Pinza de tensión Fluorometría en

El objetivo general de este procedimiento es introducir un aminoácido no natural fluorescente en una proteína de membrana expresada en ovocitos de Xenopus y determinar simultáneamente la función de la proteína y sus reorganizaciones estructurales, utilizando la fluorometría con bloqueo de voltaje. Esta técnica ayudará a responder preguntas clave en el campo de las relaciones entre la estructura y la función de las proteínas de membrana. Mediante la fluorometría con bloqueo de voltaje, podemos correlacionar directamente los cambios estructurales con la función de la proteína.

Agregar etiquetado con aminoácidos no naturales fluorescentes ayuda a superar las limitaciones anteriores en el etiquetado, como la accesibilidad de los sitios de etiquetado y el etiquetado de fondo debido a sitios de unión endógenos. La implicación de esta técnica se extiende hacia una mejor comprensión biofísica de las proteínas de membrana, ya que ahora se pueden explorar dominios que anteriormente eran inaccesibles mediante la fluorometría tradicional con bloqueo de voltaje.

Después de la extirpación quirúrgica de los ovocitos de Xenopus, lave los ovocitos tres veces con solución SOS. Seleccione individualmente los ovocitos grandes y sanos, e incúbelos a 18 grados Celsius durante al menos cuatro horas en solución de Barth suplementada con antibióticos y suero de caballo al 5 % antes de la inyección. Para la inyección nuclear de ADN, prepare una punta de inyección larga y delgada para alcanzar el núcleo sin dañar los ovocitos.

A continuación, llene la punta de inyección con aceite y coloque la punta de inyección en el dispositivo nanoinyector. Luego, instale el nanoinyector bajo un microscopio estereoscópico y rompa el extremo de la punta con pinzas. Después, expulse el aceite hasta que no quede ninguna burbuja de aire atrapada dentro del extremo de la punta.

A continuación, coloque un microlitro de 0,1 microgramos por microlitro de pAnap en agua libre de nucleasas sobre un trozo de Parafilm bajo el estereoscopio, y llene la punta de inyección con ADN. Luego, transfiera los ovocitos a un platillo de inyección que contenga una malla y solución de Barth suplementada con antibióticos. Dado que el núcleo del ovocito se encuentra en el polo animal, dirija la punta de inyección hacia el centro del polo animal y empújela de modo que la punta alcance cerca del centro del hemisferio animal.

A continuación, inyecte 9,2 nanolitros de la solución pAnap en el núcleo de cada ovocito. Posteriormente, incube los ovocitos en dos mililitros de solución de Barth suplementada con antibióticos y 5% de suero de caballo a 18 grados Celsius durante seis a 24 horas para permitir una expresión robusta de ARNt específicos de Anap y sintetasas de ARNt. Ahora, prepare nuevamente el nanoinyector, pero esta vez, la punta de inyección no necesita ser tan fina como la utilizada para la inyección de ADN.

Trabaje únicamente con luz roja a partir de este momento para evitar el fotoblanqueo del Anap. Mezcle un microlitro de Anap de un milimolar con un microlitro de ARNm de uno a dos microgramos por microlitro directamente sobre un trozo de Parafilm, y llene la punta de inyección con la solución mezclada. Inserte la punta en el polo vegetal justo debajo de la membrana, e inyecte 46 nanolitros de la solución mezclada en cada ovocito inyectado con pAnap.

Luego, proteja los ovocitos de la luz colocándolos en una caja opaca a la luz o envolviendo el matraz con papel de aluminio. Incúbelos en solución de Barth suplementada con antibióticos y 5 % de suero de caballo a 18 grados Celsius durante dos o tres días. Remplace la solución diariamente con solución de Barth fresca y elimine los ovocitos muertos para evitar contaminación.

