Name: Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprende a aislar neutrófilos de sangre completa y realizar ensayos de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico en solo 25 minutos. Este método integrado facilita el estudio de la migración de células inmunes.

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Este trabajo es en parte apoyado por subvenciones del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (CRSNG) y los Institutos Canadienses de Investigación de Salud (CIHR). Damos las gracias al Instituto Clínico de Investigación Aplicada y Educación en el Hospital General Victoria en Winnipeg y Seven Oaks General Hospital en Winnipeg para la gestión de muestras clínicas de seres humanos. Damos las gracias al Dr. Hagit Peretz-Soroka para la discusión útil sobre las estrategias de la operación de ensayo. <style type="text/css">
</style> Agradecemos a la profesora Carolyn Ren y al doctor Xiaoming (Cody) Chen de la Universidad de Waterloo por su generoso apoyo en el proceso de filmación.

Todos los protocolos de recolección de muestras humanas fueron aprobados por la Junta de Ética en Investigación de la Universidad de Manitoba, Winnipeg. 1. Fabricación de dispositivos microfluídicos ( Figura 1A ) <ol><li> Diseñe e imprima la máscara de la transparencia. <ol><li> Diseñar el dispositivo según lo detallado previamente 25 . Véase la figura 1A . NOTA: El dispositivo incluye dos capas. La primera capa (4 μm de altura) define el canal de barrera de acoplamiento de células para atrapar las células junto al canal de gradiente. La segunda capa (60 μm de altura) define el canal de generación de gradiente, el puerto y el canal para la carga de células, los depósitos de entrada de productos químicos y la salida de desechos. Las marcas de alineación están diseñadas para las dos capas. Para la segunda capa, la longitud y anchura del canal de entrada de serpentina aguas arriba es de 60 mm y 200 μm, respectivamente; La longitud y el ancho de la corriente descendenteSerpentina es de 6 mm y 280 μm, respectivamente. </li><li> Imprima las características de primera y segunda capa a una máscara de transparencia utilizando una impresora de alta resolución. NOTA: La resolución de impresión depende de las características mínimas del diseño. En el diseño actual, se eligió 32.000 dpi para una característica mínima de 10 μm. </li></ol></li><li> Limpie la oblea de silicio. <ol><li> Coloque una oblea de silicona de 3 en el limpiador de plasma. Aplicar el vacío durante 3 min. </li><li> Encienda la alimentación de plasma y ajuste el nivel a HIGH. Utilice el plasma de oxígeno para tratar la oblea de silicio durante 30 min. </li><li> Apague el limpiador de plasma y saque la oblea de silicio; La oblea de silicio está lista para fabricar el molde de dispositivo. </li></ol></li><li> Fabricar la primera capa por fotolitografía en una sala limpia. NOTA: Los parámetros de fabricación exactos pueden variar dependiendo de la instalación de fabricación. <ol><li> Diluir 10 ml de SU-8 2025 con 10 ml de SU-8 2000 en un disyuntor de vidrio para preparar el fotorresistor diseñado. Dejar la mezcla en la campana extractora durante 10 minutos hasta que desaparezcan las burbujas. </li><li> Coloque cuidadosamente la oblea de silicio limpiada en la hiladora con el portabrocas adecuado y aplique el vacío para inmovilizar la oblea de silicio. </li><li> Con cuidado, verter 3 ml de la mezcla de fotorresistencia sobre el centro de la oblea de silicio. Girar a 500 rpm durante 5 s. A continuación, centrifugación a 3.000 rpm durante 30 s para obtener un revestimiento de fotorresistencia final de 4 μm de grosor sobre la oblea de silicio. </li><li> Retire cuidadosamente la oblea de silicio de la hiladora y hornear la oblea de silicio en una placa caliente durante 4 minutos a 95 ° C. </li><li> Coloque cuidadosamente la oblea de silicio en un alineador de máscara y ajuste el tiempo de exposición UV a 6 s. Con cuidado, coloque la máscara transparente de la primera capa sobre una placa de vidrio transparente