistente. Después de realizar un grabado vacío del fotoresistente sobre el sustrato de vidrio, en el oblea de vidrio, depositar en una máquina de deposición por haz de electrones una capa de cromo para la adhesión metálica y una capa de oro para el sensor plasmónico. Realizar el levantamiento del fotoresistente mediante grabado con plasma de oxígeno durante tres minutos, seguido de un paso de sonicación de 15 segundos en acetona.Luego, corte la muestra en trozos de cinco milímetros por cinco milímetros. La matriz de nano-orificios ocupará el cuadrado central de dos milímetros por dos milímetros del trozo. Para adquirir los datos, configure el aparato para realizar las mediciones ópticas, de modo que un haz de luz blanca que sale por el extremo de la fibra óptica transmisora sea colimado e incida sobre la superficie del sensor a 90 grados.La luz se transmite a través de toda la matriz de nano-orificios. Recolecte la señal transmitida con la fibra óptica receptora y regístrela con un espectrómetro UV-visible que funcione en el rango de 300 a 1.000 nanómetros. Para la prueba de sensibilidad masiva del sensor, deposite el líquido estándar de índice de refracción en la celda de líquido, con índices de refracción que varían de 1,31 a 1,39.Sumerja el chip sensor en el líquido estándar de índice de refracción y alínelo con el haz de luz blanca. Luego, obtenga el espectro de transmisión. Limpie el chip sensor después de cada medición con un reactivo limpiador de superficie activa y séquelo con gas nitrógeno.Para la modificación de la superficie del sensor, limpie los chips del sensor mediante inmersión secuencial en isopropanol, acetona y agua desionizada antes de cualquier modificación química. A continuación, seque los chips del sensor a temperatura ambiente en una corriente de gas nitrógeno seco. Después, incube los chips del sensor en una solución etanólica durante 12 horas a temperatura ambiente.Esto formará una monocapa de autoensamblaje reactiva con aminas. Tras la incubación, use etanol para enjuagar y secar completamente los chips a temperatura ambiente. A continuación, sumerja los chips en una mezcla de 75 milimolar de sulfo n hidroxysuccinimida y 15 milimolar de EDC durante 15 minutos.Esto activará el grupo carboxílico de la monocapa autoensamblada. A continuación, aplique 50 microlitros de una solución de anticuerpo antitriponte a 200 microgramos por mililitro, preparada en un tampón acetato de pH 4,5, sobre la superficie del sensor. Después de incubar durante 30 minutos, desactive los ésteres no reactivos sumergiendo el chip del sensor en una solución de etanolamina HCl 1 molar durante 15 minutos.Finalmente, enjuague el chip con agua desionizada y séquelo con una corriente de gas nitrógeno seco a temperatura ambiente. Bloquee la unión no específica aplicando 100 microlitros de una solución al 1 % de albúmina sérica bovina sobre la superficie del chip sensor. Incube durante 15 minutos.Lave las pastillas sensoras tres veces con solución salina tamponada con fosfato. Inserte la pastilla en la celda de medición para registrar el espectro de transmisión. Este es el espectro de referencia.Luego, coloque 50 microlitros del estándar de troponina cardíaca uno sobre la superficie del chip. Incube el chip en un ambiente húmedo durante 30 minutos. Después de enjuagar los chips sensores tres veces con solución de PBS, insértelos en la celda de medición para registrar el espectro de transmisión.Este es el espectro posterior a la unión. A continuación, sumerja los chips en glicina HCl 50 milimolar durante un minuto y luego enjuáguelos tres veces con solución PBS para regenerar la superficie del chip. Mida el espectro de transmisión en PBS para verificar el éxito del paso de regeneración.Se muestra el cambio en el espectro de transmisión del biosensor al interactuar con 30 nanogramos por mililitro de troponina cardíaca humana en suero. El gráfico azul representa antes de la interacción, mientras que el gráfico rojo representa después de la interacción. El círculo punteado indica la banda que se está rastreando.Se muestra aquí el desplazamiento en longitud de onda para la banda dos a concentraciones de troponina de 2,5 nanogramos por mililitro, 7,5 nanogramos por mililitro, 30 nanogramos por mililitro y 75 nanogramos por mililitro. Las barras de error representan la desviación estándar. Este gráfico muestra el desplazamiento en las longitudes de onda de las bandas observadas tras la regeneración para un chip de biosensor de nano-orificios.El desplazamiento de la posición de la banda dos de regreso a su posición original indica que el paso de regeneración fue exitoso. Una vez dominado, la medición puede realizarse en una hora si se lleva a cabo correctamente. Al medir los analitos biológicos mediante este método, es importante utilizar reactivos recién preparados.Asegúrese de eluir correctamente sus consumibles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar biosensores que funcionan según el principio de transmisión óptica extraordinaria y que pueden monitorear bioanalitos frente a un fondo complejo. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es complicado generar matrices de nanoagujeros de alta fidelidad, que permiten conectar el chip con una fibra óptica sin necesidad de usar un microscopio y optando por resinas reproducibles.Esta técnica permite realizar mediciones seriadas que son cruciales en entornos médicos. La fabricación del chip contribuye en gran medida a garantizar la reproducibilidad de las mediciones. Manteniendo la plataforma básica sin cambios, futuras mejoras a esta técnica provendrán del uso de la técnica con mayor resolución, lo que aumentará la sensibilidad, y del empleo de métodos de procesamiento de señales para obtener mejores relaciones señal-ruido.La implicación de esta técnica se extiende hacia el monitoreo de múltiples bioanalitos frente a un fondo complejo de suero en un entorno de atención al paciente en tiempo real.

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Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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Generación y cuantificación de 3 dimensiones de las lesiones arteriales en ratones mediante tomografía óptica de proyección

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