Imágenes de alta resolución y análisis de la dinámica de microtúbulos astrales individuales de levadura en ciernes

El objetivo general de este procedimiento es medir la dinámica de los microtúbulos en células de levadura. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los microtúbulos, como cómo las mutaciones en las tubulinas y en los reguladores de los microtúbulos afectan la dinámica de estos últimos en una célula viva. La principal ventaja de esta técnica es que las células de levadura vivas se mantienen estabilizadas en la imagen.

En cambio, alta resolución temporal durante diez minutos, o baja resolución temporal durante varias horas. Realizarán el procedimiento Colby Fees y Cassi Estrem, dos estudiantes de posgrado de mi laboratorio. Las células de levadura utilizadas en este experimento han sido diseñadas para expresar constitutivamente tubulina marcada con GFP.

Inocular aproximadamente un microlitro de las células de levadura de una colonia individual en una placa, en tres mililitros de medio sintético completo. Dejar crecer las células durante la noche a 30 grados Celsius con agitación a 250 RPM. Al día siguiente, diluir el cultivo saturado hasta un OD600 inferior a 0,1 en el medio.

Devuelva el cultivo diluido al agitador a 30 grados Celsius durante tres o cuatro horas, o hasta que la DO600 esté entre 0,4 y 0,8. Comience la preparación de las laminillas de cámara de flujo cortando una hoja de película de parafina en un trozo de cuatro pulgadas de ancho y siete pulgadas de largo. Coloque una laminilla de microscopio estándar longitudinalmente sobre el ancho de cuatro pulgadas de la película de parafina y envuelva la película alrededor de la laminilla tres o cuatro veces, de modo que la laminilla quede cubierta con una película de tres a cuatro capas de espesor.

Presione las capas juntas para asegurar un sellado adecuado, pero evite presionar demasiado o causar arrugas en la película. Utilizando una cuchilla limpia de cúter y otra portaobjetos para proporcionar un borde recto para el corte, corte la película de parafina a lo largo de los bordes externos de la portaobjetos. Retire la película sobrante de la portaobjetos de trabajo y deséchela.

Utilizando la segunda placa como borde recto, corte las capas apiladas de película a lo largo del eje largo de la placa en aproximadamente 10 tiras, cada una de dos a cuatro milímetros de ancho. A continuación, corte las capas apiladas de película de parafina perpendicularmente a los cortes anteriores a lo largo del eje corto de la placa para crear tiras de dos a cuatro milímetros de ancho, de 23 a 24 milímetros de largo y de tres a cuatro capas de espesor. Utilice una cuchilla en un ángulo de 45 grados para desprender las tiras de película cortadas.

Luego, use pinzas para distribuir uniformemente las tiras cortadas sobre un portaobjetos limpio y crear el número deseado de cámaras. En este ejemplo, se utilizarán cuatro tiras de película para crear tres cámaras. Coloque un cubreobjetos individual encima de las tiras de película y colóquelo en posición con pinzas.

Coloque el portaobjetos preparado, con el cubreobjetos hacia arriba, sobre una placa calefactora ajustada a aproximadamente 95 grados celsius, y caliente el portaobjetos durante unos tres minutos hasta que las tiras de película sean translúcidas. Selle el portaobjetos y el cubreobjetos presionando suavemente con pinzas las regiones del cubreobjetos que están directamente encima de las tiras de película de parafina. Utilice fórceps para retirar el portaobjetos de la placa calefactora y déjelo enfriar con el lado del cubreobjetos hacia arriba.

A medida que la laminilla se enfría, la película recuperará un color blanco opaco. Para comenzar este procedimiento, descongele un alícuota de 200 microlitros de concanavalina A congelada a temperatura ambiente. Añada aproximadamente 100 microlitros de concanavalina A descongelada a cada cámara de la laminilla preparada, pipeteando por uno de los extremos abiertos.

Luego, cuelgue el portaobjetos, con el cubreobjetos hacia abajo, entre dos rejillas para tubos microcentrífugos durante cinco minutos para permitir que la concanavalina A se adhiera al cubreobjetos. Devuelva el portaobjetos a una posición con el cubreobjetos hacia arriba y elimine la concanavalina A lavando la cámara con medio sintético completo. Pase a través de la cámara un volumen de medio equivalente a dos veces su capacidad, utilizando la esquina de una toalla de papel para extraer el líquido de un extremo de la cámara, mientras simultáneamente se agrega líquido fresco mediante pipeta al otro extremo de la cámara.

Cargue las células haciendo fluir dos veces el volumen de la cámara de suspensión celular utilizando el método de flujo dirigido. Suspenda la placa, con el cubreobjetos hacia abajo, durante 10 minutos para permitir que las células se adhieran al cubreobjetos. Lave las células no adheridas haciendo fluir a través de cuatro veces el volumen de la cámara de medio sintético completo.

