Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Este protocolo describe la fabricación de redes neuronales de micro-tejido o micro-TENNs, que son construcciones tridimensionales en miniatura compuestas por tractos axonales largos alineados que abarcan poblaciones neuronales discretas dentro de la luz de un hidrogel tubular. Las micro-TENN replican la anatomía general del conectoma cerebral, específicamente, grupos funcionalmente similares de neuronas conectadas por largos tractos axonales. Debido a que están pre-desarrollados para emular la citoarquitectura de las vías cerebrales, los micro-TENN se pueden aplicar para la reconstrucción dirigida de circuitos neuronales perdidos debido a un trauma o enfermedad neurodegenerativa y como modelos biofidílicos para estudios neurobiológicos.

Uno de los aspectos más desafiantes de este protocolo es trabajar con el factor de forma a escala micrométrica, que en última instancia es necesario para permitir una administración mínimamente invasiva en el cerebro. Comience rompiendo manualmente los tubos capilares de vidrio en fragmentos de 2 a 2,5 centímetros e inserte una aguja de acupuntura en cada fragmento. Transfiera un mililitro de agarosa al tres por ciento en DPBS a la superficie de una placa de Petri vacía.

Sujetando el tubo capilar en la aguja introducida, coloque un extremo del tubo en contacto con la piscina de agarosa líquida para llenarla por capilaridad. Cuando el líquido deje de subir, retire el tubo capilar de la piscina y colóquelo horizontalmente sobre la superficie de una placa de Petri. A continuación, coloque el pulgar y el índice a cada lado del tubo y sujételo con fuerza.

Utilice la otra mano para sacar rápidamente la aguja, mientras que el pulgar y el índice evitan que la microcolumna se deslice fuera del tubo. A continuación, inserte una aguja de calibre 30 en el tubo capilar para empujar lentamente la microcolumna hacia fuera en una placa que contenga DPBS. Transfiera con cuidado una microcolumna de DPBS a un plato vacío con pinzas finas.

Agregue 10 microlitros de DPBS en la parte superior de la microcolumna con un micropipeteado para evitar que se seque. Mientras trabaja bajo un microscopio estereoscópico, dispare la microcolumna con un microbisturí para acortarla a la longitud deseada. A continuación, utilice pinzas finas para transferir la microcolumna recortada a una placa de Petri diferente que contenga DBPS.

Esterilice las microcolumnas de las placas de Petri que contienen DPBS bajo luz ultravioleta durante 30 minutos. Use una broca para perforar 16 agujeros como una matriz de 4 centímetros de 4 por 4 con una separación de 1 centímetro en la tapa de una placa de Petri de 10 centímetros. Dentro de una campana de gases químicos, use la pieza inferior de una placa de Petri para pesar 27 gramos de PDMS y tres gramos de agente de curado.

Revuelva con una micro espátula para distribuir el agente de manera uniforme. A continuación, cubra el agente de curado PDMS con la tapa perforada. Conecte un extremo de una manguera al puerto de vacío de la campana extractora e inserte el otro extremo en el vástago de un embudo de tamaño adecuado.

Coloque una pera de pipeta de 1 mililitro en una punta de 1 mililitro en la manguera y tire de la manguera hacia arriba hasta que la pera selle la manguera en el vástago del embudo. A continuación, coloque el embudo en la tapa del plato perforada y asegure la manguera con un soporte resistente disponible. Abra la válvula de vacío durante cinco minutos para succionar y llevar las burbujas de aire a la superficie.

Después de cinco minutos, cierre la válvula, retire el embudo y golpee la placa de Petri contra la superficie de la campana extractora varias veces para reventar las burbujas de aire restantes. Coloque un molde piramidal impreso en 3D en cada uno de los pocillos en una placa de cultivo de 12 pocillos con las pirámides apuntando hacia arriba. A continuación, vierta el agente de curado PDMS sobre los moldes hasta que se llene cada pocillo de la placa.

Transfiera la placa cubierta a un horno durante una hora a 60 grados centígrados para que se seque. Después de esterilizar las matrices de PDMS mediante autoclave y trabajar en una cabina de bioseguridad, inserte una matriz de micropocillos en cada pocillo de una placa estéril de 12 pocillos. Para formar los agregados neuronales, use un micropipete para agregar 12 microlitros de suspensión celular en cada micropocillo de la matriz de PDMS.

Centrifugar la placa a 200 veces g durante cinco minutos para forzar la agregación de células en el fondo de los micropocillos. Luego, agregue con cuidado aproximadamente dos mililitros de medio de cultivo en la parte superior de cada matriz de PDMS para cubrir todos los micropocillos sembrados. Incubar la placa durante 12 a 24 horas a 37 grados centígrados en 5% de dióxido de carbono.

