Anatomía Inspirada Tridimensional Micro-tejido Ingeniería de Redes Neuronales para la Reconstrucción del Sistema Nervioso, Modulación y Modelado

Este protocolo describe la fabricación de redes neuronales microingenierizadas o micro-TENNs, que son construcciones tridimensionales en miniatura compuestas por tractos axonales alineados largos que conectan poblaciones neuronales discretas dentro de la luz de un hidrogel tubular. Las micro-TENNs replican la anatomía general a nivel de sistemas del conectoma cerebral, específicamente grupos funcionales similares de neuronas conectadas por tractos axonales largos. Debido a que se cultivan previamente para emular la arquitectura citológica de las vías cerebrales, las micro-TENNs pueden aplicarse para la reconstrucción dirigida de circuitos neuronales perdidos debido a traumatismos o enfermedades neurodegenerativas, así como modelos biofídiles para estudios neurobiológicos.

Uno de los aspectos más desafiantes de este protocolo es trabajar con un factor de forma a escala micrométrica, lo cual es fundamental para permitir una administración mínimamente invasiva en el cerebro. Comience rompiendo manualmente tubos capilares de vidrio en fragmentos de 2 a 2,5 centímetros e inserte una aguja de acupuntura en cada fragmento. Transfiera un mililitro de agarosa al tres por ciento en DPBS a la superficie de una placa de Petri vacía.

Sosteniendo el tubo capilar en la aguja introducida, coloque un extremo del tubo en contacto con la masa líquida de agarosa para llenarlo por acción capilar. Cuando el líquido deje de ascender, retire el tubo capilar de la masa y colóquelo horizontalmente sobre la superficie de una placa de Petri. A continuación, coloque el pulgar y el dedo índice a ambos lados del tubo y apriételo firmemente.

Utilice la otra mano para extraer rápidamente la aguja mientras el pulgar y el dedo índice evitan que la microcolumna en sí se deslice fuera del tubo. Luego, inserte una aguja de calibre 30 en el tubo capilar para empujar lentamente la microcolumna hacia un recipiente que contenga DPBS. Transfiera cuidadosamente una microcolumna desde DPBS hacia un recipiente vacío utilizando pinzas finas.

Añada 10 microlitros de DPBS en la parte superior de la microcolumna con una micropipeta para evitar que se seque. Mientras trabaja bajo un estereomicroscopio, corte la microcolumna con un escalpelo microscópico para acortarla a la longitud deseada. Luego, use pinzas finas para transferir la microcolumna recortada a una placa de Petri diferente que contenga DPBS.

Sterilice las microcolumnas en las placas de Petri que contienen DPBS bajo luz ultravioleta durante 30 minutos. Utilice una broca para perforar 16 orificios en una matriz de 4 por 4 de 4 centímetros con una separación de 1 centímetro en la tapa de una placa de Petri de 10 centímetros. Dentro de una campana extractora química, utilice la parte inferior de una placa de Petri para pesar 27 gramos de PDMS y tres gramos de agente de curado.

Agite con una espátula micro para distribuir el agente uniformemente. Luego cubra el agente de curado de PDMS con la tapa perforada. Conecte un extremo de una manguera al puerto de vacío de la campana extractora e inserte el otro extremo en el vástago de un embudo de tamaño adecuado.

Coloque una perilla de pipeta de 1 mililitro con una punta de 1 mililitro dentro de la manguera y tire de la manguera hacia arriba hasta que la perilla selle la manguera en el vástago del embudo. A continuación, coloque el embudo sobre la tapa del recipiente perforada y asegure la manguera con un soporte resistente disponible. Abra la válvula de vacío durante cinco minutos para aspirar y hacer subir las burbujas de aire a la superficie.

Después de cinco minutos, cierre la válvula, retire el embudo y golpee la placa de Petri contra la superficie de la campana extractora varias veces para reventar cualquier burbuja de aire restante. Coloque un molde piramidal impreso en 3D en cada uno de los pocillos de una placa de cultivo de 12 pocillos, con las pirámides orientadas hacia arriba. Luego vierta el agente de curado de PDMS sobre los moldes hasta que cada pocillo de la placa esté lleno.

Transfiera la placa cubierta a un horno durante una hora a 60 grados Celsius para secarla. Después de esterilizar los arreglos de PDMS mediante autoclave y trabajando en una cabina de seguridad biológica, inserte un arreglo de micropocillos en cada pocillo de una placa de 12 pocillos estéril. Para formar los agregados neuronales, utilice una micropipeta para añadir 12 microlitros de suspensión celular en cada micropocillo del arreglo de PDMS.

