Name: Un nuevo método para modelar la encefalopatía traumática crónica Drosophila (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Aprende a inducir lesiones cerebrales traumáticas cerradas en Drosophila melanogaster para modelar la encefalopatía traumática crónica. Este método permite impactos repetitivos controlados directamente en la cabeza de la mosca.

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Los autores no tienen nada que revelar.

1. Montaje del Dispositivo de Huelga ( Figura 1 ) <ol><li> Retire el émbolo de una jeringa de tuberculina de 1 ml. Corte el barril en la marca de 1 mL. </li><li> Retire una barrera de aerosol (3 mm de altura x 4 mm de diámetro) de una punta de pipeta de 200 μL y úsela como un impactador. Coloque el impactador dentro del cilindro de la jeringa. Golpee suavemente el cañón para mover el impactador al extremo de la punta, con el lado plano que cubre la abertura de la boquilla. </li><li> Conecte el extremo de la punta del cañón a un tubo de plástico que esté conectado al regulador de flujo de dióxido de carbono (CO 2 ) de una estación de anestesia Drosophila . </li><li> Sujete el cañón verticalmente y sujételo a un soporte de sujeción estándar para que el impactador permanezca en la parte inferior del cañón. </li><li> Modifique una punta de pipeta de 200 μL para hacer el soporte de la mosca. <ol><li> Corte 4 mm de la punta para hacer una abertura de 0.8 mm de diámetro, permitiendo que sólo la cabeza de la mosca para ser expuestos. NOTA: El thoRax y todas las otras partes del cuerpo de la mosca se mantendrá dentro de la punta de la pipeta. </li></ol></li><li> Modifique una punta de pipeta de 1000 μL y una tapa de aguja de 1 ml para hacer el conector. <ol><li> Cortar 44 mm de la abertura de la punta. Tome una longitud de 6 mm de una tapa de la aguja de la jeringa de 1 ml y empuje firmemente en el segmento restante de la punta de la pipeta de 1000 μL. </li></ol></li></ol> 2. Funcionamiento del dispositivo Strike <ol><li> Anestesiar una sola hembra de 2 días de edad que usa CO 2 en una almohadilla de mosca. </li><li> Suavemente transferirlo al sostenedor de la mosca usando un cepillo fino. Toque suavemente el soporte para que el cabezal volador se ve fuera del extremo de la punta. Si la probóscide de la mosca está expuesta fuera de la punta, suavemente doblarla de nuevo dentro de la punta con una aguja de jeringa de 1 ml embotada. NOTA: Asegúrese de mantener la probóscide mosca en el interior del soporte. De lo contrario, la mosca puede morir de una lesión de probóscide de succión. </li><li> Apriete la mosca hoHacia el cilindro de la jeringa con el conector de manera que el cabezal volador esté hacia abajo. </li><li> Ajuste la presión del gas a 100 kPa. Ajuste el caudal según el diseño del experimento. </li><li> Encienda y apague rápidamente el interruptor del interruptor del regulador de flujo para que el impactador golpee la cabeza de la mosca una vez. </li><li> Levante el porta mosquitera y muévalo sobre una almohadilla. Invertir el sostenedor de la mosca y golpee suavemente el lado para dejar la mosca para fuera. Dejar la mosca en un frasco vacío para recuperarse. </li></ol> 3. Seguimiento de Movimiento Video-asistido <ol><li> Llenar una placa de Petri de 6 cm de diámetro con elastómero de silicio transparente para hacer la arena de seguimiento. Deje un espacio de 3 mm entre el silicio y la tapa del plato para permitir que las moscas caminen libremente pero no vuelen. </li><li> Anestesiar cuatro moscas de la farsa o grupo tratado cada vez y colocarlos en la arena. Dejar las moscas a 22 ° C durante 1 h. </li><li> Coloque una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) por encima de las arenas y grabe durante 5 min.</li><li> Analizar las trayectorias de movimiento registradas utilizando el software Ctrax (disponible gratuitamente en Caltech) 16 . Exportar los datos de seguimiento en un formato de programación (por ejemplo, Matlab) y analizar los datos basados ​​en la distancia recorrida por cada cuadro 17 . Calcular la distancia media de marcha de cada mosca y combinarla con todas las demás moscas registradas / grupo para obtener una distancia media acumulada recorrida por la población de archivos en el mismo grupo. </li></ol>