En este montaje, el equipo de bloqueo de voltaje con cámara abierta está integrado en un sistema de microscopía de fluorescencia. La cámara de registro se instala sobre un deslizador que permite moverla entre el estereoscopio estándar, utilizado para colocar el ovocito, y el microscopio, empleado para realizar mediciones de fluorescencia. Un sistema de detección con fotodiodo está conectado al puerto de salida C-mount del microscopio de fluorescencia, y la lectura de la corriente fotoeléctrica se conecta a un segundo canal de entrada en el procesador de señales digitales.

Una lámpara halógena de 100 vatios y 12 voltios se utiliza como fuente de luz para la excitación de fluorescencia. La excitación se controla mediante un obturador mecánico colocado entre la fuente de luz de excitación y el microscopio. La activación se desencadena mediante un pulso TTL procedente del procesador de señales digitales, que se sincroniza en el software de grabación de modo que el obturador se abra aproximadamente 100 milisegundos antes del inicio de la grabación, y se requiere un cubo de filtro adecuado en la torreta de cubos de filtro.

Para la VCF de dos colores, incube los ovocitos preparados en solución de etiquetado con maleimida de TMR de cinco micromolares durante 15 minutos inmediatamente antes de la grabación. Luego, lave los ovocitos tres veces con la solución de etiquetado para eliminar el exceso de colorante antes de la grabación. En este punto, la proteína está etiquetada específicamente con dos fluoróforos diferentes.

Después de montar el ovocito con el polo animal orientado hacia arriba y permeabilizado, deslice la cámara hacia el microscopio y enfoque el ovocito utilizando un objetivo de 4X. A continuación, inserte el ovocito con un electrodo V1 sensor de voltaje. Luego, cambie al objetivo de inmersión en agua de 40X.

Enfóquese en el polo animal, que está orientado hacia arriba. Después de eso, apague la luz roja. Seleccione el cubo de filtro Anap girando la torreta del cubo de filtro y la salida óptica conectada al fotodiodo.

A continuación, encienda la lámpara de halógeno a la máxima intensidad y abra el obturador durante dos a cinco segundos para leer la intensidad de fluorescencia de fondo proveniente del ovocito. Posteriormente, encienda el amplificador, cambie el interruptor de baño/protección a activo y ajuste el potencial de membrana al potencial de comando girando el mando en la etapa de registro. A continuación, seleccione en el software de registro el potencial de mantenimiento, el protocolo de escalones, el número y la duración de los pulsos.

Luego, registre las corrientes dependientes del voltaje y las intensidades de fluorescencia de Anap. Para VCF de dos colores, seleccione el cubo de filtro TMR girando la torreta del cubo. Lea la fluorescencia de fondo para TMR, como se describió para Anap, y registre simultáneamente las corrientes dependientes del voltaje y la intensidad de fluorescencia de TMR.

Esta figura muestra las señales de fluorescencia de Anap y TMR utilizando protocolos por pasos obtenidos del mismo ovocito que expresa un mutante de Shaker. Al añadir una cisteína, accesible desde la solución externa, en el fondo L382 stop W434F y marcarla con maleimida de TMR, es posible sondear movimientos en tiempo real en diferentes regiones de la misma proteína simultáneamente. La relación voltaje-fluorescencia se obtiene graficando la intensidad de fluorescencia en estado estacionario frente al voltaje.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar aminoácidos no naturales fluorescentes en ovocitos de Xenopus y cómo realizar fluorometría de bloqueo de voltaje de un color o dos colores. Una vez que domine la técnica, debería tomar aproximadamente el mismo tiempo que los experimentos tradicionales de electrofisiología, solo que tiene el paso adicional de inyectar ADN en el núcleo del ovocito. Al intentar este procedimiento, es importante recordar verificar la expresión de fugas en ausencia del aminoácido no natural.

Esto debe hacerse para cada mutación, ya que la cantidad de expresión por fugas depende del sitio de inserción del codón de terminación dentro de la proteína. Esta técnica ahora permite a los investigadores estudiar los cambios conformacionales en el sitio citosólico de la proteína, donde ocurren muchos de los mecanismos reguladores.