Name: Pinza de tensión Fluorometría en Xenopus Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende fluorometría de pinza de tensión con aminoácidos no naturales fluorescentes en oocitos de Xenopus. Este método avanzado permite correlacionar cambios estructurales con la función de canales iónicos en tiempo real.

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PAnap fue un regalo amable del Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Este trabajo fue financiado por el Instituto Canadiense de Investigaciones en Salud Subvenciones MOP-102689 y MOP-136894 (a RB) y la Fundación Canadiense para la Innovación Subvención 950-225005.

Las manipulaciones de las ranas se realizaron de acuerdo con las directrices canadienses y han sido aprobadas por el comité de ética (CDEA, protocolo # 15-042) de la Universidad de Montreal. 1. Preparación de mRNA para la incorporación de fUAA <ol><li> Elija un sitio de interés en la proteína donde se esperan cambios conformacionales. Seleccione un aminoácido en esta región para sustituir a la fUAA. NOTA: La elección de la posición se basa en los reordenamientos estructurales que se esperan. Si existe una estructura de alta resolución y una hipótesis de los movimientos esperados, el anap debe colocarse de tal manera que el ambiente químico se altere; Esto podría ser un cambio en la constante dieléctrica (ambiente hidrófobo frente a medio hidrófilo) o, más probablemente, extinción por otro aminoácido. Los mejores extinguidores son los triptófanos. Anap debe estar en contacto con el extintor en un estado (superposición de los radios van-der-Waals) y libre de él enel otro. Si no existen estructuras o modelos de alta resolución, habría que escanear la región de interés. En cualquier caso, es aconsejable seleccionar varias localizaciones cercanas para aumentar la probabilidad de obtener expresión y señal de fluorescencia. Con el fin de minimizar los efectos estéricos durante la maduración y / o función de la proteína, se puede optar por reemplazar los aminoácidos grandes y aromáticos (Phe, Trp, Tyr). Los autores, sin embargo, han experimentado que escanear una región de interés para la inserción de fUAA independientemente del aminoácido sustituido, es más productivo. </li><li> Insertar un codón de parada ámbar (TAG) en el sitio seleccionado utilizando mutagénesis dirigida al sitio 15 . Asegúrese de que la proteína de interés no termina en un codón de parada ámbar (TAG). Si es así, mutar a otro (codón de parada ocre o ópalo). Amplificar, aislar y secuenciar el ADN. Obtener ARNm de proteína con transcripción in vitro 16 y almacenar el mRNA a 20 ° C o 80 ° C. </li> &lt;Ol 2. Preparación y inyección de ovocitos <ol><li> Obtención quirúrgica de ovocitos en estadio V o VI de ranas Xenopus laevis y defolliculate con colagenasa como se describió previamente 17 . <ol><li> Anestesiar las ranas con un anestésico apropiado según el protocolo animal aprobado (aquí: éster etílico del ácido 3-aminobenzoico). Cuando no responden a un pellizco suave a una punta del pie (pérdida del reflejo de la retirada), entonces se anestesian adecuadamente para la cirugía. </li><li> Retire inmediatamente las ranas de la solución anestésica y enjuague bien su piel con agua fresca. Este enjuague impedirá que el animal caiga en niveles más profundos de anestesia al eliminar el producto químico no absorbido de la superficie de la piel. </li><li> Quitar los ganglios ováricos de un lado quirúrgicamente y cuidadosamente abrir los nodos con dos pinzas. Incubar y agitar los ovocitos en &quot;solución estándar de oocitos&quot; (SOS) que contiene 1% (p / v) de colagenasa durante 20-30 minPara defolliculate. Lavar tres veces con solución SOS. </li><li> Seleccionar ovocitos grandes y sanos individualmente e incubarlos en una solución de Barth suplementada con antibióticos (100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina, 10 mg / 100 mL de kanamicina) y 5% de suero de caballo a 18 ºC durante al menos 4 horas antes de la inyección . NOTA: Después de 2 a 4 cirugías con un retraso de 4 meses, Xenopus laevis se eutanasia por incubación prolongada (&gt; 1 h) con éster etílico del ácido 3-aminobenzoico. </li></ol></li><li> Para la inyección nuclear de ADN, prepare una punta de inyección larga y delgada para poder alcanzar el núcleo y evitar dañar el ovocito. Llene la punta de la inyección con aceite y monte en el dispositivo nanoinjetor. <ol><li> Instale el nano-inyector bajo un microscopio estéreo y utilice una pinza para romper el extremo de la punta. Expulse el aceite hasta que no haya burbujas de aire atrapadas dentro del extremo de la punta. </li></ol></li><li> Coloque 1 μl de 0,1 μg /# 181; L pAnap en agua libre de nucleasa que contenga NaOH (1% de NaOH 1 N) sobre un trozo de parafilm bajo un estereoscopio y llene la punta de inyección con el ADN. </li><li> Transferir 40 oocitos a un plato de inyección revestido con malla que contenga solución de Barth suplementada con antibióticos. NOTA: Para hacer el plato de inyección revestido con malla, corte una pieza de tamaño adecuado de malla de nylon de 800 μm para llenar una placa de Petri de poliestireno. Añadir cloroformo al centro y luego colocar la malla en la parte superior. Mantenga la malla plana hasta que el plástico se pone. </li><li> A medida que el núcleo del oocito se encuentra en el polo animal (oscuro), apunte la punta de la inyección en el centro del polo animal y empale de modo que la punta llegue cerca del centro del hemisferio animal (o 2-3x la profundidad comparada con la inyección de ARN ). Inyectar 9,2 nL de pAnap en el núcleo de cada ovocito. La punta fina y el volumen pequeño de inyección pueden resultar en una inyección irregular o una punta bloqueada. De vez en cuando, compruebe si la inyección funciona inyectándose en el aire. NOTA: Si el ADN se inyecta correctamente en el núcleo es incierto. Espere por lo tanto 10 - 40% de los ovocitos a no expresar el par tRNA / sintetasa. Véase Discusión para mayor elaboración. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig2.jpg" /> Figura 2 : Ilustración de la inyección de ADN y ARN en los ovocitos de Xenopus para la incorporación de Anap. En primer lugar, pAnap se inyecta en el núcleo del ovocito de Xenopus ( 1 ). Después de 6-24 h, Anap y el canal ARN se coinjected en el polo vegetal ( 2 ). Anap será ortogonalmente aminoacilado con el tRNA que lleva un anti-codón de bloqueo ámbar, por la aminoacil-ARNt sintetasa que está codificada por pAnap. De esta manera, los Anap-tRNAs aminoacilados son reconocidos por el ribosoma en el codón de parada ámbar insertado en el canalL de ARN, dando como resultado la supresión del codón de parada y la inserción de Anap. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="6"><li> Incubar los ovocitos en 2 ml de solución de Barth suplementada con antibióticos y 5% de suero de caballo (HS) a 18 ° C durante 6-24 h para permitir la expresión robusta de Anap tRNAs específicos y tRNA-sintetasas. NOTA: El tiempo de incubación del ADN puede durar varios días antes de la inyección de ARN, pero no aumenta la expresión. </li><li> Preparar el nano-inyector para la inyección de ARN (igual que el paso 2.2, pero la punta de inyección no necesita ser tan delgada como para la inyección de ADN). Trabajar sólo bajo luz roja desde este punto para evitar el fotoblanqueo del Anap. </li><li> Mezclar 1 μl de Anap 1 mM con 1 μl de mRNA de 1-2 μg / μL directamente sobre un trozo de parafilm y llenar la punta de inyección con la solución mezclada. Impala justo debajo de la membrana en el(Brillante) e inyectar 46 nL en cada ovocito inyectado con pAnap. NOTA: La concentración de mRNA requerida depende de la proteína de interés. </li><li> Incubar los ovocitos protegidos de la luz en una caja o envueltos en papel de aluminio, en antibióticos suplementados con solución de Barth y suero de caballo al 5% a 18 ° C durante 2-3 días. Intercambiar con la solución fresca de Barth todos los días y eliminar los ovocitos muertos para evitar la contaminación. </li></ol> 3. Configuración VCF <ol><li> Instale el equipo de sujeción de voltaje de oocitos abierto como se describe anteriormente 18 . </li><li> Montar el sistema de registro electrofisiológico en un microscopio de fluorescencia vertical mediante la instalación de la cámara de grabación en un deslizador que permite moverlo entre el estereoscopio estándar para colocar el ovocito y el microscopio para realizar las mediciones de fluorescencia ( Figura 2c ). NOTA: La geometría de la cámara para los ovocitos cortados no es adecuada para usar la tra normalNsmitted la luz para la iluminación durante la manipulación. Por lo tanto, una lámpara halógena &quot;cuello de cisne&quot; con filtro rojo se utiliza para iluminar lateralmente desde la parte superior. El condensador del microscopio puede ser removido hacer espacio para bajar la etapa de la cámara de electrofisiología. </li><li> Conecte un sistema de detección de fotodiodos al puerto de salida de montaje en C del microscopio de fluorescencia ( Figura 2a ). Conecte la lectura de la fotocorriente a un segundo canal de entrada en el procesador digital de señales (DSP, analógico / digital - digital / analógico). </li><li> Utilice una lámpara halógena de 100 W, 12 V como fuente de luz para la excitación de fluorescencia. NOTA: Alternativamente, pueden utilizarse quemadores de Hg, pero deben reducirse en intensidad para evitar un fotoblanqueo demasiado rápido durante las grabaciones. La iluminación LED sólo se recomienda si los respectivos LEDs muestran una intensidad significativa en el rango de excitación ( por ejemplo, ~ 350 nm para Anap). La mayoría de los LEDs blancos no llegan lejos en el espectro UV. </li><li> InsErt un obturador controlado eléctricamente entre la fuente de luz de excitación y el microscopio y conectar su control (típicamente TTL-pulso) a una salida digital del DSP. Tiempo de TTL-pulso en el software de grabación (véase la documentación del fabricante), de tal manera que el obturador se abre ~ 100 ms antes del comienzo de la grabación. De esta manera, cualquier vibración durante el proceso de apertura no interfiere con la grabación. El tiempo depende de la velocidad y vibración del obturador. Termine el pulso 5ms antes del final de la grabación como se muestra en la Figura 4 . De esta manera, también se registra el valor para la fluorescencia total. </li><li> Inserte un cubo de filtro apropiado (filtro de excitación, espejo