<ol><li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+first+NINDS%2FNIBIB+consensus+meeting+to+define+neuropathological+criteria+for+the+diagnosis+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy.</a> Acta Neuropathol. 131, 75-86 (2016).</li>
<li>Martland, H. S. <a target="_blank" href="http://jamanetwork.com/journals/jama/article-abstract/260461">Punch drunk.</a> JAMA. 91 (15), 1103-1107 (1928).</li>
<li>Millspaugh, J. A. <a target="_blank" href="https://www.scopus.com/record/display.uri?eid=2-s2.0-0005984841&origin=inward&txGid=863ABC19BCEDFF53A3AD7536B601EEA3.wsnAw8kcdt7IPYLO0V48gA%3a2">Dementia pugilistica.</a> US Naval Med Bull. 35, 297-303 (1937).</li>
<li>Omalu, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+a+national+football+league+player%3A+part+II%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in a national football league player: part II.</a> Neurosurgery. 59 (5), 1086-1092 (2006).</li>
<li>Goldstein, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy+in+blast-exposed+military+veterans+and+a+blast+neurotrauma+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy in blast-exposed military veterans and a blast neurotrauma mouse model.</a> Sci Transl Med. 4 (134), (2012).</li>
<li>Mez, J., Stern, R. A., McKee, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+traumatic+encephalopathy%3A+where+are+we+and+where+are+we+going%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neurol+Neurosci+Rep%22%5BJournal%5D)">Chronic traumatic encephalopathy: where are we and where are we going?</a> Curr Neurol Neurosci Rep. 13 (12), 407(2013).</li>
<li>McKee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+disease+in+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The spectrum of disease in chronic traumatic encephalopathy.</a> Brain. 136 (Pt 1), 43-64 (2013).</li>
<li>Petraglia, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+neurobehavioral+sequelae+after+repetitive+mild+traumatic+brain+injury%3A+a+novel+mouse+model+of+chronic+traumatic+encephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy.</a> J Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).</li>
<li>Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+in+the+study+of+human+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Neurol+Disord+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration.</a> CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).</li>
<li>Littleton, J. T., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+and+synaptic+organization%3A+analysis+of+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ion channels and synaptic organization: analysis of the Drosophila genome.</a> Neuron. 26 (1), 35-43 (2000).</li>
<li>Appel, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+Stubble-stubbloid+gene+encodes+an+apparent+transmembrane+serine+protease+required+for+epithelial+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">The Drosophila Stubble-stubbloid gene encodes an apparent transmembrane serine protease required for epithelial morphogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 90 (11), 4937-4941 (1993).</li>
<li>Piyankarage, S. C., Featherstone, D. E., Shippy, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+hemolymph+sampling+and+analysis+of+individual+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Nanoliter hemolymph sampling and analysis of individual adult Drosophila melanogaster.</a> Anal Chem. 84 (10), 4460-4466 (2012).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+model+of+closed+head+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A Drosophila model of closed head traumatic brain injury.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (44), E4152-E4159 (2013).</li>
<li>Barekat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+as+an+integrated+model+to+study+mild+repetitive+traumatic+brain+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila as an integrated model to study mild repetitive traumatic brain injury.</a> Sci Rep. 6, 25252(2016).</li>
<li>Katzenberger, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+to+Inflict+Closed+Head+Traumatic+Brain+Injury+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method to Inflict Closed Head Traumatic Brain Injury in Drosophila.</a> J Vis Exp. (e52905), (2015).</li>
<li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li>
<li>Straw, A. D., Dickinson, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motmot%2C+an+open-source+toolkit+for+realtime+video+acquisition+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Source+Code+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Motmot, an open-source toolkit for realtime video acquisition and analysis.</a> Source Code Biol Med. 4 (5), 1-10 (2009).</li>
<li>Talavage, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally-detected+cognitive+impairment+in+high+school+football+players+without+clinically-diagnosed+concussion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Functionally-detected cognitive impairment in high school football players without clinically-diagnosed concussion.</a> J Neurotrauma. 31 (4), 327-338 (2014).</li>
<li>Theadom, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frequency+and+impact+of+recurrent+traumatic+brain+injury+in+a+population-based+sample%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurotrauma%22%5BJournal%5D)">Frequency and impact of recurrent traumatic brain injury in a population-based sample.</a> J Neurotrauma. 32 (10), 674-681 (2015).</li>
<li>Drobysheva, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+histological+detection+of+dopaminergic+neurons+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">An optimized method for histological detection of dopaminergic neurons in Drosophila melanogaster.</a> J Histochem Cytochem. 56 (12), 1049-1063 (2008).</li>
</ol>

