Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

El objetivo general de este procedimiento es medir la dinámica de los microtúbulos en las células de levadura. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los microtúbulos, como la forma en que las mutaciones en los túbulos y los reguladores de los microtúbulos regulan la dinámica de los microtúbulos en una célula viva. La principal ventaja de esta técnica es que las células de levadura vivas se estabilizan en la imagen.

Más bien, alta resolución de tiempo durante diez minutos, o baja resolución de tiempo durante varias horas. Los que demuestren el procedimiento serán Colby Fees y Cassi Estrem, dos estudiantes graduados de mi laboratorio. Las células de levadura utilizadas en este experimento se han construido para expresar constitutivamente tubulina marcada con GFP.

Inocular aproximadamente un microlitro de las células de levadura de una sola colonia en una placa en tres mililitros de medio sintético completo. Deje que las células crezcan durante la noche a 30 grados centígrados con agitación a 250 RPM. Al día siguiente, diluir el cultivo saturado hasta un OD600 inferior a 0,1 en el medio.

Regrese el cultivo diluido al agitador a 30 grados centígrados durante tres o cuatro horas, o hasta que el OD600 esté entre 0,4 y 0,8. Comience la preparación de los portaobjetos de la cámara de flujo cortando una hoja de película de parafina en una pieza que mida cuatro pulgadas de ancho y siete pulgadas de largo. Coloque un portaobjetos de microscopio estándar a lo largo de la película de parafina de cuatro pulgadas de ancho y envuelva la película alrededor del portaobjetos de tres a cuatro veces de modo que el portaobjetos esté cubierto por una película de tres a cuatro capas de grosor.

Presione las capas juntas para asegurarse de que haya un sellado razonable, pero evite presionar demasiado fuerte o hacer que la película se arrugue. Usando una navaja de afeitar limpia y otra corredera para proporcionar un borde recto para cortar, corte la película de parafina a lo largo de los bordes exteriores de la diapositiva. Despegue el exceso de película de la corredera de trabajo y deséchelo.

Usando la segunda diapositiva como borde recto, corte las capas de película apiladas a lo largo del eje largo de la diapositiva en aproximadamente 10 tiras, cada una de dos a cuatro milímetros de ancho. A continuación, corte las capas de película de parafina apiladas perpendicularmente a los cortes anteriores a lo largo del eje corto de la diapositiva para crear tiras de dos a cuatro milímetros de ancho, de 23 a 24 milímetros de largo y de tres a cuatro capas de grosor. Use una navaja de afeitar en un ángulo de 45 grados para pelar las tiras de película cortadas.

A continuación, utilice pinzas para distribuir uniformemente las tiras cortadas en un portaobjetos de microscopio limpio para crear el número deseado de cámaras. En este ejemplo, se utilizarán cuatro tiras de película para crear tres cámaras. Coloque un solo cubreobjetos encima de las tiras de película y muévalo a su posición con pinzas.

Coloque el portaobjetos preparado, con la tapa hacia arriba, en una placa calefactora a unos 95 grados centígrados, y caliente el portaobjetos durante aproximadamente tres minutos hasta que las tiras de película estén translúcidas. Selle el portaobjetos y el cubreobjetos usando pinzas para presionar suavemente las regiones del cubreobjetos que están directamente encima de las tiras de película de parafina. Use pinzas para quitar el portaobjetos de la placa calefactora y déjelo a un lado para que se enfríe con el lado deslizante de la cubierta hacia arriba.

A medida que la diapositiva se enfríe, la película volverá a tener una coloración blanca opaca. Para comenzar este procedimiento, descongele una alícuota congelada de 200 microlitros de Concanavalin A a temperatura ambiente. Agregue aproximadamente 100 microlitros de Concanavalina A descongelada a cada cámara del portaobjetos preparado pipeteando en uno de los extremos abiertos.

A continuación, cuelgue la corredera, con el deslizamiento de la cubierta hacia abajo, entre dos bastidores de tubos de microfuga durante cinco minutos para permitir que la Concanavalina A se adhiera al cubreobjetos. Vuelva a colocar el portaobjetos en la posición de deslizamiento de la cubierta y retire la Concanavalina A lavando la cámara con medio sintético completo. Haga fluir dos veces el volumen de la cámara de medio a través de la cámara utilizando la esquina de una toalla de papel para extraer líquido de un extremo de la cámara, mientras pipetea simultáneamente el fluido fresco en el otro extremo de la cámara.

Cargue las células haciendo fluir dos veces el volumen de la cámara de suspensión de la celda utilizando el método de flujo dirigido. Cuelgue la corredera, con la tapa hacia abajo, durante 10 minutos para permitir que las celdas se adhieran a la corredera. Enjuague las células no adherentes fluyendo a través de cuatro veces el volumen de la cámara de medio sintético completo.