usando cinta adhesiva. </li><li> Coloque suavemente la placa de vidrio transparente con la máscara adjunta en el alineador y alinee la máscara con la oblea de silicio. Exponer el siLicon a la UV para modelar la estructura de acoplamiento de la célula. </li><li> Retire cuidadosamente la placa de vidrio y saque la oblea de silicio expuesta. Hornear la oblea de silicio en una placa caliente durante 4 minutos a 95 ° C. </li><li> Transferir la oblea de silicio a una campana extractora y colocarla en una cacerola de vidrio que contenga el revelador SU-8. Agite suavemente durante 30 s. </li><li> Limpie la oblea de silicio usando desarrollador SU-8 fresco seguido de alcohol isopropílico (IPA) dentro de la campana extractora. Seque la oblea de silicio con gas nitrógeno dentro de la campana extractora; La primera capa está lista. </li></ol></li><li> Fabricar la segunda capa en la primera capa. <ol><li> Utilice cinta adhesiva para cubrir las marcas de alineación en la primera capa. Coloque cuidadosamente la oblea de silicio con la primera capa en el mandril de vacío de la hiladora y aplique vacío para inmovilizar la oblea de silicio. </li><li> Vierta 3 mL de fotorresistor SU-8 2025 en la oblea de silicio. Hacer girar la oblea de silicio a 500 rpm durante 5 s. A continuación, girar a 2000 rpm durante 30S para obtener un recubrimiento final de fotorresistencia de 60 μm de espesor sobre la oblea de silicio. </li><li> Retire cuidadosamente la oblea de silicio de la hiladora y transfiérala a una placa caliente; Hornear a 65 ° C durante 2 min. </li><li> Retire suavemente la cinta adhesiva para exponer las marcas de alineación en la primera capa. Coloque la oblea de silicio en una placa de cocción y hornee a 95 ° C durante 6 min. </li><li> Coloque cuidadosamente la oblea de silicio en un alineador de máscara y ajuste el tiempo de exposición UV a 18 s. </li><li> Con cuidado, coloque la máscara transparente de la segunda capa sobre una placa de vidrio transparente usando cinta adhesiva. </li><li> Coloque cuidadosamente la placa de vidrio con la máscara adjunta en el alineador y alinee la máscara y la primera capa en la oblea de silicio mediante las marcas de alineación cruzadas usando el microscopio de inspección del alineador. </li><li> Exponer la oblea de silicio recubierta con fotorresistencia a UV para modelar los canales de carga celular y gradiente. </li><li> Retire cuidadosamente la placa de vidrio y saque el silicio wAfer Hornear la oblea de silicio en una placa caliente a 65 ° C durante 2 min y luego transferir la oblea de silicio a otra placa caliente 95 ° C y hornear durante 6 min. </li><li> Transferir la oblea de silicio a la campana extractora y colocarla en un recipiente de vidrio que contenga el revelador SU-8. Agite suavemente durante 6 min. </li><li> Limpie la oblea de silicio utilizando desarrollador SU-8 fresco seguido de IPA dentro de la campana extractora. </li><li> Seque la oblea de silicio usando gas nitrógeno dentro de la campana extractora. Coloque la oblea de silicio en una placa de cocción y hornee duro el molde a 150 ° C durante 30 minutos; La segunda capa está lista. </li></ol></li><li> Modificación de la superficie del molde principal. NOTA: Se aplica una etapa de modificación de superficie de silanización al molde SU-8 para facilitar la liberación de polidimetilsiloxano (PDMS) del molde en litografía blanda. <ol><li> Tomar 10 μl de solución de tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctil (triclorosilano) en una punta de micropipeta. Coloque la punta de la micropipeta en un tubo de plástico de 15 ml aNd aflojar la tapa del tubo. </li><li> Coloque el tubo y la pastilla de silicio con patrón SU-8 dentro de un desecador y aplique el vacío durante 1 h; El molde de máscara está listo para fabricar el dispositivo PDMS. </li></ol></li><li> Fabricar el dispositivo PDMS. <ol><li> Preparar la solución de PDMS mezclando 40 g de base de PDMS y 4 g de agente de curado en un vaso de precipitados de plástico. Coloque el molde maestro SU-8 preparado en una placa de Petri