Este trabajo fue apoyado por la Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins fondo de inicio de facultad a LC

Los modelos animales que modelan fielmente las características del CTE, incluidas las alteraciones neurofisiológicas, los signos neuropatológicos y los déficits neuroconductuales, son esenciales para descubrir los mecanismos de la enfermedad y para desarrollar objetivos diagnósticos y terapéuticos. Es comprensible que ningún modelo animal de una enfermedad humana sea perfecto para imitar todos los puntos finales clínicamente relevantes. Sin embargo, creemos que un modelo de CTE robusto debe satisfacer los siguientes tre...

La encefalopatía traumática crónica (CTE) ha sido reconocida recientemente como un trastorno neurodegenerativo distinto, separado de otras tauopatías como la enfermedad de Alzheimer 1 . A diferencia de la enfermedad de Alzheimer y otras tauopatías comunes-cuyos factores de riesgo más importantes son la edad avanzada y una historia familiar de demencia, CTE, como se indica por su nombre, implica una estrecha asociación con una historia de trauma cerebral, Como boxeadores y futbolistas, así como en veteranos militares 2 , 3 , 4 , 5 . Se cree que es iniciado por repetidos golpes concussive y subconcussive a la cabeza. Los pacientes pueden presentar síntomas y signos tales como déficits cognitivos, cambios de humor y comportamiento, y disfunción del movimiento, que se superponen significativamente con la enfermedad de Alzheimer, frontotemporalDemencia, demencia de cuerpos de Lewy y enfermedad de Parkinson 6 . En cambio, los exámenes post-mortem del tejido cerebral revelan un patrón distinto de acumulación de tau hiperfosforilada que rodea pequeños vasos sanguíneos en las profundidades de los surcos corticales, característica patognomónica que no se observa en otras condiciones degenerativas 7 . Sin embargo, hasta ahora, se sabe muy poco acerca de la patogénesis que conduce a la manifestación de la enfermedad. Esto se debe en gran parte a la falta de un modelo animal fiel - sólo recientemente se han generado modelos de roedores 5 , 8 . Estos organismos modelo tienen las desventajas de la atención costo-intensiva y una vida relativamente larga, que no son bien-adaptados para los estudios de la enfermedad neurodegenerative. En comparación con los homólogos de mamíferos, los animales invertebrados como Drosophila son una excelente alternativa, con su mantenimiento rentable,Extensas herramientas para diseccionar determinantes genéticos y una vida relativamente corta 9 . Sorprendentemente, la mosca y el cerebro humano comparten las vías moleculares y celulares evolutivamente conservadas, así como las similitudes anatómicas 10 , 11 , 12 . Dos ingeniosos modelos de Drosophila para estudiar la lesión cerebral traumática han sido reportados previamente 13 , 14 . El primer dispositivo &quot;High Impact Trauma&quot; (HIT) diseñado por Katzenberger y sus colegas contenía moscas de movimiento libre en un vial de plástico que estaba atado al extremo libre de un resorte metálico 13 , 15 . Cuando el vial de plástico se inclinó verticalmente y se soltó, golpeó una almohadilla de poliuretano e impartió un traumatismo a las moscas cuando rebotaron en la pared del vial y se recuperaron. En contraste, Barekat y sus colegas diseñaron un método de entrega diferenteLa plataforma de homogeneización Omni Bead Ruptor-24 14 . Las moscas fueron incapacitadas con CO 2 y colocadas en un tubo de tornillo de 2 mL que se aseguró al homogeneizador y se sometió a condiciones de agitación preprogramadas. Un beneficio de usar el sistema homogeneizador de tejidos es que el experimentador podría modular la intensidad de la lesión, la duración de la lesión y el número de episodios de lesiones. Sin embargo, ambos regímenes sufren el mismo inconveniente: las lesiones primarias en la cabeza se infligen aleatoriamente en términos de localización y fuerza del impacto. Además, ambos métodos dieron como resultado una mortalidad considerable, causada por daños colaterales inevitables a otras partes del cuerpo y órganos internos. Aquí, describimos un nuevo método para inducir mTBI en las moscas de la fruta. Nuestro aparato consiste en un impactador balístico propulsado por gas. En comparación con los modelos 14 , 15 de Drosophila existentes, nuestro método tiene la ventaja, Dirigido solamente al cabezal de mosca libre, permitiendo así el control preciso de varios factores, tales como la severidad del impacto, el intervalo de tiempo entre impactos y el número total de impactos sostenidos.