dicroico y filtro de emisión) en la torreta de cubo de filtro. Para Anap, utilice el paso de banda Ex: 377/50 nm, el paso largo dicroico 409 nm y el paso banda Em: 470/40 nm. </li></ol><img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55598/55598fig3.jpg" /> Figura 3 &lt;<html> / Strong&gt; : Configuración de VCF. ( A ) Vista lateral de la configuración VCF que muestra el trayecto de la luz dentro del microscopio. El cubo del filtro contiene un filtro de excitación, un espejo dicroico y un filtro de emisión. ( B ) Las dimensiones seleccionadas de la cámara de ovocitos son de 3,4 cm para el radio de la cámara superior (1), 5,5 cm para la cámara inferior (2), 1,4 cm para la anchura de la cámara inferior (3) y 1,7 cm para la anchura de la cámara intermedia (4). ( C ) Vista frontal de la configuración VCF. El primer ocular de la izquierda es para montar el ovocito en la cámara de abrazadera de tensión cortada y para la permeabilización. Entonces, la cámara se desliza bajo el microscopio en el segundo ocular a la derecha. Aquí, el electrodo V1 se inserta en el ovocito usando el objetivo 4X, y la fluorescencia se registra usando el objetivo 40X de inmersión en agua. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Itle &quot;&gt; 4. Grabación VCF <ol><li> Seguir los pasos de preparación para la abrazadera de voltaje de ovocitos abierta como se describió anteriormente y visualizar 18 (preparación del puente de agar, montaje del ovocito, permeabilización de la saponina). Sin embargo, trabaje bajo luz roja en todo momento para evitar blanquear el fluoróforo antes de las grabaciones. Al colocar el ovocito, asegúrese de que el polo animal esté orientado hacia arriba. La pigmentación bajo la membrana del polo animal protege contra la autofluorescencia procedente del citosol y por lo tanto reduce la fluorescencia de fondo. </li><li> Deslice la cámara hacia el microscopio y enfoque con un objetivo de 4X. </li><li> Empalar el ovocito con el electrodo V1 de detección de voltaje (3 M KCl), cambiar al objetivo 40X de inmersión en agua (NA 0.8 - 0.9). Concéntrese en el polo animal que está mirando hacia arriba. </li><li> Apague la luz roja. Seleccione el cubo de filtro correcto girando la torreta de cubo de filtro y el puerto de salida óptica conectado al fotodiodo. Encienda el halEn la lámpara en la intensidad más alta y en breve cambiar el obturador abierto durante 2-5 s para leer la intensidad de fluorescencia de fondo procedente del ovocito. Con la configuración descrita el valor debe ser alrededor de 50-200 pA para Anap. </li><li> Encienda la abrazadera, vuelva a activar el interruptor de baño / protector y ajuste el potencial de membrana (V1 - V2) al potencial de mando girando el mando en la posición I. </li><li> Seleccione el potencial de retención, el protocolo de paso, el número y la longitud de los impulsos, etc. en el software de grabación. Registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia Anap. </li></ol> 5. VCF bicolor <ol><li> Para monitorizar simultáneamente dos localizaciones en la misma proteína, mute un aminoácido extracelular y accesible en cisteína, y elimine otras cisteínas para asegurar un etiquetado específico con química tiol. </li><li> Realice el paso 2.1-2.5. </li><li> Antes de las grabaciones de VCF, incube los oocitos en TMR-maleimida 5 μM en solución de marcado durante 15 min (u otro coloranteCon un espectro no superpuesto comparado con Anap). </li><li> Lave los ovocitos con solución de etiquetado tres veces para eliminar el exceso de colorante. </li><li> Realice el paso 4.1-4.6. </li><li> Inserte un cubo de filtro apropiado para TMR (filtro de excitación, espejo dicroico y filtro de emisión) en la torreta de cubo de filtro. Cambie al cubo del filtro TMR girando la torreta del filtro. </li><li> Lea la fluorescencia de fondo para TMR como se describe para Anap en el paso 4.4. NOTA: El etiquetado con la química tiol produce una alta fluorescencia de fondo debido al etiquetado inespecífico en la membrana. Por lo tanto, la fluorescencia de fondo TMR puede saturar el amplificador (&gt; 2000 pA). En ese caso, no disminuya la intensidad de la luz, sino que simplemente resta la fluorescencia de fondo añadiendo una corriente de desplazamiento al fotodiodo. En sistemas comercialmente disponibles, utilice la función de &quot;muestreo y retención&quot; en el sistema detector. Observe el valor de fluorescencia de fondo (utilizando un filtro de densidad neutra 10X) en un laboratorio jYa que este valor no será registrado (saturación). </li><li> Registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia TMR simultáneamente como en el paso 4.6. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La aminoacilación in vivo de tRNAs que se transcriben continuamente junto con la tRNA-sintetasa, hace posible obtener altos niveles de expresión para mediciones de fluorescencia. Para una eficaz incorporación de fUAA, es fundamental que pAnap se inyecte correctamente en el núcleo. Debido a la incertidumbre de la ubicación exacta del núcleo, 10-40% de las inyecciones de ADN se espera que fallen, dando lugar a no expresar (o expresar fugas) ovocitos. Por lo tanto, es importante verificar la expresión en ausencia ...

