Un nuevo método para modelar la encefalopatía traumática crónica Drosophila

El objetivo general de este novedoso procedimiento es infligir lesiones cerebrales traumáticas cerradas en la mosca de la fruta, Drosophila, para establecer un nuevo modelo de encefalopatía traumática crónica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la encefalopatía traumática crónica, como cómo el trauma repetitivo induce la degeneración neuronal. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona los impactos repetitivos de fuerzas ajustables a la cabeza de la mosca directamente sin causar daños a otras partes del cuerpo del animal.

La demostración en el mundo real de este método es fundamental, ya que el ensamblaje del dispositivo y los pasos de carga de la mosca son difíciles de aprender, porque la cabeza de Drosophila es muy pequeña y es importante aplicar el impacto solo a la cabeza. Para hacer el aparato utilizado para conmocionar o golpear a las moscas de la fruta, primero, haga la parte del impactador del aparato. Retire el émbolo de una jeringa de tuberculina de policarbonato de un mililitro y luego corte el cilindro en la marca de un mililitro.

Para un impactador, use la barrera de aerosol que se encuentra en la punta de una pipeta de 200 microlitros. Este impactador debe tener tres milímetros de largo y cuatro milímetros de diámetro. Luego, empaque el impactador en el cilindro de la jeringa con el lado plano hacia la boquilla.

Para proporcionar fuerza, conecte el cilindro de la jeringa a un regulador de flujo de dióxido de carbono. El regulador debe tener un interruptor de palanca de encendido y apagado y un buen control del caudal de gas. Luego, sujete el cañón verticalmente a un soporte de hierro, de modo que el impactador caiga al fondo del cañón.

A continuación, haz el soporte para moscas. Comience con una punta de pipeta de 200 microlitros. Corte la punta de la pipeta a cinco milímetros del extremo pequeño para hacer una abertura de 8 milímetros de diámetro.

Una cabeza de mosca pasará a través de este orificio, pero el tórax no. Por último, haga un para el soporte de moscas y el dispositivo de impacto. Primero, corte una punta de pipeta de un mililitro a 44 milímetros de la pequeña abertura.

En segundo lugar, corte una longitud de seis milímetros de la cubierta de la aguja para una jeringa de un mililitro. Luego, empuje los dos juntos. Anestesia a una sola mosca hembra adulta de dos días de edad con dióxido de carbono.

Desde la almohadilla de dióxido de carbono, use un cepillo fino para transferir suavemente la mosca al soporte. Luego, golpee suavemente el soporte hasta que la cabeza sobresalga de la punta. Si la probóscide está expuesta, use una aguja de jeringa desafilada de un mililitro para meterla suavemente dentro de la punta.

Es fundamental mantener el cuerpo de la mosca, especialmente la parte de la boca, dentro del soporte. De lo contrario, la mosca puede morir por daños en los órganos internos o por no poder ingerir alimentos. A continuación, ajuste la presión del gas a 100 kilopascales y ajuste el flujo según sea necesario.

Una vez que la mosca esté cargada, apriete el soporte al cilindro de la jeringa con el conector, de modo que la cabeza de la mosca mire hacia abajo. Luego, usando el interruptor de palanca, envía una ráfaga de gas que mueve el impactador para golpear a la mosca una vez y solo una vez. Ahora, separe el soporte para moscas y vuelva a volcar la mosca en la almohadilla de dióxido de carbono.

Cepille la mosca en un frasco vacío hasta que se recupere. Conserve una mosca por vial. La recuperación tarda solo unos minutos.

Repita el proceso para probar cuatro moscas por grupo experimental. Procesar dos grupos, una prueba y una simulación, solo debería tomar de 20 a 30 minutos. Trate las falsificaciones como animales de prueba, excepto que no incluya una barrera de aerosol en el tubo del impactador.

Para rastrear los movimientos de las moscas en una placa de Petri, primero, llene una placa de seis centímetros con elastómero de silicio transparente para hacer la arena de seguimiento. Deje un espacio de tres milímetros entre la silicona y la tapa para que las moscas puedan caminar libremente en el espacio, pero no levantar el vuelo. Debajo de la arena de seguimiento, tiene un fondo blanco.

A continuación, anestesia a cuatro moscas del mismo grupo de tratamiento y colócalas en la arena. Deje que las moscas se aclimaten durante una hora a la arena, que debe estar completamente iluminada y a unos 22 grados centígrados. No más caliente que la temperatura ambiente.

Después de una hora, use una cámara de dispositivo de carga acoplada colocada sobre la arena para registrar la actividad de la mosca durante cinco minutos. Después de la grabación de cinco minutos, anestesia a las moscas en la arena y devuélvalas a un nuevo frasco casero. Luego, deshazte de la arena.

Más tarde, analice las grabaciones utilizando el software Ctrax disponible gratuitamente. Este software genera datos de seguimiento, que se pueden exportar en un formato compatible con el lenguaje programable, como el formato MATLAB. A partir de los datos, calcule la distancia recorrida por fotograma, la distancia media a pie por cada mosca y la distancia media recorrida por mosca.

Para determinar la significación estadística, se espera analizar alrededor de 100 moscas por grupo de tratamiento. Para establecer un modelo de encefalopatía traumática crónica, se analizó la efectividad de un solo traumatismo craneal cerrado producido por el aparato impactador a diferentes velocidades utilizando hembras Canton-S de dos días de edad. La presión del gas se mantuvo en 100 kilopascales.

Las moscas expuestas a un solo golpe al caudal más alto probado, exhibieron defectos externos mínimos. A pesar de que no hay evidencia clara de daño externo, las lesiones a un caudal de 15 litros por minuto fueron agudamente letales, lo que resultó en menos del 10% de supervivencia dentro de las 24 horas. La supervivencia aumentó con caudales más bajos.

La supervivencia del cien por cien se logró a cinco litros por minuto o menos, por lo que se seleccionaron cinco litros por minuto como estándar para el modelo. Justo después de ser golpeadas, las moscas recuperaron gradualmente su movilidad en cuatro minutos. La recuperación de las farsas fue aproximadamente un minuto más rápida.

Se utilizó el seguimiento del movimiento asistido por video posterior al impacto para medir la función de la locomotora. Durante los dos días posteriores al impacto, la locomoción volvió lentamente a la normalidad. Esta evidencia de recuperación gradual está en línea con la recuperación de la encefalopatía traumática crónica en humanos.

Para evaluar los efectos a largo plazo, se aplicó un protocolo de lesión cerebral traumática repetitiva de cinco golpes durante cinco días. Veinte días después del tratamiento, se comparó la locomoción de los miembros supervivientes de cada grupo y el grupo tratado claramente caminó menos. La esperanza de vida del grupo tratado también se redujo sustancialmente, con una mediana de 26 días en comparación con los 37 días de los controles.

Tras su desarrollo, esta técnica abre el camino para que los investigadores en el campo del traumatismo craneoencefálico repetitivo leve exploren los mecanismos patogénicos en el modelo animal clásico de Drosophila melanogaster. Al intentar este procedimiento, es importante recordar proteger la probóscide, el tórax y el abdomen del impacto directo de la barrera de aerosol.