<table><tbody><tr><td>Barrera de aerosol</td><td>USA Scientific</td><td>1120-8810</td><td>Utilizado como impactador</td></tr><tr><td>200 &#956; L Punta de pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0706</td><td>Utilizado como soporte de cabeza de mosca</td></tr><tr><td>1000 &#956; L Punta de pipeta</td><td>USA Scientific</td><td>1122-1830</td><td>Utilizada como conector</td></tr> 1 <tr><td>mL Jeringa de tuberculina</td><td>Becton Dickinson</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Placas de Petri</td><td>Fisher Scientific FB0875713A</td><td></td><td>Utilizada como regulador de flujo de arenas de seguimiento</td></tr><tr><td></td><td>Genesee Scientific</td><td>59-122WC</td><td></td></tr><tr><td>Sujetador/soporte de abrazadera estándar</td><td>EISCO Scientific</td><td>CH0688</td><td></td></tr><tr><td>Cepillo fino</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-204</td><td></td></tr><tr><td>Flypad</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-114</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard Elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>4019862</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD Microsoft</td><td>&nbsp;</td><td>HD-5000</td><td></td></tr><tr><td>Ctrax Walking Fly Tracker</td><td>Caltech</td><td>Ctrax 0.2.11</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB Image Processing Toolbox</td><td>MATLAB</td><td>R2015b</td><td></td></tr></tbody></table>

un nuevo método para modelar la encefalopatía traumática crónica<em&gt; drosophila</em

A Novel Method to Model Chronic Traumatic Encephalopathy in Drosophila

La encefalopatía traumática crónica (CTE) es una enfermedad neurodegenerativa establecida que está estrechamente asociada con la exposición a lesiones traumáticas cerebrales leves y repetitivas (mTBI). Los mecanismos responsables de sus complejos cambios patológicos siguen siendo en gran medida evasivos, a pesar de un reciente consenso para definir los criterios neuropatológicos. En este trabajo se describe un método novedoso para desarrollar un modelo de CTE en Drosophila melanogaster ( Drosophila ) en un intento de identificar los genes clave y las vías que conducen a la acumulación de tau hiperfosforilada característica y la muerte neuronal en el cerebro. Los impactos de fuerza ajustable para infligir heridas cerradas leves se entregan directamente a la cabeza de mosca, sometiendo la cabeza a aceleración y deceleración rápidas. Nuestro método elimina los problemas potenciales inherentes con otros modelos de mTBI de Drosophila ( por ejemplo, la muerte animal podría ser inducida por daño aOtras partes del cuerpo oa los órganos internos). Cuanto menor sea el trabajo y el costo de cuidados intensivos de los animales, la vida corta y herramientas genéticas extensas hacen la mosca de la fruta ideal para estudiar la patogénesis CTE y que sea posible realizar a gran escala, genoma amplia genética y pantallas farmacológicas. Anticipamos que la caracterización en curso del modelo generará ideas mecanicistas importantes sobre la prevención de enfermedades y enfoques terapéuticos.

