Enfoque preciso de la ablación celular para modelar lesiones renales agudas en el desarrollo de pez cebra

El objetivo general de este procedimiento es inducir la ablación dirigida de células epiteliales del riñón de pez cebra para modelar la lesión y la reparación del nefrón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la regeneración de órganos, específicamente del riñón, tales como: cuáles son los principales procesos celulares implicados en la regeneración, cuál es el grado de plasticidad de los tejidos sobrevivientes y muchas otras.

La principal ventaja de esta técnica es que permite un control espacial y temporal preciso de la lesión, así como la posibilidad de ajustar el grado de lesión. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o tratamiento de la lesión renal aguda, ya que permite una evaluación espacial y temporal precisa de los procesos celulares y moleculares implicados en la lesión y regeneración de las células renales. Para comenzar, genere embriones cruzando peces cebra fluorescentes GFP en el riñón.

Durante 24 horas posteriores a la fertilización, mantenga los embriones en solución E3 a 28,5 grados Celsius. Luego, utilice PTU al 0,003 % en E3 para reemplazar el medio E3. Devuelva los embriones al incubador durante seis días o más, momento en el cual los riñones ya habrán madurado.

Para preparar el pez cebra para imágenes en vivo, prepare agarosa de bajo punto de fusión al 1% al 2% con una solución de tricaina a 0,2 miligramos por mililitro. Asegúrese de que la solución de agarosa y tricaina esté fría antes de usar una pipeta de plástico o vidrio para transferir un embrión a la solución. A continuación, utilizando una pipeta de transferencia, aspire la larva en la agarosa y colóquela en el centro de una placa de 35 milímetros.

Extienda rápidamente el agarosa que contiene el pez cebra para cubrir uniformemente el fondo del recipiente. Luego, utilice una sonda de vidrio para orientar la larva para la ablación fotónica y el análisis de imágenes, de modo que el segmento renal de interés quede perpendicular al trayecto del haz, mientras que el segmento contralateral quede alejado del haz láser. La orientación del pez cebra es crucial para los pasos siguientes que implican la ablación con láser.

Se recomienda una buena técnica para asegurar que las larvas mantengan una posición perpendicular en el agarosa. Cubra la placa de Petri para minimizar la evaporación y deje que el agarosa se solidifique durante aproximadamente 15 minutos. Después de configurar el microscopio confocal, según el protocolo descrito, en la configuración vertical, coloque la placa de Petri que contiene la larva encima de una portaobjetos y utilice arcilla modeladora para mantenerla en su lugar.

A continuación, coloque la placa de Petri deslizante sobre la platina del microscopio. Luego, agregue tres mililitros de solución de imagen. Bajo un objetivo de inmersión en agua, eleve lentamente la platina, asegurándose de que el objetivo esté ligeramente inclinado para evitar que el aire quede atrapado en la trayectoria del haz.

Una vez que la lente toque la solución en un ángulo, colóquela en el centro de manera que quede en el campo de visión del embrión. Ahora, utilizando la fuente de luz fluorescente, localice el segmento de interés y, a continuación, enfoque la rama superficial para dirigirse a ella y provocar la lesión. Se eligen las ramas superficiales para minimizar la dispersión de la luz.

En el software del microscopio, vaya a vista, control de adquisición, interfaz gráfica compacta C2plus. Establezca el tiempo de permanencia por píxel en 1,9 microsegundos, el tamaño de cuadro en 512 por 512 píxeles y el tamaño del diafragma en 90 micrones. Ajuste la intensidad del láser de 405 nanómetros a cero y la intensidad del láser de 488 a un valor bajo.

Mientras utiliza el láser de 488 nanómetros, haga clic en escanear en la interfaz del software. Localice el segmento de interés que sea perpendicular al trayecto del haz y que se visualice bien con una buena fluorescencia GFP. Una vez identificada esa región, vaya a ROI, dibuje un ROI elíptico, para delimitar una región de interés.

A continuación, vaya a vista, controles de adquisición, área de escaneo C2plus y seleccione el área de escaneo de banda; aparecerá una máscara rectangular dentro de esa interfaz. Utilizando el cursor, defina manualmente un escaneo rectangular para cubrir el segmento destinado a la ablación con láser. Haga clic derecho dentro del área de la máscara para aceptar la selección.

Usando únicamente el láser de 488 nanómetros para activar la GFP, inicie la medición del tiempo mientras monitorea el canal verde. Asegúrese de que la intensidad del láser de 488 sea relativamente baja. Mida la intensidad promedio de la GFP en la región de interés seleccionando medir, medición de tiempo.

Utilice la gráfica o la pestaña de datos para monitorear los niveles promedio de intensidad dentro de la ROI. Usando el láser violeta, induzca daño en las células renales aumentando la intensidad al 100 % deslizando el control de potencia del láser completamente hacia la derecha. En la pestaña de gráfica, observe un gráfico de líneas o utilice la pestaña de datos para observar los valores numéricos de la intensidad de GFP y espere hasta que disminuya a un nivel deseado.

Por ejemplo, el 50 % del valor inicial. Una vez que la intensidad de GFP dentro de la ROI elíptica haya disminuido hasta el nivel deseado, reduzca inmediatamente la intensidad del láser violeta a cero en el panel de control del software moviendo el control deslizante de potencia del láser completamente hacia la izquierda. Finalmente, obtenga una nueva línea de base de la fluorescencia de GFP.

Como se muestra en esta figura, tras la exposición a luz láser de 405 nanómetros, la fluorescencia de GFP continúa desapareciendo una célula a la vez. Hasta que, a los 220 minutos, todo el segmento ablado pierde el 100 % de su positividad para GFP. Esto se debe a la muerte celular y no a la regulación negativa de la expresión de GFP, como se observa por la aparición de núcleos positivos para yoduro de propidio con fluorescencia roja en las células que pierden positividad para GFP.

Estas imágenes demuestran que al variar la exposición inicial, es posible ajustar la lesión y la respuesta del epitelio lesionado. Con un blanqueo fotoquímico inicial de GFP del 10% al 20%, prácticamente no se observa reducción en la positividad de GFP a las cinco horas posteriores a la lesión. El 50% y el 60% provocan una desaparición completa de GFP a las cinco horas, mientras que el blanqueo del 30% y el 40% produce resultados intermedios, con una muerte estimada del 50% observada aproximadamente al 35% de blanqueo fotoquímico.

Esto se respalda mediante la tinción con yoduro de propidio, donde el blanqueo fotográfico al 20% resulta en prácticamente ninguna tinción con yoduro de propidio a los 100 minutos posteriores a la ablación. Sin embargo, el blanqueo fotográfico al 50% provoca una positividad continua al yoduro de propidio en el epitelio ablatado después de 60 minutos. Mientras que el blanqueo fotográfico al 30% y al 40% conduce a una incorporación intermedia de yoduro de propidio.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si se lleva a cabo correctamente. No olvide que trabajar con láseres y reactivos químicos puede ser extremadamente peligroso, y siempre deben tomarse precauciones como evitar mirar directamente el haz láser y usar guantes al manipular productos químicos durante la realización de este procedimiento. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como microscopía de lapso de tiempo, tinción de inmunofluorescencia y otros, con el fin de responder preguntas adicionales destinadas a analizar la lesión y la reparación renal a nivel celular y molecular.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para los investigadores en el campo de la regeneración renal. Para explorar el papel de la migración colectiva de células y la reparación renal tras una lesión en el pez cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la microscopía confocal para lesionar segmentos renales específicos en larvas y embriones de pez cebra transgénicos GPF.