Seque cuidadosamente cada extremo de la cámara con una esquina limpia de una toalla de papel, llevando el menisco al borde del cubreobjetos. Selle cada extremo de la cámara con sellador tibio. La adquisición de imágenes se realizará con un microscopio invertido equipado con un objetivo CFI Plan Apo de 1,45 NA 100X, una platina piezoeléctrica, una unidad de escaneo confocal de disco giratorio, un láser de iluminación y una cámara EMCCD.

Mantenga la temperatura de la platina a temperatura ambiente durante la adquisición de imágenes. Coloque las celdas en foco y busque en la diapositiva las celdas agrupadas para asegurarse de que el campo de adquisición tenga al menos cinco o seis celdas agrupadas en el mismo plano focal. Programe una adquisición multidimensional para recopilar varias zSeries a lo largo del tiempo.

Ajuste la configuración dentro de la configuración de adquisición activa a lo siguiente: profundidad Z total de seis micrómetros para abarcar toda la celda de levadura, tamaño de paso Z de 300 nanómetros para maximizar la recolección de luz sin sobremuestreo, duración de tiempo total de 10 minutos, intervalos de tiempo de cuatro segundos entre zSeries y tiempo de exposición de 90 milisegundos para cada plano Z. Comience la adquisición haciendo clic en Ejecutar y permita que se ejecute durante los 10 minutos completos. Los datos se guardan como una serie de imágenes y aquí se muestra un ejemplo de resultado de imágenes de lapso de tiempo.

Inicie el análisis de la imagen abriendo ImageJ y arrastrando la pila de imágenes adquirida directamente al panel de control. Los formatos de biografía importados se iniciarán automáticamente. Seleccione Aceptar" para cargar la pila de imágenes como una hiperpila.

Con la función ZProject, contraiga cada zSeries a una intensidad máxima de proyección bidimensional. Aplique un filtro medio a la pila de imágenes para reducir el ruido de moteado seleccionando el menú de proceso, el submenú de filtro y la entidad mediana. Introduzca 2,0 píxeles en el cuadro de radio y haga clic en Aceptar"Identificar celdas pre-NFA en el campo.

Se caracterizan por tener yemas de tamaño medio y un huso mitótico corto, de aproximadamente uno a un punto cinco micrómetros de longitud. Comenzando en el primer punto de tiempo de la serie de imágenes, use la herramienta de línea segmentada para dibujar una línea a lo largo de un solo microtúbulo astral desde el ubicado en la unión entre el microtúbulo astral y los microtúbulos del huso más intensamente marcados, hasta el extremo positivo, que está en el citoplasma. Haga doble clic en el extremo del microtúbulo para completar la línea segmentada.

Registre la medición en la tabla de resultados utilizando la función de medición pulsando el botón M del teclado. Una vez que se hayan realizado las mediciones para todos los puntos de tiempo, copie los datos de la tabla de resultados, péguelos en una hoja de cálculo y seleccione Guardar como"para seleccionar los datos. Este gráfico muestra una serie temporal de la dinámica de los microtúbulos astrales en una célula de tipo salvaje, y una cepa mutante que previamente ha demostrado tener microtúbulos más estables.

Los microtúbulos se etiquetan con la tubulina alfa marcada con GFP para visualizar la longitud de los microtúbulos. Las flechas rojas trazan la longitud total de un microtúbulo astral, y las puntas de flecha denotan los extremos positivos. Las longitudes de los microtúbulos se midieron en cada punto de tiempo durante ocho minutos, y estas longitudes compiladas se representan en gráficos de vida.

Los puntos verdes denotan polimerización y los puntos rosas denotan despolimerización. Los eventos catastróficos se indican con puntas de flecha. Estos gráficos muestran que el microtúbulo en el mutante es más largo y exhibe menos catástrofes que el microtúbulo de tipo salvaje.

Además, las tasas de polimerización y despolimerización determinadas a partir de las pendientes de las longitudes de los microtúbulos ascendentes y descendentes disminuyen en el mutante en comparación con el tipo salvaje. Las mediciones de la dinámica de los microtúbulos también revelan que el microtúbulo de la célula mutante ha disminuido su dinamismo en comparación con el tipo salvaje. Una vez dominado, la preparación de portaobjetos, la carga de celdas y la adquisición de imágenes se pueden realizar en 30 minutos, lo que significa que se pueden obtener imágenes de muchas muestras diferentes en un solo día.

Las cámaras de portaobjetos se pueden hacer y almacenar con anticipación antes de agregar Concanavalina A. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo estabilizar células de levadura en cámaras de portaobjetos simples, obtener imágenes en cuatro dimensiones y medir la dinámica de los microtúbulos en células vivas. Además de los microtúbulos, este procedimiento se puede modificar para medir la dinámica de otras proteínas marcadas con fluorescencia en células de levadura vivas en escalas de tiempo que van desde segundos hasta horas.