Pinza de tensión Fluorometría en Xenopus Oocitos Usando Fluorescentes Aminoácidos No Naturales

El objetivo general de este procedimiento es introducir un aminoácido fluorescente no natural en una proteína de membrana expresada en ovocitos de Xenopus y determinar la función y el reordenamiento estructural de la proteína simultáneamente, utilizando fluorometría de pinza de voltaje. Esta técnica ayudará a responder preguntas clave en el campo de las relaciones de función y estructura de las proteínas de membrana. Utilizando la fluorometría de pinza de voltaje, podemos correlacionar directamente los reordenamientos estructurales con la función de las proteínas.

La adición de un etiquetado fluorescente de aminoácidos no naturales ayuda a superar las limitaciones anteriores en el etiquetado. Esta fue una vez la accesibilidad de los sitios de etiquetado, así como el etiquetado de fondo debido a los sitios de unión endógenos. La implicación de esta técnica se extiende hacia una mejor comprensión biofísica de las proteínas de membrana, ya que ahora se pueden sondear dominios, que antes eran inaccesibles con la fluorometría tradicional de pinza de voltaje.

Después de la extirpación quirúrgica de los ovocitos de Xenopus, lavar los ovocitos tres veces con la solución SOS. Seleccione ovocitos grandes y sanos individualmente e incubelos a 18 grados centígrados durante al menos cuatro horas en la solución de Barth suplementada con antibióticos y suero de caballo al 5% antes de la inyección. Para la inyección nuclear de ADN, prepare una punta de inyección larga y delgada para que llegue al núcleo sin dañar los ovocitos.

Luego, llene la punta de inyección con aceite y monte la punta de inyección en el dispositivo de nanoinyector. A continuación, instale el nanoinyector bajo un microscopio estereoscópico y rompa el extremo de la punta con pinzas. Después de eso, expulse el aceite hasta que no quede ninguna burbuja de aire atrapada dentro del extremo de la punta.

A continuación, coloque un microlitro de 0,1 microgramos por microlitro de pAnap en agua sin nucleasas en un trozo de Parafilm bajo el estereoscopio y llene la punta de inyección con ADN. A continuación, transfiera los ovocitos a una placa de inyección que contenga una malla que contenga la solución de Barth suplementada con antibióticos. Como el núcleo del ovocito se encuentra en el polo del animal, apunte la punta de la inyección al centro del polo del animal y empale de tal manera que la punta llegue cerca del centro del hemisferio animal.

A continuación, inyectar 9,2 nanolitros de la solución de pAnap en el núcleo de cada ovocito. Posteriormente, incubar los ovocitos en dos mililitros de la solución de Barth suplementada con antibióticos y suero de caballo al 5% a 18 grados centígrados durante seis a 24 horas para permitir una expresión robusta de los ARNt específicos de Anap y las ARNt sintetasas. Ahora, prepare el nanoinyector nuevamente, pero esta vez, la punta de inyección no necesita ser tan delgada como la de la inyección de ADN.

Trabaje solo con luz roja desde este punto para evitar el fotoblanqueo del Anap. Mezcle un microlitro de Anap de un milimolar con un microlitro de uno a dos microgramos por microlitro de ARNm directamente sobre una pieza de Parafilm, y llene la punta de inyección con la solución de mezcla. Empalar la punta en el polo vegetal justo debajo de la membrana e inyectar 46 nanolitros de la solución de mezcla en cada ovocito inyectado con pAnap.

A continuación, proteja los ovocitos de la luz colocándolos en una caja hermética a la luz o envolviendo el matraz en papel de aluminio. Incubarlos en la solución de Barth suplementada con antibióticos y suero de caballo al 5% a 18 grados centígrados durante dos o tres días. Reemplácelo con solución de Barth fresca todos los días y elimine los ovocitos muertos para evitar la contaminación.