Seque cuidadosamente cada extremo de la cámara con una esquina limpia de una toalla de papel, llevando el menisco hasta el borde del cubreobjetos. Selle cada extremo de la cámara con sellador tibio. La adquisición de imágenes se realizará con un microscopio invertido equipado con un objetivo CFI Plan Apo 100X con una apertura numérica de 1.45, una platina piezoeléctrica, una unidad de escaneo confocal de disco giratorio, un láser de iluminación y una cámara EMCCD.

Mantenga la temperatura del escenario a temperatura ambiente durante la adquisición de imágenes. Enfocar las células y buscar en la laminilla células agrupadas para asegurar que el campo de adquisición tenga al menos cinco a seis células agrupadas juntas en el mismo plano focal. Programe una adquisición multidimensional para recopilar múltiples series z a lo largo del tiempo.

Ajuste los parámetros dentro de la configuración de adquisición activa a los siguientes valores: profundidad Z total de seis micrómetros para abarcar toda la célula de levadura, tamaño de paso Z de 300 nanómetros para maximizar la recolección de luz sin sobremuestrear, duración total de 10 minutos, intervalos de tiempo de cuatro segundos entre series Z, y tiempo de exposición de 90 milisegundos para cada plano Z. Inicie la adquisición haciendo clic en Ejecutar y déjela correr durante toda la duración de 10 minutos. Los datos se guardan como una serie de imágenes, y aquí se muestra un ejemplo de resultado de imágenes con lapso de tiempo.

Inicie el análisis de imágenes abriendo ImageJ y arrastre directamente la pila de imágenes adquirida al panel de control. Los formatos bio se importarán automáticamente. Seleccione "Aceptar" para cargar la pila de imágenes como una hiperpila.

Utilizando la función ZProject, colapse cada serie z en una proyección bidimensional de intensidad máxima. Aplique un filtro mediano al conjunto de imágenes para reducir el ruido granular seleccionando el menú Proceso, el submenú Filtro y la función Mediana. Ingrese 2,0 píxeles en el cuadro de radio y haga clic en Aceptar. Identifique las células pre-NFA en el campo.

Estos se caracterizan por brotes de tamaño medio y un huso mitótico corto de aproximadamente uno a uno punto cinco micrómetros de longitud. A partir del primer punto de tiempo de la serie de imágenes, utilice la herramienta de línea segmentada para trazar una línea a lo largo de un microtúbulo astral individual, desde la ubicación en la unión entre el microtúbulo astral y los microtúbulos del huso más intensamente marcados, hasta el extremo positivo, que se encuentra en el citoplasma. Haga doble clic en el extremo del microtúbulo para completar la línea segmentada.

Registre la medición en la tabla de resultados utilizando la función de medición presionando el botón M en el teclado. Después de realizar las mediciones para todos los puntos temporales, copie los datos de la tabla de resultados, péguelos en una hoja de cálculo y seleccione Guardar como para seleccionar los datos. Este gráfico muestra una serie temporal de la dinámica de los microtúbulos astrales en una célula de tipo salvaje y una cepa mutante que previamente se ha demostrado que posee microtúbulos más estables.

Los microtúbulos están marcados con alfa tubulina etiquetada con GFP para visualizar la longitud de los microtúbulos. Las flechas rojas trazan la longitud total de un microtúbulo astral, con las puntas de flecha indicando los extremos positivos. Se midió la longitud de los microtúbulos en cada punto de tiempo durante ocho minutos, y estas longitudes compiladas se representan en gráficos de vida.

Los puntos verdes indican polimerización, y los puntos rosados indican despolimerización. Los eventos de catástrofe se indican mediante puntas de flecha. Estos gráficos muestran que el microtúbulo en el mutante es más largo y presenta menos catástrofes que el microtúbulo de tipo salvaje.

Además, las tasas de polimerización y despolimerización determinadas a partir de las pendientes de las longitudes de microtúbulos ascendentes y descendentes se reducen en el mutante en comparación con el tipo salvaje. Las mediciones de la dinámica de microtúbulos también revelan que el microtúbulo en la célula mutante presenta una dinamicidad disminuida en comparación con el tipo salvaje. Una vez dominadas, la preparación del portaobjetos, la carga celular y la adquisición de imágenes pueden realizarse en 30 minutos, lo que significa que se pueden obtener imágenes de muchas muestras diferentes en un solo día.

Las cámaras de microscopía se pueden preparar y almacenar de antemano antes de añadir la concanavalina A. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo estabilizar células de levadura en cámaras de microscopía sencillas, realizar imágenes en cuatro dimensiones y medir la dinámica de los microtúbulos en células vivas. Además de los microtúbulos, este procedimiento puede modificarse para medir la dinámica de otras proteínas marcadas con fluorescencia en células vivas de levadura a escalas de tiempo que van desde segundos hasta horas.