Más de 200 aminoácidos naturales de diversas propiedades químicas y físicas han sido incorporados genéticamente en proteínas en células de E. coli , levaduras y mamíferos [ 3] . El aminoácido no natural se incorpora en respuesta a un codón de parada específico a través de un par ortogonal de tRNA / sintetasa. El enfoque genético para modificar las proteínas ha proporcionado información valiosa sobre la estructura y función de la proteína. Aquí, presentamos un protocolo para el uso de Voltaje-Clamp Fluorometría (VCF) en combinación con un fluorescente SAU. En VCF, la observación simultánea de datos funcionales y reordenamientos estructurales localizados alrededor de la sonda fluorescente (~ 5 Å) nos permite obtener información dinámica con una resolución de milisegundos 1 . Las sondas fluorescentes alteran su estado de extinción tras el movimiento localizado de la proteína. Un movimiento de sólo 1-2 Å es suficiente para conducir a cambios significativos en la fluorescenciaIntensidad 4 . Después de la identificación del sitio de interés en la proteína diana, el sitio es mutado por mutación puntual. Clásicamente, el residuo se había mutado a una cisteína, mientras que ahora, se introduce un codón de detención ámbar (TAG) para la incorporación genética de fUAA. La proteína se transcribe entonces in vitro . Mientras que otros sistemas de expresión ( p. Ej., Células de mamíferos) pueden usarse 5 , 6 , 7 , los oocitos de Xenopus son preferibles para estudios de estructura-función debido a su mayor tamaño, lo que conduce a una manipulación más fácil ya una mayor intensidad de fluorescencia (más fluoróforos) Ruido. Además, los ovocitos de Xenopus tienen un bajo trasfondo de las proteínas endógenas 2 , 8 , y la pigmentación oscura en el polo animal se escuda contra la fluorescencia de fondo de tEl citosol. Los ovocitos de Xenopus se eliminan quirúrgicamente y el ADN que codifica el par ortogonal tRNA / tRNA-sintetasa específico para la fUAA se inyecta en el núcleo de los oocitos. Después de un tiempo de incubación de 6-24 h, la proteína ARN se co-inyecta con la fUAA en el citosol de los ovocitos, seguido por un período de incubación de 2-3 días. Con el fin de evitar cualquier daño a la fUAA (fotoblanqueo), los procedimientos que incluyen Anap tienen que llevarse a cabo bajo luz roja para evitar la excitación del fluoróforo. Se estudian los ovocitos en una configuración de tensión-abrazadera de ovocitos abierta, que se monta en un microscopio de fluorescencia vertical, y se registran simultáneamente cambios de corriente eléctrica y fluorescencia 9 , 10 . Alternativamente, pueden usarse una abrazadera de tensión de dos electrodos 1 o configuraciones de abrazadera de parche 11 . La fluorescencia se excita mediante longitudes de onda apropiadas con bajo ruido RMS y<html> Emisión registrada usando un fotodiodo ligado a un amplificador con alta amplificación. Hay varias ventajas del uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAAs) en fluorometría de tensión-abrazadera. Una es el acceso al lado citosólico de las proteínas de la membrana; Aquí se encuentran muchos procesos reguladores ( por ejemplo, sitios de unión a Ca2 + o nucleótidos, inactivación rápida y cerrada de canales iónicos con voltaje, apertura de poros, acoplamiento de módulos). Todos estos procesos ahora son accesibles para el etiquetado fluorescente. Otra ventaja es el tamaño pequeño de la sonda que conduce a menos alteración de la proteína. Hasta ahora, se han diseñado dos pares ortogonales tRNA / ARNt sintetasa para fUAA 12 , 13 , donde el ácido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoico (Anap) es el único fUAA que se ha utilizado en ovocitos de Xenopus 2 ,&quot;Xref&quot;&gt; 8. Anap es un fluoróforo ambientalmente sensible con un peso molecular de 272,3 g / mol y es sólo ligeramente mayor que el triptófano 12 ( Figuras 1A, 1B ). Debido a su pequeño tamaño, es probable que se introduzcan menos efectos estéricos por el fluoróforo en comparación con los fluoróforos convencionales unidos a través de un engarce (típicamente más de 500 g / mol). Por otra parte, en el caso de Anap, el fluoróforo se encuentra más cerca de la cadena principal de proteínas que los vinculados a las cisteínas, y, en consecuencia, Anap está probando más localizados reordenamientos. Por último, la eliminación de las cisteínas endógenas en el VCF convencional con el fin de asegurar el etiquetado específico del sitio ya no es un requisito en el UAA-VCF y por lo tanto (i) deja las proteínas en (casi) su estado nativo y (ii) permite aplicar VCF Para estudiar una gama más amplia de proteínas en las que la función puede ser alterada por la sustitución de cisteína. <img alt="Figura 1" srC = &quot;/ files / ftp_upload / 55598 / 55598fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1 : Anap y espectros de fluorescencia. ( A ) Estructura química de Anap. ( B ) Espectro de absorción normalizado y espectros de emisión para Anap 1 nM, demostrando la sensibilidad de la fluorescencia de Anap a la hidrofobicidad del disolvente. Los espectros de emisión se obtuvieron por excitación a 350 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55598/55598fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Una desventaja del uso de UAA fluorescentes es que una población heterogénea de proteínas puede resultar de la lectura de codón de terminación, reiniciación traslacional, proteínas C-terminales truncadas o diafonía con aminoacilación endógena si la cantidad de ARNt aminoacilados es escasa. Tal expresión de fugas siempre debe comprobarse en ausencia de la fUAA y el tRNA / tRNA synthetase par. Abordamos la cuestión de la transReinicialización lacional y cómo evitarlo para los sitios de inserción N-terminal anteriormente 14 . Sin embargo, cuando la fUAA, tRNA y tRNA sintetasa están presentes en cantidades saturadas, sólo queda una baja probabilidad de expresión de fugas. La principal diferencia de procedimiento entre fUAA-VCF y VCF convencional es la inyección y manipulación de los ovocitos; La inyección de ADN que codifica el tRNA y la ARNt sintetasa (pAnap) es seguida por la introducción de Anap, que se co-inyecta con el ARNm de la proteína o se añade alternativamente a la solución de incubación como un éster de acetoximetilo (AM).