Para establecer un modelo de CTE utilizando Drosophila para adultos, determinamos la eficacia de nuestro dispositivo al infligir una sola lesión de cabeza cerrada. Para eliminar las variaciones relacionadas con el genotipo, el sexo o la edad, se utilizaron 2 días de edad Canton-S WT moscas hembra en el experimento. Podríamos controlar fácilmente la resistencia del impactador regulando el caudal de CO 2 a una presión de gas constante de 100 kPa. Las moscas expuestas a ...

Aquí, describimos un nuevo enfoque para infligir la lesión cerebral traumática de cabeza cerrada en Drosophila melanogaster . Nuestro método tiene la ventaja de entregar directamente impactos repetitivos con fuerza ajustable a la cabeza sola. Una mayor exploración del sistema de invertebrados ayudará a iluminar la patogénesis de la encefalopatía traumática crónica.

Un nuevo método para modelar la encefalopatía traumática crónica<em&gt; Drosophila</em

Chronic Traumatic Encephalopathy (CTE) is an established neurodegenerative disease that is closely associated with exposure to repetitive mild Traumatic ...

El objetivo general de este nuevo procedimiento es inducir lesiones cerebrales traumáticas cerradas en la mosca de la fruta, Drosophila, para establecer un nuevo modelo de encefalopatía traumática crónica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la encefalopatía traumática crónica, como cómo el trauma repetitivo induce la degeneración neuronal. La principal ventaja de esta técnica es que aplica impactos repetitivos de intensidades ajustables directamente sobre la cabeza de la mosca sin causar daño a otras partes del cuerpo del animal.La demostración en el mundo real de este método es fundamental, ya que el montaje del dispositivo y los pasos de carga de las moscas son difíciles de aprender, debido a que la cabeza de Drosophila es muy pequeña y es importante aplicar el impacto únicamente en la cabeza. Para construir el aparato utilizado para conmocionar o golpear las moscas de la fruta, primero fabrique la parte del impactador del aparato. Retire el émbolo de una jeringa tuberculínica de policarbonato de un mililitro y luego corte el cilindro en la marca de un mililitro.Para un impactador, utilice la barrera de aerosol encontrada en una punta de pipeta de 200 microlitros. Este impactador debe tener tres milímetros de longitud y cuatro milímetros de diámetro. Luego, coloque el impactador dentro del cuerpo de la jeringa con el lado plano hacia la boquilla.Para proporcionar fuerza, conecte el cuerpo de la jeringa a un regulador de flujo de dióxido de carbono. El regulador debe tener un interruptor de encendido/apagado y un buen control de la velocidad de flujo de gas. Luego, sujete el cuerpo verticalmente a un soporte de hierro, de manera que el impactador caiga hacia el fondo del cuerpo.A continuación, prepare el soporte para moscas. Comience con una punta de pipeta de 200 microlitros. Corte la punta de la pipeta a cinco milímetros desde el extremo pequeño para obtener una abertura de 8 milímetros de diámetro.Una cabeza de mosca pasará por este orificio, pero el tórax no. Por último, prepare un soporte para la mosca y un dispositivo de impacto. Primero, corte la punta de una pipeta de un mililitro a 44 milímetros de la abertura pequeña.En segundo lugar, corte un trozo de seis milímetros de longitud de la cubierta de la aguja para una jeringa de un mililitro. A continuación, empuje los dos elementos juntos. Anestesie una sola mosca hembra adulta de dos días de edad utilizando dióxido de carbono.Desde la almohadilla de dióxido de carbono, utilice un pincel fino para transferir suavemente la mosca al soporte. Luego, golpee suavemente el soporte hasta que la cabeza sobresalga de la punta. Si se expone el probóscide, use una aguja de jeringa de un mililitro roma para introducirla suavemente de nuevo dentro de la punta.Es fundamental mantener el cuerpo de la mosca, especialmente la parte bucal, dentro del soporte. De lo contrario, la mosca podría morir debido a daños en los órganos internos o por no poder ingerir alimento. A continuación, ajuste la presión de gas a 100 kilopascales y regule el flujo según sea necesario.Una vez cargada la mosca, apriete el soporte al cuerpo de la jeringa utilizando el conector, de modo que la cabeza de