Uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano
13 de diciembre de 2017
Este trabajo describe un método de litografía de nanoimprinting para fabricar matrices de detección alta calidad que trabajan en el principio de transmisión óptica extraordinaria. El biosensor es bajo costo, robusto, fácil de usar y puede detectar troponina I en suero en concentraciones clínicamente relevantes (99th percentil corte ∼10-400 pg/mL, según el ensayo).
El objetivo general de esta técnica es medir los biomarcadores presentes en un fondo de fluido biológico complejo a concentraciones clínicamente relevantes en un entorno de punto de atención sin necesidad de configuraciones ópticas o eléctricas elaboradas. Este método puede ayudar a hacer realidad los biosensores basados en una transmisión extraordinaria en escenarios de punto de atención. La principal ventaja de esta técnica es que no necesita ninguna configuración eléctrica u óptica complicada.
En nuestros experimentos, pudo detectar de forma fiable biomarcadores a concentraciones clínicamente relevantes. La fabricación del chip sensor se realiza en la sala limpia y no se puede filmar. Con fines de demostración, el procedimiento se representa aquí mediante una animación.
Para la preparación del molde de níquel, cubra una capa de 220 nanómetros de espesor de resistencia de haz de electrones negativos sobre una oblea de silicio de cuatro pulgadas y 600 micras de espesor. Escriba la matriz de nanoagujeros diseñada en esta oblea, utilizando un sistema de litografía por haz de electrones. Para acelerar la escritura del haz de electrones, escriba los patrones con un mapa de puntos bajos de 20.000 para cada tamaño de campo de 300 micras.
Desarrolle la resistencia sumergiendo la oblea de silicona de cuatro pulgadas en la solución reveladora durante 10 segundos y dejando que la oblea se seque al aire. Deposite una capa de semilla de un metal, como níquel, cobre o aluminio en la oblea de silicio. A continuación, galvanoplastia la oblea en un sistema de recubrimiento dentro de un baño de níquel-sulfamato en dos pasos.
Separe el molde de níquel del sustrato de silicona aplicando una fuerza mecánica suave. A continuación, utilizando una nanoimpresora, imprima los nano patrones en una oblea de vidrio de cuatro pulgadas que ha sido recubierta con un espesor de 300 nanómetros de resina litográfica de nanoimpresión fotocurable. Transfiera el molde, la fotorresistencia y la oblea de vidrio a un sistema de curado con luz ultravioleta y fotopolimerizado.
Si se han seguido todos los pasos correctamente, el molde de níquel debería desmoldarse fácilmente de la fotorresistencia. Después de realizar un grabado en blanco de la fotorresistencia en la subrecta de vidrio, en la oblea de vidrio, en una máquina de deposición de haz de electrones, deposite una capa de cromo para la adhesión del metal y una capa de oro para el sensor plasmónico. Realice el despegue de la fotorresistencia mediante grabado con plasma de oxígeno durante tres minutos, seguido de un paso de sonoficación de 15 segundos en acetona.
Luego, corte la muestra en trozos de cinco milímetros por cinco milímetros. El conjunto de nanoagujeros ocupará el cuadrado central, de dos milímetros por dos milímetros, del chip. Para adquirir los datos, configure el aparato para realizar las mediciones ópticas, de modo que un haz de luz blanca que sale a través del extremo de la fibra óptica del transmisor se columne y coincida con la superficie del sensor a 90 grados.
La luz se transmite a través de todo el conjunto de nanoagujeros. Recoja la señal transmitida con la fibra óptica receptora y regístrela con un espectrómetro UV-visible que opere dentro del rango de 300 a 1.000 nanómetros. Para la prueba de sensibilidad a granel del sensor, deposite el líquido de índice de refracción estándar en la celda líquida con índices de refracción que varían de 1,31 a 1,39.
Sumerja el chip del sensor en el líquido del índice de refracción estándar y alinéelo con el haz de luz blanca. A continuación, obtenga el espectro de transmisión. Limpie el chip del sensor después de cada medición con un reactivo de limpieza tensioactivo y séquelo con gas nitrógeno.
Para la modificación de la superficie del sensor, limpie los chips del sensor mediante inmersión secuencial en isopropanol, acetona y agua desionizada antes de cualquier modificación química. Luego, seque los chips del sensor a temperatura ambiente en un vapor de gas nitrógeno seco. A continuación, incube los chips sensores en una solución etanólica durante 12 horas a temperatura ambiente.
Esto formará una monocapa reactiva a la amina y autoensamblable. Después de la incubación, use etanol para enjuagar y secar bien las virutas a temperatura ambiente. A continuación, sumerja las patatas fritas en una mezcla de 75 milimolares de sulfo n hidroxisuccinimida y 15 milimolares de EDC durante 15 minutos.