<table><tbody><tr><td>Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Barth's solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-9397</td><td>0.82 mM</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-7902</td><td>0.41 mM</td></tr><tr><td>Ca(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-1396</td><td>0.33 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>NaOH hidrato</td><td></td><td>BDH BDH7225-4</td><td>pH 7.6</td></tr><tr><td>Penicilina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>Estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr> de <tr><td>Kanamicina</td><td>Invitrogen</td><td>15160054</td><td>10 mg/100mL</td></tr><tr><td>Suero de Caballo (HS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td>5%</td></tr><tr><td><fuerte>SOS Solución de Ovocitos Estándar</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398</td><td>102 mM</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td>3 mM</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>5 mM</td></tr><tr><td>Solución de registro externo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Hidróxido de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Hidrato de MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7,2</td></tr><tr><td><fuerte>Solución de registro interna</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-metil-D-glucamina (NMDG)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L14282</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Ácido etilendiamínico tetraacético (EDTA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>E478-500</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>MES hidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7,2</td></tr><tr><td><fuerte>Solución de etiquetado</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-1</td><td>115 mM</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Hidróxido de calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>239232</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>de hidrato de MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258105</td><td>pH 7,2</td></tr><tr><td><fuerte>TMR solución madre </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tetrametilrodamina-5-maleimida (TMR)</td><td>Sondas molculares de Life Technologies</td><td>T6027</td><td>5 mM en DMSO</td></tr><tr><td><fuerte>Anap solución madre</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anap</td><td>ABZENA (TCRS)</td><td>Síntesis personalizada TCRS-170</td><td>1 mM en agua libre de nucleasas y 1% NaOH 1 N</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Material/Equipo</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pAnap</td><td>Addgene</td><td>48696</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de ovocitos de alto rendimiento</td><td>Dagan Corporation</td><td>CA-1B</td><td></td></tr><tr><td>Gpatch Software</td><td>de adquisición Departamento de Anestesiología, Universidad de California, Los Ángeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis</td><td>Departamento de Anestesiología, Universidad de California, Los Ángeles</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámara de grabación</td> Sistema de detección de fotodiodos <td>mecanizado</td><td></td><td></td>a medida</tr><tr><td></td><td>Dagan Corporation</td><td>PhotoMax-200/PIN</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de obturador eléctrico</td><td>UNIBLITZ</td><td>VCM-D1</td><td></td></tr></tbody></table>

