Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método para separar los neutrófilos de una gota de sangre entera y luego realizar un ensayo de quimiotaxis posterior utilizando un solo dispositivo microfluídico. Este método proporciona nuestro código para realizar un ensayo de quimiotaxis de neutrófilos utilizando un pequeño volumen de sangre completa. Y puede ser fácilmente aplicado por los investigadores para responder preguntas biológicas relacionadas con la migración de células inmunitarias.

La principal ventaja de esta técnica es la integración y nuestro ensayo de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico. Esto permite el montaje y análisis en 25 minutos. Para comenzar, prepare el maestro maldus descrito en el protocolo de texto adjunto.

A continuación, silanice la superficie del molde SU8 para facilitar la liberación de PDMS del molde. A continuación, mezcle 40 gramos de base PDMS y cuatro gramos del agente portador en un vaso de precipitados de plástico. Coloque el molde maestro SU8 preparado en una placa de Petri y vierta con cuidado la solución mezclada de PDMS en el molde.

Coloque la placa de Petri en un desecador y aplique un vacío para desgasificar la solución de PDMS durante 20 minutos. Luego, coloque la placa de Petri en un horno y cure el PDMS a 80 grados centígrados durante dos horas. Después de hornear, corte y despegue con cuidado la losa de PDMS del molde SU8.

Corte la losa de PDMS para separarla en dispositivos individuales. Ajuste el dispositivo PDMS para hacer dos paredes alrededor del puerto de carga de la celda para sujetar los imanes. A continuación, perfore el puerto de carga de la celda con un perforador de tres milímetros de diámetro.

Luego, cambie a un punzón de seis milímetros y retire los depósitos de entrada de productos químicos en la salida de desechos. Con un trozo de cinta adhesiva, elimine el polvo de la superficie de la losa de PDMS. Coloque la losa limpia en un portaobjetos de vidrio limpio en la máquina de plasma.

Aplica la aspiradora durante tres minutos. Y luego encienda la energía de plasma y ajuste el nivel a alto. Ajuste suavemente la válvula de aire y el tratamiento con plasma del PDMS y el portaobjetos de vidrio durante tres minutos.

Cuando termine, apague la energía del plasma y suelte la aspiradora. Saque con cuidado la losa de PDMS en el portaobjetos de vidrio con pinzas, coloque inmediatamente la losa de PDMS encima del portaobjetos de vidrio, con las estructuras de canales boca abajo, presione suavemente la losa de PDMS para unirla al vidrio y luego llene inmediatamente el canal microfluídico con agua desionizada. Los PDMS generalmente se presionaron sobre el sustrato de vidrio para evitar en el pozo en el canal de barrera.

Retire el agua desionizada del dispositivo y agregue 100 microlitros de solución de fribronectina desde la salida. Espere tres minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos de solución de fibronectina. Luego, incube el dispositivo en una placa de Petri cubierta durante una hora a temperatura ambiente.

A continuación, retire la solución de fibronectina del dispositivo y agregue 100 microlitros de medio de migración desde la salida. Nuevamente, espere tres minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos con el medio de migración. Incube el dispositivo durante otra hora a temperatura ambiente antes de usar el dispositivo en el experimento de quimiotaxis.

Coloque diez microlitros de sangre entera en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, añade dos microlitros del cóctel de anticuerpos. Y dos microlitros de partículas magnéticas de un kit de aislamiento de neutrófilos y mezclar suavemente el tubo para marcar magnéticamente las células marcadas con anticuerpos.

Incube la mezcla de la etiqueta durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, conecte dos pequeños discos magnéticos a los dos lados del puerto de carga de la celda del dispositivo. Aspire el medio desde todos los puertos del dispositivo.

Luego, pipetee lentamente dos microlitros de la mezcla de sangre marcada en el dispositivo microfluídico desde el puerto de carga de celdas. Coloque el dispositivo microfluídico en la platina del microscopio con control de temperatura a 37 grados centígrados. Espere unos minutos hasta que haya suficientes neutrófilos atrapados en el área de acoplamiento de la célula.

A continuación, agregue 100 microlitros de la solución quimioatrayente y 100 microlitros de medio de migración a sus depósitos de entrada designados usando dos pipetas. Esto generará un gradiente de quimioatracción mediante una mezcla química basada en flujo laminar continuo. El quimioatrayente puede ser proteínas recombinantes como FMLP o una muestra clínica como el sobrenadante de esputo de pacientes con EPOC.

Una vez que el flujo se haya estabilizado, adquiera imágenes de fluorescencia del gradiente de FitZ dextron en el canal. A continuación, incube el dispositivo en la platina del microscopio con control de temperatura o en una incubadora de cultivo celular convencional durante 15 minutos. Después de la incubación, obtenga imágenes del canal de gradiente utilizando un objetivo diez veces para registrar las posiciones finales de la célula para el análisis de datos.

Los neutrófilos se seleccionan negativamente a partir de una gota de sangre entera directamente en el dispositivo microfluídico utilizando un marcador de anticuerpos de partículas magnéticas y un par de imanes. Con el fin de confirmar la pureza de los neutrófilos aislados en chip, se realizó la tinción de Giemsa. Los resultados muestran los núcleos típicos en forma de anillo y lóbulo de los neutrófilos.

Después de la carga de celdas, la estructura de acoplamiento alinea efectivamente las celdas junto al canal de gradiente antes de aplicar un gradiente químico. Cuando se expone a un gradiente químico durante 15 minutos, se produce la quimiotaxis. Y se puede medir mediante imágenes.

Estos resultados muestran que después de 15 minutos, pocas células se arrastraron a través del canal de barrera en la muestra controlada con medio. Por el contrario, muchos neutrófilos se movieron rápidamente a través del canal de barrera y migraron hacia un gradiente FMLP de 100 nanomolares. Una vez que esto puede enviar la quimiotaxis directamente desde nuestro en 25 minutos.

Esto ofrece una herramienta útil para que los investigadores estudien la mecánica de la migración de células completas. Y una herramienta para aplicaciones clínicas.