Esto activará el grupo carboxsílico de la monocapa de autoensamblaje. A continuación, coloque 50 microlitros de una solución de anticuerpos anti-triponentes de 200 microgramos por mililitro hecha en un tampón de acitato de pH 4,5 sobre la superficie del sensor. Después de incubar durante 30 minutos, desactive los ésteres no reactivos sumergiendo el chip sensor en una solución molar de etanolamina HCL durante 15 minutos.
Finalmente, enjuague el chip con agua desionizada y séquelo en un chorro de gas nitrógeno seco a temperatura ambiente. Bloquee cualquier unión inespecífica colocando 100 microlitros de solución de albúmina sérica bovina al 1% en la superficie del chip sensor. Incubar durante 15 minutos.
Enjuague los chips sensores tres veces en solución salina tamponada con fosfato. Inserte el chip en la celda de medición para registrar el espectro de transmisión. Este es el espectro de referencia.
A continuación, localiza 50 microlitros de la troponina cardíaca en la superficie del chip. Incuba el chip en un ambiente húmedo durante 30 minutos. Después de enjuagar los chips del sensor tres veces en la solución PBS, insértelo en la celda de medición para registrar el espectro de transmisión.
Este es el espectro posterior a la unión. A continuación, sumerja las virutas en 50 milimolares de glicina HCL durante un minuto y luego enjuague en la solución de PBS tres veces para regenerar la superficie de la viruta. Mida el espectro de transmisión en PBS para verificar el éxito de la etapa de regeneración.
Se muestra el cambio en el espectro de transmisión del biosensor al interactuar con 30 nanogramos por mililitro de troponina cardíaca humana en suero. El gráfico azul representa antes de la interacción, mientras que el gráfico rojo representa después de la interacción. El círculo punteado indica la banda que se está rastreando.
Aquí se muestra el cambio en la longitud de onda para la banda dos a concentraciones de troponina de 2,5 nanogramos por mililitro, 7,5 nanogramos por mililitro, 30 nanogramos por mililitro y 75 nanogramos por mililitro. Las barras de error representan la desviación estándar. Este gráfico muestra el cambio en las longitudes de onda de las bandas observado después de la regeneración de un chip biosensor de nanoagujeros.
El desplazamiento de la posición de la banda dos a su posición original indica que la etapa de regeneración se ha realizado correctamente. Una vez dominada, la medición se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Al medir los bioanalitos con este método, es importante utilizar reactivos recién preparados.
Por favor, asegúrate de liquidar tus consumibles. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar biosensores que funcionen según el principio de transmisión óptica extraordinaria y puedan monitorear bioanalitos en un contexto complejo. En general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque es difícil generar matrices de nanoagujeros de alta fidelidad que permitan interconectar el chip con una fibra óptica sin necesidad de ningún microscopio y optando por resinas reproducibles.
Esta técnica le permite realizar mediciones en serie que son cruciales en entornos médicos. La fabricación del chip contribuye en gran medida a garantizar la reproducibilidad de las mediciones. Dado que la plataforma básica sigue siendo la misma, las mejoras adicionales de esta técnica vendrán del uso de la técnica con mejor resolución que mejorará la sensibilidad y del uso de métodos de procesamiento de señal para lograr mejores relaciones señal-ruido.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el monitoreo de múltiples bioanalitos en un contexto complejo de suero en un entorno de punto de atención en tiempo real.
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Descripción general
Este trabajo describe un método de litografía por nanoimpresión para fabricar matrices de detección de alta calidad que funcionan según el principio de transmisión óptica extraordinaria. El biosensor está diseñado para aplicaciones de diagnóstico en el punto de atención, permitiendo la detección de troponina I cardíaca en suero a concentraciones clínicamente relevantes.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biotecnología
- Ingeniería biomédica
Antecedentes
- La necesidad de detección confiable de biomarcadores en fluidos biológicos complejos.
- Desafíos asociados con las tecnologías tradicionales de biosensores.
- El principio de la transmisión óptica extraordinaria en la biosensación.
- La importancia de los diagnósticos en el punto de atención en entornos clínicos.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un biosensor de bajo costo y robusto para la detección de troponina I cardíaca.
- Simplificar el proceso de detección sin configuraciones complejas.
- Demostrar la viabilidad de los biosensores basados en transmisión extraordinaria en aplicaciones clínicas.
Métodos Utilizados
- Litografía por nanoimpresión para la fabricación del sensor.
- Prueba del biosensor en muestras de suero.
- Representación animada del proceso de fabricación.
- Evaluación de los límites de detección y métricas de rendimiento.
Resultados principales
- El biosensor puede detectar troponina I cardíaca en concentraciones de 10-400 pg/mL.