pinza de tensión fluorometría en<em&gt; xenopus</em&gt; oocitos usando fluorescentes aminoácidos no naturales

Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids

Fluorometría de tensión-abrazadera (VCF) ha sido la técnica de elección para investigar la estructura y función de las proteínas de membrana electrogenic donde las mediciones en tiempo real de la fluorescencia y las corrientes informan simultáneamente sobre los reordenamientos locales y la función global, respectivamente 1 . Mientras que las técnicas estructurales de alta resolución como la microscopía cryoelectrónica o la cristalografía de rayos X proporcionan imágenes estáticas de las proteínas de interés, el VCF proporciona datos estructurales dinámicos que nos permiten vincular los reordenamientos estructurales (fluorescencia) a datos funcionales dinámicos (electrofisiología). Hasta hace poco, la química tiol-reactiva utilizada para el marcado fluorescente dirigido a las plantas de las proteínas restringía el alcance del enfoque porque todas las cisteínas accesibles, incluidas las endógenas, estarían etiquetadas. De este modo se requirió la construcción de proteínas libres de cisteínas endógenas. El etiquetado también se restringió a los sitios accesibles desde el extracelularlado. Esto cambió con el uso de aminoácidos fluorescentes no naturales (fUAA) para incorporar específicamente una pequeña sonda fluorescente en respuesta a la supresión del codón de parada utilizando un par ortogonal tRNA y tRNA sintetasa par 2 . La mejora de VCF sólo requiere un procedimiento de inyección de dos etapas de inyección de ADN (par tRNA / sintetasa) seguido de co-inyección de ARN / fUAA. Ahora, el etiquetado tanto intracelular y sitios enterrados es posible, y el uso de VCF se ha expandido significativamente. La técnica VCF se convierte así en atractiva para estudiar una amplia gama de proteínas y, lo que es más importante, permite investigar numerosos mecanismos reguladores citosólicos.

La Figura 4 muestra un ejemplo de grabaciones de VCF obtenidas a partir de un ovocito que expresa canales de Shaker con inactivación rápida eliminada (IR), L382stop-W434F en presencia de pAnap y Anap. La mutación W434F bloquea las corrientes de potasio iónico, lo que permite medir los desplazamientos transitorios de la carga de giro (corrientes de gating). Las grabaciones simultáneas de las corrientes de gating (traza superior) y Anap cambios de intensidad de fluorescenc...

Este artículo describe una mejora de la Fluorometría de Voltaje-Clavija convencional (VCF) donde se usan Fluorescentes Aminoácidos No Naturales (fUAA) en lugar de tintes de maleimida, para sondar reordenamientos estructurales en canales iónicos. El procedimiento incluye inyección de ADN de ovocitos de Xenopus , coinjección de ARN / fUAA y mediciones de corriente y fluorescencia simultáneas.

Pinza de tensión Fluorometría en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

Voltage-Clamp Fluorometry (VCF) has been the technique of choice to investigate the structure and function of electrogenic membrane proteins where ...