En esta configuración, el equipo de abrazadera de voltaje de apertura está integrado en una configuración de microscopía de fluorescencia. La cámara de registro está instalada en un deslizador que le permite moverse entre el estereoscopio estándar para colocar el ovocito y el microscopio para realizar mediciones de fluorescencia. Un sistema de detección de fotodiodos está conectado al puerto de salida de la montura C del microscopio de fluorescencia, y la lectura de fotocorriente está conectada a un segundo canal de entrada en el procesador de señal digital.

Se utiliza una lámpara halógena de 100 vatios y 12 voltios como fuente de luz para la excitación de fluorescencia. La excitación está controlada por un obturador mecánico entre la fuente de luz de excitación y el microscopio. La activación se activa a través de un pulso TTL proveniente del procesador de señal digital que se temporiza en el software de grabación de modo que el obturador se abre unos 100 milisegundos antes del comienzo de la grabación, y se requiere un cubo de filtro apropiado en la torreta del cubo de filtro.

En el caso de la VCF de dos colores, incubar los ovocitos preparados en maleimida TMR de cinco micromolares en solución de etiquetado durante 15 minutos inmediatamente antes del registro. A continuación, lavar los ovocitos con la solución de etiquetado tres veces para eliminar el exceso de tinte antes de la grabación. En este punto, la proteína se marca específicamente con dos fluoróforos diferentes.

Después del montaje del ovocito, con el polo del animal hacia arriba y permeabilizado, deslice la cámara hacia el microscopio y enfoque el ovocito con un objetivo 4X. A continuación, empala el ovocito con un electrodo V1 con detección de voltaje. A continuación, cambia al objetivo de inmersión en agua 40X.

Concéntrese en el poste del animal, que está hacia arriba. Después de eso, apague la luz roja. Seleccione el cubo de filtro Anap girando la torreta del cubo de filtro y el puerto de salida óptica conectado al fotodiodo.

A continuación, encienda la lámpara halógena a la máxima intensidad y abra el obturador durante dos a cinco segundos para leer la intensidad de fluorescencia de fondo que se origina en el ovocito. Luego, encienda la abrazadera, gire el interruptor de baño / protección a activo y ajuste el potencial de la membrana al potencial de comando girando la perilla en la etapa principal. A continuación, seleccione el potencial de retención, el protocolo de pasos, el número y la longitud de los pulsos en el software de grabación.

A continuación, registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia de Anap. Para VCF de dos colores, seleccione el cubo de filtro TMR girando la torreta del cubo. Lea la fluorescencia de fondo para TMR, como se describe para Anap, y registre las corrientes dependientes del voltaje y la intensidad de fluorescencia de TMR simultáneamente.

Esta figura muestra las señales de fluorescencia Anap y TMR utilizando protocolos escalonados obtenidos del mismo ovocito que expresa un mutante Shaker. Al agregar una cisteína, accesible desde la solución externa, en el fondo L382 stop W434F y marcarla con maleimida TMR, es posible sondear los movimientos en tiempo real en diferentes regiones de la misma proteína simultáneamente. La relación entre el voltaje de fluorescencia se obtiene trazando la intensidad de fluorescencia en estado estacionario frente al voltaje.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar aminoácidos fluorescentes no naturales en ovocitos de Xenopus y cómo realizar fluorometría de pinza de voltaje de un color o dos colores. Una vez que domines la técnica, debería tomar aproximadamente la misma cantidad de tiempo que los experimentos de electrofisiología tradicionales, solo tienes el paso adicional de inyectar ADN en el núcleo del ovocito. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la expresión de fugas en ausencia del aminoácido antinatural.

Esto debe hacerse para cada mutación, ya que la cantidad de expresión de fuga depende del sitio de inserción del codón de parada dentro de la proteína. Esta técnica ahora permite a los investigadores estudiar los cambios conformacionales en el sitio citosólico de la proteína, donde ocurren muchos de los mecanismos reguladores.