y coloque cuidadosamente 44 g de solución PDMS sobre el molde. </li><li> Coloque la placa de Petri en un desecador y aplique vacío para desgasear la solución de PDMS durante 20 min. A continuación, colocar la placa de Petri en un horno y curar el PDMS a 80 ° C durante 2 h. </li><li> Después de hornear, saque el plato de Petri y colóquelo en un banco limpio. Cuidadosamente cortar y pelar la losa PDMS del molde SU-8. </li><li> Sacar el orificio de carga de la celda con un punzón de 3 mm de diámetro. Perforar los depósitos de entrada de productos químicos y la salida de desechos usando un punzón de 6 mm de diámetro. </li><li> Retire el polvo de laSuperficie de la losa PDMS utilizando cinta adhesiva. Coloque la losa PDMS y una diapositiva de vidrio limpia en la máquina de plasma. Aplicar el vacío durante 3 min. </li><li> Encienda la alimentación de plasma y ajuste el nivel a HIGH. Ajustar suavemente la válvula de aire y plasmatreat la plancha PDMS y el portaobjetos de vidrio durante 3 min. </li><li> Apague la energía del plasma y libere el vacío. Saque con cuidado la losa PDMS y la diapositiva de cristal con pinzas. </li><li> Coloque inmediatamente la plancha PDMS (con las estructuras del canal boca abajo) en la parte superior del portaobjetos de vidrio; Presione suavemente la plancha PDMS para adherirla al cristal. Llenar el canal microfluídico con agua desionizada inmediatamente; Se completan la fabricación y el montaje del dispositivo microfluídico. </li></ol></li></ol> 2. Preparación del ensayo de migración de células microfluídicas <ol><li> Preparación del dispositivo microfluídico. <ol><li> Preparar 50 μg / mL de solución de fibronectina mediante la dilución de 50 μl de solución madre de fibronectina (1 mg / mL) a 95081; L solución salina tamponada con fosfato Dulbecco (DPBS) dentro de un gabinete de bioseguridad. </li><li> Preparar el medio de migración mezclando 9 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) y 1 ml de RPMI-1640 con albúmina de suero bovino al 4% (BSA). </li><li> Retire el agua desionizada del dispositivo. </li><li> Agregue 100 μl de solución de fibronectina al dispositivo desde la salida. Espere 3 min para asegurarse de que todos los canales estén llenos de solución de fibronectina. Colocar el dispositivo microfluídico en una placa de Petri cubierta durante 1 h a temperatura ambiente. </li><li> Retire la solución de fibronectina del dispositivo. Añadir 100 μL de medio de migración desde la salida. Espere 3 minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos de medio de migración. </li><li> Incubar el dispositivo durante 1 h más a temperatura ambiente; El dispositivo está entonces listo para el experimento de quimiotaxis. </li></ol></li><li> Preparación de la solución quimioatractante para el experimento de quimiotaxis. <ol><li> Preparar solución de fMLP 100 nM en tOtal 1 ml de medio de migración. Mezclar 5 μL de FITC-Dextrano (10 kDa, 1 mM) con la solución de fMLP en un tubo de 1,5 ml. NOTA: FITC-Dextran se utiliza para la medición del gradiente. Alternativamente, use Rhodamine como indicador de gradiente. La solución quimioatrayente de fMLP está entonces lista para el experimento de quimiotaxis. </li></ol></li><li> Preparación de la muestra de esputo. NOTA: La quimiotaxis de neutrófilos inducida por un gradiente de muestra de esputo de pacientes con EPOC se probó como una aplicación de diagnóstico clínico de este método todo en chip. <ol><li> Obtener un protocolo de ética humana para recolectar muestras de esputo de pacientes con EPOC. NOTA: Obtuvimos aprobaciones para recolectar muestras en el Seven Oaks General Hospital de Winnipeg (aprobado por la Universidad de Manitoba). </li><li> Obtenga los formularios de consentimiento por escrito de todas las personas. </li><li> Recoger las muestras espontáneas de esputo de los pacientes con EPOC. Coloque 500 μl de muestra de esputo en un tubo de 1,5 ml. </li><li> Añadir 500 μl de diTiotreitol en el tubo de 1,5 ml y mezclar suavemente. Colocar el tubo en un baño de agua