Para comenzar la fabricación del núcleo CEM, mezcle colágeno tipo 1, laminina y medio de cultivo en un tubo de microcentrífuga y ajuste el pH a 7.2 a 7.4. A continuación, coloque el tubo que contiene CEM en hielo. Utilice pinzas estériles para transferir las microcolumnas a placas de Petri vacías de 35 o 60 milímetros.

Luego, mientras trabaja bajo un microscopio estereoscópico, use una punta de 10 microlitros conectada a una punta de 1000 microlitros para extraer DPBS residuales y burbujas de aire del lumen. Extraiga rápidamente de cuatro a cinco microlitros de CEM en una micropipeta, luego coloque la punta de la micropipeta en un extremo de una microcolumna y descargue suficiente CEM para llenar el lumen. Para evitar la deshidratación, agregue dos microlitros de CEM alrededor de cada microcolumna.

Incubar las microcolumnas de hidrogel CEM en placas de Petri a 37 grados centígrados en dióxido de carbono al 5% durante 15 minutos. Proceda a la siembra de células inmediatamente después de la incubación. Transfiera aproximadamente de 10 a 20 microlitros de medio de cultivo a dos áreas libres en las placas de Petri que contienen las microcolumnas.

Utilice un micropipete para recoger los agregados neuronales individualmente y transfiéralos a la placa de Petri que contiene las construcciones. Mueva los agregados con pinzas a uno de los pequeños grupos de medio de cultivo para preservar la salud celular. Mientras observa bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas para insertar un agregado en un extremo de las microcolumnas para micro-TENN unidireccionales, o en cada extremo para arquitectura bidireccional.

A continuación, mueva la microcolumna sembrada a la otra pequeña piscina de medio de cultivo para evitar la deshidratación y preservar la salud del agregado. Cuando se hayan cargado todas las microcolumnas, incubar a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos para permitir que los agregados se adhieran a la CEM. Después de la incubación, verifique que los agregados permanezcan en los extremos de las microcolumnas utilizando el microscopio estereoscópico.

Por último, inunde cuidadosamente las placas de Petri que contienen los micro-TENN con medio de cultivo utilizando una pipeta. Coloque los platos en una incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono para el cultivo a largo plazo. Estas imágenes de contraste de fase muestran micro-TENN unidireccionales de 2 mililitros de largo hasta ocho días in vitro.

En estas imágenes, observe los agregados neuronales en los extremos de la microcolumna, mientras que los tractos axonales alineados se proyectan a través del lumen. Como se ve aquí, los tractos axonales se extienden casi a lo largo de toda la microcolumna en cinco días in vitro. En el caso de las micro-TENN bidireccionales de 5 milímetros, los tractos axonales pueblan la longitud de la microcolumna a los 5 días in vitro, y esta arquitectura se mantiene al menos hasta 10 días in vitro.

Las dos imágenes siguientes pueden ayudar a solucionar problemas con el procedimiento. Esta imagen muestra una microcolumna de hidrogel seco completamente deshidratada como resultado de la eliminación completa y/o evaporación de DPBS, CEM o medio de cultivo durante la fabricación. Esta imagen muestra una microcolumna con el lumen recubriendo la pared exterior debido a la falta de alineación concéntrica de la aguja de acupuntura con el tubo capilar.

Finalmente, esta imagen confocal muestra una micro-TENN bidireccional a los 28 días in vitro, teñida para núcleos celulares con Hoechst en azul, y con axones marcados con tudge uno en rojo, y botones presinápticos marcados con sinapsina 1 en verde. La migración celular de los agregados a lo largo de los tractos axonales se observa en presencia de terminales presinápticas, como se sugiere. Los Micro-TENN son construcciones autónomas de inspiración anatómica que emulan aspectos clave de la citoarquitectura del conectoma; por lo tanto, las micro-TENN pueden proporcionar un medio para reemplazar las vías neuronales perdidas al implantarse en el cerebro.

Los componentes cruciales de este método incluyen el esquema de encapsulamiento de biomaterial tubular, que permite el crecimiento axonal longitudinal, y el método agregado, que asegura la obtención de la citoarquitectura adecuada de los cuerpos celulares restringidos a los extremos de los tractos axonales a lo largo del interior. Tras el dominio de estos métodos, los principios de esta técnica se pueden aplicar para construir micro-TENNs con otros fenotipos celulares y componentes de biomateriales, según la aplicación específica.