la mosca quede orientada hacia abajo. Luego, mediante el interruptor de palanca, envíe un impulso de gas que mueva el impactador para golpear a la mosca una sola vez y únicamente una vez. Ahora, desacople el soporte de la mosca y devuélvala a la placa de dióxido de carbono.Cepille la mosca hacia un vial vacío hasta que se recupere. Mantenga una mosca por vial. La recuperación toma solo unos minutos.Repita el proceso para probar cuatro moscas por grupo experimental. El procesamiento de dos grupos, uno de prueba y uno control, debería tomar solo de 20 a 30 minutos. Trate a los controles igual que a los animales de prueba, excepto que no incluya una barrera de aerosol en el tubo del impactador.Para rastrear los movimientos de las moscas en una placa de Petri, primero llene una placa de seis centímetros con elastómero de silicona transparente para crear la arena de rastreo. Deje un espacio de tres milímetros entre la silicona y la tapa para que las moscas puedan caminar libremente en el espacio, pero no puedan volar. Debajo de la arena de rastreo, coloque un fondo blanco.A continuación, anestesie cuatro moscas del mismo grupo de tratamiento y colóquelas en la arena. Deje que las moscas se aclimaten durante una hora a la arena, la cual debe estar completamente iluminada y a aproximadamente 22 grados Celsius. No más caliente que la temperatura ambiente.Después de una hora, utilice una cámara de dispositivo acoplado a carga colocada sobre la arena para registrar la actividad de la mosca durante cinco minutos. Tras la grabación de cinco minutos, anestesie las moscas en la arena y devuélvalas a un nuevo vial de alojamiento. Luego, deseche la arena.Posteriormente, analice las grabaciones utilizando el software Ctrax disponible gratuitamente. Este software genera datos de seguimiento, que pueden exportarse en un formato compatible con lenguajes programables, como el formato de MATLAB. A partir de los datos, calcule la distancia recorrida por cuadro, la distancia media caminada por cada mosca y la distancia promedio recorrida por mosca.Para obtener significancia estadística, se espera analizar alrededor de 100 moscas por grupo de tratamiento. Para establecer un modelo de encefalopatía traumática crónica, se analizó la eficacia de una lesión única en la cabeza cerrada, provocada por el aparato de impacto a diferentes velocidades, utilizando hembras de dos días de edad de la cepa Canton-S. La presión del gas se mantuvo en 100 kilopascales.Las moscas expuestas a un solo impacto en el caudal más alto probado presentaron defectos externos mínimos. A pesar de no haber evidencia clara de daño externo, las lesiones a un caudal de 15 litros por minuto fueron agudamente letales, lo que resultó en una supervivencia inferior al 10 % dentro de las 24 horas. La supervivencia aumentó con caudales más bajos.Se logró una supervivencia del cien por ciento a cinco litros por minuto o menos, por lo que se seleccionó cinco litros por minuto como el estándar para el modelo. Poco después de ser impactadas, las moscas recuperaron gradualmente su movilidad en cuatro minutos. La recuperación en los controles fue aproximadamente un minuto más rápida.Después del impacto, se utilizó un seguimiento del movimiento asistido por video para medir la función locomotora. Durante los dos días posteriores al impacto, la locomoción volvió lentamente a la normalidad. Esta evidencia de recuperación gradual está en consonancia con la recuperación de la ETC en humanos.Para evaluar los efectos a largo plazo, se aplicó un protocolo de lesión cerebral traumática repetitiva con cinco impactos durante cinco días. Veinte días después del tratamiento, se comparó la locomoción de los miembros sobrevivientes en cada grupo y se observó claramente que el grupo tratado caminaba menos. La longevidad del grupo tratado también se redujo sustancialmente, con una mediana de 26 días en comparación con 37 días para los controles.Después de su desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la lesión cerebral traumática leve y repetitiva exploren los mecanismos patógenos en el modelo animal clásico Drosophila melanogaster. Al intentar este procedimiento, es importante recordar proteger el probóscide, el tórax y el abdomen del impacto directo mediante la barrera de aerosol.