El objetivo general de este procedimiento es introducir un aminoácido no natural fluorescente en una proteína de membrana expresada en ovocitos de Xenopus y determinar simultáneamente la función de la proteína y sus reorganizaciones estructurales, utilizando la fluorometría con bloqueo de voltaje. Esta técnica ayudará a responder preguntas clave en el campo de las relaciones entre la estructura y la función de las proteínas de membrana. Mediante la fluorometría con bloqueo de voltaje, podemos correlacionar directamente los cambios estructurales con la función de la proteína.Agregar etiquetado con aminoácidos no naturales fluorescentes ayuda a superar las limitaciones anteriores en el etiquetado, como la accesibilidad de los sitios de etiquetado y el etiquetado de fondo debido a sitios de unión endógenos. La implicación de esta técnica se extiende hacia una mejor comprensión biofísica de las proteínas de membrana, ya que ahora se pueden explorar dominios que anteriormente eran inaccesibles mediante la fluorometría tradicional con bloqueo de voltaje.Después de la extirpación quirúrgica de los ovocitos de Xenopus, lave los ovocitos tres veces con solución SOS. Seleccione individualmente los ovocitos grandes y sanos, e incúbelos a 18 grados Celsius durante al menos cuatro horas en solución de Barth suplementada con antibióticos y suero de caballo al 5 % antes de la inyección. Para la inyección nuclear de ADN, prepare una punta de inyección larga y delgada para alcanzar el núcleo sin dañar los ovocitos.A continuación, llene la punta de inyección con aceite y coloque la punta de inyección en el dispositivo nanoinyector. Luego, instale el nanoinyector bajo un microscopio estereoscópico y rompa el extremo de la punta con pinzas. Después, expulse el aceite hasta que no quede ninguna burbuja de aire atrapada dentro del extremo de la punta.A continuación, coloque un microlitro de 0,1 microgramos por microlitro de pAnap en agua libre de nucleasas sobre un trozo de Parafilm bajo el estereoscopio, y llene la punta de inyección con ADN. Luego, transfiera los ovocitos a un platillo de inyección que contenga una malla y solución de Barth suplementada con antibióticos. Dado que el núcleo del ovocito se encuentra en el polo animal, dirija la punta de inyección hacia el centro del polo animal y empújela de modo que la punta alcance cerca del centro del hemisferio animal.A continuación, inyecte 9,2 nanolitros de la solución pAnap en el núcleo de cada ovocito. Posteriormente, incube los ovocitos en dos mililitros de solución de Barth suplementada con antibióticos y 5% de suero de caballo a 18 grados Celsius durante seis a 24 horas para permitir una expresión robusta de ARNt específicos de Anap y sintetasas de ARNt. Ahora, prepare nuevamente el nanoinyector, pero esta vez, la punta de inyección no necesita ser tan fina como la utilizada para la inyección de ADN.Trabaje únicamente con luz roja a partir de este momento para evitar el fotoblanqueo del Anap. Mezcle un microlitro de Anap de un milimolar con un microlitro de ARNm de uno a dos microgramos por microlitro directamente sobre un trozo de Parafilm, y llene la punta de inyección con la solución mezclada. Inserte la punta en el polo vegetal justo debajo de la membrana, e inyecte 46 nanolitros de la solución mezclada en cada ovocito inyectado con pAnap.Luego, proteja los ovocitos de la luz colocándolos en una caja opaca a la luz o envolviendo el matraz con papel de aluminio. Incúbelos en solución de Barth suplementada con antibióticos y 5 % de suero de caballo a 18 grados Celsius durante dos o tres días. Remplace la solución diariamente con solución de Barth fresca y elimine los ovocitos muertos para evitar contaminación.En este montaje, el equipo de bloqueo de voltaje con cámara abierta está integrado en un sistema de microscopía de fluorescencia. La cámara de registro se instala sobre un deslizador que permite moverla entre el estereoscopio estándar, utilizado para colocar el ovocito, y el microscopio, empleado para realizar mediciones de fluorescencia. Un sistema de detección con fotodiodo está conectado al puerto de salida C-mount del microscopio de fluorescencia, y la lectura de la corriente fotoeléctrica se conecta a un segundo canal de entrada en el procesador de señales digitales.Una lámpara halógena de 100 vatios y 12 voltios se utiliza como fuente de luz para la excitación de fluorescencia. La excitación se controla mediante un obturador mecánico colocado entre la fuente de luz de excitación y el microscopio. La activación se desencadena mediante un pulso TTL procedente del procesador de señales digitales, que se sincroniza en el software de grabación de modo que el obturador se abra aproximadamente 100 milisegundos antes del inicio de la grabación, y se requiere un cubo de filtro adecuado en la torreta de cubos de filtro.Para la VCF de dos colores, incube los ovocitos preparados en solución de etiquetado con maleimida de TMR de cinco micromolares durante 15 minutos inmediatamente antes de la grabación. Luego, lave los ovocitos tres veces con la solución de etiquetado para eliminar el exceso de colorante antes de la grabación. En este punto, la proteína está etiquetada específicamente con dos fluoróforos diferentes.Después de montar el ovocito con el polo animal orientado hacia arriba y permeabilizado, deslice la cámara hacia el microscopio y enfoque el ovocito utilizando un objetivo de 4X. A continuación, inserte el ovocito con un electrodo V1 sensor de voltaje. Luego, cambie al objetivo de inmersión en agua de 40X.Enfóquese en el polo animal, que está orientado hacia arriba. Después de eso, apague la luz roja. Seleccione el cubo de filtro Anap girando la torreta del cubo de filtro y la salida óptica conectada al fotodiodo.A continuación, encienda la lámpara de halógeno a la máxima intensidad y abra el obturador durante dos a cinco segundos para leer la intensidad de fluorescencia de fondo proveniente del ovocito. Posteriormente, encienda el amplificador, cambie el interruptor de baño/protección a activo y ajuste el potencial de membrana al potencial de comando girando el mando en la etapa de registro. A continuación, seleccione en el software de registro el potencial de mantenimiento, el protocolo de escalones, el número y la duración de los pulsos.Luego, registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia de Anap. Para VCF de dos colores, seleccione el cubo de filtro TMR girando la torreta del cubo. Lea la fluorescencia de fondo para TMR, como se describió para Anap, y registre simultáneamente las corrientes dependientes del voltaje y la intensidad de fluorescencia de TMR.Esta figura muestra las señales de fluorescencia de Anap y TMR utilizando protocolos por pasos obtenidos del mismo ovocito que expresa un mutante de Shaker. Al añadir una cisteína, accesible desde la solución externa, en el fondo L382 stop W434F y marcarla con maleimida de TMR, es posible sondear movimientos en tiempo real en diferentes regiones de la misma proteína simultáneamente. La relación voltaje-fluorescencia se obtiene graficando la intensidad de fluorescencia en estado estacionario frente al voltaje.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar aminoácidos no naturales fluorescentes en ovocitos de Xenopus y cómo realizar fluorometría de bloqueo de voltaje de un color o dos colores. Una vez que domine la técnica, debería tomar aproximadamente el mismo tiempo que los experimentos tradicionales de electrofisiología, solo que tiene el paso adicional de inyectar ADN en el núcleo del ovocito. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la expresión de fugas en ausencia del aminoácido no natural.Esto debe hacerse para cada mutación, ya que la cantidad de expresión por fugas depende del sitio de inserción del codón de terminación dentro de la proteína. Esta técnica ahora permite a los investigadores estudiar los cambios conformacionales en el sitio citosólico de la proteína, donde ocurren muchos de los mecanismos reguladores.