Centrifugar la placa a 200 veces g durante cinco minutos para forzar la agregación de las células en el fondo de los micropozos. Luego, agregar cuidadosamente aproximadamente dos mililitros de medio de cultivo en la parte superior de cada matriz de PDMS para cubrir todos los micropozos sembrados. Incubar la placa durante 12 a 24 horas a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono.

Para comenzar la fabricación del núcleo de CEM, mezcle colágeno tipo 1, laminina y medio de cultivo en un tubo de microcentrífuga y ajuste el pH a 7,2-7,4. A continuación, coloque el tubo que contiene el CEM en hielo. Utilice pinzas estériles para transferir las microcolumnas a placas de Petri vacías de 35 o 60 milímetros.

Luego, mientras trabaja bajo un estereomicroscopio, utilice una punta de 10 microlitros conectada a una punta de 1000 microlitros para extraer el DPBS residual y las burbujas de aire del lumen. Aspire rápidamente de cuatro a cinco microlitros de CEM con una micropipeta, luego coloque la punta de la micropipeta en un extremo de una microcolumna y expulse suficiente CEM para llenar el lumen. Para prevenir la deshidratación, agregue dos microlitros de CEM alrededor de cada microcolumna.

Incube las microcolumnas de hidrogel CEM en placas de Petri a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono durante 15 minutos. Proceda inmediatamente a la siembra celular tras la incubación. Transfiera aproximadamente de 10 a 20 microlitros de medio de cultivo a dos áreas libres en las placas de Petri que contienen las microcolumnas.

Utilice una micropipeta para recoger individualmente los agregados neuronales y transfiéralos a la placa de Petri que contiene los constructos. Mueva los agregados con pinzas a uno de los pequeños depósitos de medio de cultivo para preservar la salud celular. Mientras observa bajo un microscopio estereoscópico, use pinzas para insertar un agregado en un extremo de las microcolumnas para micro-TENNs unidireccionales, o en cada extremo para una arquitectura bidireccional.

Luego, traslade la microcolumna sembrada a otra pequeña poza de medio de cultivo para evitar la deshidratación y preservar la salud del agregado. Cuando todas las microcolumnas hayan sido cargadas, incúbelas a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono durante 45 minutos para permitir que los agregados se adhieran al MCE. Tras la incubación, verifique que los agregados permanezcan en los extremos de las microcolumnas utilizando el estereomicroscopio.

Por último, inunde cuidadosamente las placas de Petri que contienen los micro-TENNs con medio de cultivo utilizando una pipeta. Coloque las placas en un incubador a 37 grados Celsius en atmósfera de 5% de dióxido de carbono para cultivo a largo plazo. Estas imágenes de contraste de fase muestran micro-TENNs de 2 mililitros de longitud unidireccional hasta ocho días in vitro.

En estas imágenes, observe los agregados neuronales en los extremos de la microcolumna, mientras que los tractos axonales alineados se proyectan a través de la luz. Como se observa aquí, los tractos axonales se extienden casi por toda la longitud de la microcolumna a los cinco días in vitro. Para micro-TENNs bi-direccionales de 5 milímetros, los tractos axonales ocupan toda la longitud de la microcolumna a los 5 días in vitro, y esta arquitectura se mantiene al menos hasta los 10 días in vitro.

Las siguientes dos imágenes pueden ayudar a solucionar problemas con el procedimiento. Esta imagen muestra una microcolumna de hidrogel seca completamente, como resultado de la eliminación total y/o evaporación de DPBS, CEM o medio de cultivo durante la fabricación. Esta imagen muestra una microcolumna con la luz alineada con la pared externa debido a la falta de alineación concéntrica de la aguja de acupuntura con el tubo capilar.

Finalmente, esta imagen confocal muestra un micro-TENN bidireccional a los 28 días in vitro, teñido para los núcleos celulares con Hoechst en azul, con axones marcados con tudge one en rojo, y con botones pre-sinápticos marcados con sinapsina 1 en verde. Se observa la migración celular desde los agregados a lo largo de los tractos axónicos en presencia de terminales pre-sinápticos, tal como se sugirió. Los micro-TENNs son construcciones autónomas e inspiradas anatómicamente que emulan aspectos clave de la citoarquitectura del conectoma; por lo tanto, los micro-TENNs podrían proporcionar un medio para reemplazar las vías neuronales perdidas tras la implantación en el cerebro.

Los componentes cruciales de este método incluyen el esquema de encapsulamiento del biomaterial tubular, que permite el crecimiento axonal longitudinal, y el método de agregación, que asegura obtener la citotectónica adecuada de los cuerpos celulares restringidos a los extremos de los tractos axonales a lo largo del interior. Tras dominar estos métodos, los principios de esta técnica pueden aplicarse para construir micro-TENNs con otros fenotipos celulares y componentes de biomateriales, según la aplicación específica.