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Investigación

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Neurociencia

Los ensayos para medir el comportamiento de las funciones del aparato locomotor, el aprendizaje y las habilidades de memoria...

Locomotor ensayo, aprendizaje, memoria y déficit en Drosophila Los modelos de neurodegeneración

Este video describe cómo rastrear moscas que caminan libremente para evaluar su capacidad general de locomoción. El protocolo presentado demuestra la configuración del ensayo y el análisis de datos mediante software de seguimiento de vídeo.

Seguimiento de moscas que caminan libremente: un método para evaluar la locomoción en Drosophila

Este video muestra un procedimiento para infligir una lesión traumática de cabeza cerrada en moscas Drosophila anestesiadas utilizando un dispositivo de impacto con un impactador propulsado por gas. La lesión afecta la función neuronal y afecta la capacidad para caminar.

Una técnica para infligir una lesión cerebral traumática de cabeza cerrada en moscas Drosophila

El video muestra el uso de un dispositivo de Trauma de Alto Impacto (HIT) para inducir una lesión cerebral traumática (TBI) de cabeza cerrada en Drosophila. El traumatismo craneoencefálico provoca un traumatismo craneoencefálico mecánico que afecta a la función neuronal, lo que con el tiempo conduce a la neurodegeneración y la mortalidad.

Un método para infligir una lesión cerebral traumática de cabeza cerrada en Drosophila

Este video demuestra la inducción de una lesión cerebral traumática penetrante en el cerebro de Drosophila. Las moscas recién emergidas se seleccionan, se anestesian y se colocan bajo un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia. Se identifica el cuerpo del hongo que expresa GFP y se inserta un alfiler de Minutien para causar lesiones. Se permite que las moscas se recuperen para realizar estudios adicionales.

Inducción de una lesión cerebral traumática penetrante en moscas Drosophila adultas

Se describen aquí los procedimientos para la extracción y purificación de ARNm y metabolitos...

Purificación de las transcripciones y los metabolitos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Cabezales

A continuación se describen dos ensayos que se han establecido para estudiar la neurodegeneración dependiente de la edad de las neuronas dopaminérgicas (DA)...

La evaluación de fenotipos neurodegenerativas en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas dopaminérgicas mediante ensayos de Escalada y inmunotinción de todo el cerebro

Presentamos un ensayo de geotaxis negativo optimizado, barato y fiable en Drosophila melanogaster como modelo para trastornos neurodegenerativos. Al ser más sensible a los defectos locomotores leves, este ensayo ayudará a detectar posibles interacciones genéticas y objetivos farmacológicos.

Análisis cuantitativo de los Defectos de escalada en un modelo de Drosophila de enfermedades neurodegenerativas

Aquí se describe un método para infligir cabeza cerrada lesión cerebral traumática (TBI) en Drosophila. Este método proporciona una puerta de entrada para investigar los mecanismos celulares y moleculares que subyacen a patologías TBI utilizando la amplia gama de herramientas experimentales y técnicas disponibles para las moscas.

Un método para infligir Cerrado Jefe lesión cerebral traumática en<em&gt; Drosophila</em

Drosophila se utiliza ampliamente como un sistema modelo para estudiar la neurodegeneración. Este protocolo describe un método por el cual la degeneración, como se determina por la formación de vacuolas en el cerebro, se puede cuantificar. También minimiza los efectos debido al procedimiento experimental por el procesamiento y control de seccionamiento y moscas experimentales como una muestra.

La histología de masas para cuantificar la neurodegeneración en<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Aprende a inducir lesiones cerebrales traumáticas cerradas en Drosophila melanogaster para modelar la encefalopatía traumática crónica. Este método permite impactos repetitivos controlados directamente en la cabeza de la mosca.

Un nuevo método para modelar la encefalopatía traumática crónica

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