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Investigación

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Biochemistry

Bioquímica

Corriente iónica de los canales BK se registraron con la técnica de patch clamp. Canales BK se expresan...

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

Vamos a describir un método que mide la cinética del transporte de iones de proteínas de membrana junto con el sitio específico de análisis de los cambios conformacionales con fluorescencia en células individuales. Esta técnica se adapta a los canales iónicos, transportadores y bombas iónicas y pueden ser utilizados para determinar las limitaciones distancia entre subunidades de la proteína.

Examinar la dinámica conformacional de las proteínas de membrana In situ Sitio-dirigida con fluorescencia de etiquetado

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en<em&gt; Xenopus</em&gt; Los ovocitos mediante espectrofotometría de absorción atómica: una alternativa a ensayos de radioisótopos

Para complementar los métodos comúnmente utilizados para el estudio de TRPV4, dos métodos se describen: Su mechanosensitivity puede ser estudiado por Ca 2 +-luminometría aecuorina en la levadura transgénica a partir del desafío hipo-osmótica. También puede ser examinado en TRPV4-ARN inyectado ovocitos de Xenopus por células enteras de fijación de voltaje de dos electrodos o parche abrazadera en en-célula o el modo extirpado.

Luminométricos levadura y Xenopus ovocitos electrofisiológicos Exámenes del mecanosensibilidad Molecular de TRPV4

El enfoque de BPA vaselina de corte abierto se utiliza para obtener bajos grabaciones de ruido de corrientes iónicas y conmutación de canales iónicos dependientes de voltaje expresados ​​en oocitos de Xenopus con alta resolución de la cinética de canal rápido. Con modificaciones menores, fluorometría de fijación de voltaje puede estar acoplado con el protocolo de ovocitos de corte abierto.

La<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovocitos-Cut abierta vaselina Gap Técnica Voltage-clamp Con Fluorometría

Se describe un método para obtener imágenes de los cambios en el potencial de membrana utilizando indicadores de voltaje codificados genéticamente.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Las grabaciones de células enteras de los fotorreceptores de Drosophila melanogaster permiten medir las colisiones oscuras espontáneas, los baches cuánticos, las respuestas macroscópicas a la luz y las relaciones tensión-corriente bajo diversas condiciones. En combinación con las herramientas de manipulación genética de D. melanogaster , este método permite el estudio de la vía omnipresente de señalización de los inositol-lípidos y su objetivo, el canal TRP.

Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Presentamos un protocolo de dos partes que combina imágenes fluorescentes de calcio con hibridación in situ, permitiendo al experimentador correlacionar patrones de actividad de calcio con perfiles de expresión génica a nivel de una sola célula.

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Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.

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Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

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La fluorometría funcional dirigida al sitio es un método para estudiar los movimientos del dominio de la proteína en tiempo real. La modificación de esta técnica para su aplicación en células nativas ahora permite la detección y el seguimiento de movimientos de un solo sensor de voltaje de canales Ca2+ dependientes de voltaje en fibras musculares esqueléticas aisladas murinas.

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Aprende fluorometría de pinza de tensión con aminoácidos no naturales fluorescentes en oocitos de Xenopus. Este método avanzado permite correlacionar cambios estructurales con la función de canales iónicos en tiempo real.

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