- Funciona eficazmente en un entorno de atención primaria.
- Fiabilidad demostrada en la detección de biomarcadores en fluidos complejos.
- Elimina la necesidad de configuraciones ópticas o eléctricas elaboradas.
Conclusiones
- Este método representa un avance significativo en la tecnología de biosensores.
- Tiene el potencial de mejorar los diagnósticos en el punto de atención para afecciones cardíacas.
- Trabajos futuros podrían centrarse en ampliar el rango de biomarcadores detectables.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Esta plataforma de biosensado aborda la necesidad crítica de detección fiable y de bajo costo de biomarcadores cardíacos en fluidos biológicos complejos como el suero humano, apoyando directamente los flujos de trabajo diagnósticos en el punto de atención. Al permitir mediciones cuantitativas y reproducibles de troponina I cardíaca en concentraciones clínicamente relevantes sin configuraciones ópticas o eléctricas complejas, el método reduce las barreras técnicas para el diagnóstico temprano y la estratificación de riesgos en enfermedades cardiovasculares. La fabricación mediante nanoimpresión de alta fidelidad garantiza una variación mínima entre chips, lo que favorece la fabricación a escala y un rendimiento de ensayo consistente a lo largo de las etapas de descubrimiento y traslación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de la dinámica de liberación de troponina cardíaca como biomarcador mecanicista de lesión miocárdica en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Proporciona una señal óptica sin marcadores, compatible con matrices de nano-orificios de alta fidelidad para una detección de señal consistente en presencia de suero.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona salidas cuantitativas de desplazamiento de longitud de onda que se correlacionan con la concentración del analito, permitiendo la caracterización de respuesta a la dosis en matrices de suero.
- Valor operativo: Permite una estrategia de un chip, una medición con baja varianza, mejorando la reproducibilidad para la estandarización de ensayos y la selección de reactivos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita el monitoreo de la cinética de biomarcadores cardíacos en suero humano relevante para la enfermedad, mejorando la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación.
- Valor operativo: Elimina la necesidad de microscopía mediante áreas sensoras grandes (1,5 mm x 1,5 mm), lo que simplifica la integración con fuentes de luz y espectrómetros de laboratorio estándar.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la transición desde el descubrimiento temprano hasta la identificación de compuestos líderes, al proporcionar una lectura cuantitativa y robusta para la detección de biomarcadores en fluidos complejos, apoyando decisiones de continuar o descartar basadas en la interacción con el objetivo y la modulación de la vía.
- Biología del Descubrimiento: Permite la verificación de hipótesis sobre los mecanismos de lesión cardíaca mediante la detección fiable de troponina I en concentraciones séricas fisiológicamente relevantes.
- Selección: Proporciona desplazamientos reproducibles en el espectro de transmisión que permiten comparar niveles de biomarcadores entre diferentes condiciones experimentales sin necesidad de instrumentación compleja.
- Análisis: Ofrece mediciones del desplazamiento en longitud de onda (por ejemplo, banda dos) como resultado cuantitativo para rastrear la unión del biomarcador y la eficacia de su regeneración.
- Investigación Traducional: Utiliza suero humano como matriz de detección, asegurando la relevancia con muestras clínicas y reduciendo el riesgo de traslación específico por especie.
- Reutilización Empresarial: El proceso de fabricación basado en nanoimpresión es reutilizable en múltiples generaciones de chips, lo que favorece la escalabilidad de la plataforma para paneles de biomarcadores multiplexados.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la detección de biomarcadores mediante un LOD clínicamente relevante (0,55 ng/mL) y una varianza mínima entre chips.
- Valor operativo: Estandarización mediante litografía por nanoimpresión y compatibilidad con espectrómetros UV-Vis comunes y configuraciones de fibra óptica.
- Valor estratégico: Reduce el riesgo biológico en fases avanzadas al permitir un monitoreo temprano y preciso de biomarcadores en entornos simulados de atención primaria.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización ajustada al riesgo de candidatos dirigidos al corazón mediante lecturas confiables y compatibles con suero.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en litografía por nanoimpresión, química de superficies y espectroscopía óptica para la fabricación y funcionalización del chip.
- Depende del acceso a sala blanca para la generación del molde maestro y sistemas de curado UV para la polimerización del resist.
- Necesita una preparación estandarizada de la superficie (por ejemplo, bloqueo con BSA, lavados con EDTA) para minimizar la unión no específica en matrices de suero.
- La adaptación a otros biomarcadores requiere la validación de la eficiencia de inmovilización de anticuerpos y la estabilidad de regeneración en fluidos complejos.
- Limitación práctica: La eficiencia de regeneración debe verificarse en cada ciclo para garantizar la reproducibilidad de la superficie en mediciones seriadas.