a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Centrifugar la muestra a 753 xg durante 10 min y luego recoger el sobrenadante. Centrifugar el sobrenadante a 865 xg durante 5 min y luego recoger el sobrenadante final. Guarde el sobrenadante recogido dentro de un congelador de -80 ° C antes de su uso. </li><li> Cuando esté listo para el experimento de quimiotaxis, descongelar la solución de esputo; Transferir 900 μL de medio de migración a un tubo de 1,5 ml y mezclar con 100 μl de solución de esputo dentro de un gabinete de bioseguridad; La solución de esputo está entonces lista para el experimento de quimiotaxis. </li></ol></li><li> Recolección de muestras de sangre. <ol><li> Obtener un protocolo de ética humana para recolectar muestras de sangre de donantes sanos. Obtenga los formularios de consentimiento por escrito de todos los donantes de sangre. NOTA: Aquí se obtuvieron muestras en el Victoria General Hospital de Winnipeg (aprobado por la Junta de Ética en Investigación de la Universidad de ManitOba). </li><li> Recoger la muestra de sangre por punción venosa y colocar la muestra en un tubo recubierto de EDTA. Mantenga el tubo en un gabinete de bioseguridad antes del experimento. </li></ol></li></ol> 3. Operación de Ensayo de Quimiotaxis All-on-chip <ol><li> Aislamiento de células en chip ( Figura 1B ). <ol><li> Coloque 10 μL de sangre entera en un tubo de 1,5 ml dentro de un gabinete de bioseguridad. NOTA: Los detalles de la recolección de muestras de sangre se encuentran en la sección 2.4. </li><li> Añadir 2 μl de anticuerpo de anticuerpos (Ab) y 2 μL de partículas magnéticas (MP) del kit de aislamiento de neutrófilos (ver tabla de materiales) en el tubo de 1,5 ml y mezclar suavemente; Esto etiquetará las células en la sangre excepto los neutrófilos. </li><li> Incubar la mezcla de sangre-Ab-MP durante 5 min a temperatura ambiente. NOTA: Esto marcará magnéticamente las células marcadas con anticuerpos en sangre. </li><li> Conecte dos pequeños discos magnéticos a los dos lados de la célula de carga pOrt del dispositivo. Aspire el medio de todos los puertos del dispositivo. </li><li> Pipetar lentamente 2 μl de mezcla de sangre-Ab-MP en el dispositivo microfluídico desde el orificio de carga celular. NOTA: Las células marcadas magnéticamente quedan atrapadas en las paredes laterales del puerto de carga celular mientras que los neutrófilos fluirán hacia el dispositivo y quedarán atrapados en la estructura de acoplamiento de células. </li><li> Espere unos minutos hasta que haya suficientes neutrófilos atrapados en el área de acoplamiento de la célula. </li></ol></li><li> Ensayo de quimiotaxis ( Figura 1C ). <ol><li> Coloque el dispositivo microfluídico en la etapa de microscopio con temperatura controlada a 37 ° C. </li><li> Añadir 100 μl de solución quimioatrayente (fMLP o solución de esputo) y 100 μL de medio de migración a sus reservorios de entrada designados usando dos pipetas; Esto generará un gradiente quimioatrayente en el canal de gradiente por mezcla química continua basada en el flujo laminar asistida por una presiónE estructura de equilibrio. NOTA: Los detalles de la colección de esputo de pacientes con EPOC se encuentran en la sección 2.3. <ol><li> Para el experimento de control medio, sólo añada medio de migración a ambos reservorios de entrada. </li></ol></li><li> Adquirir la imagen de fluorescencia de FITC-Dextrano en el canal de gradiente. </li><li> Importe la imagen al software ImageJ usando el comando &quot;Archivo | Abrir&quot;. </li><li> Mida el perfil de intensidad de fluorescencia a través del canal de gradiente usando el comando &quot;Analizar | Perfil de trazado&quot;. </li><li> Exporte los datos de medición a una hoja de cálculo para realizar un trazado adicional. </li><li> Incubar el dispositivo en la etapa de microscopio con temperatura controlada o en una incubadora de cultivo celular convencional durante 15 min. </li><li> Imagen del canal de degradado utilizando un objetivo de 10X para registrar las posiciones finales de las células para el análisis de datos. </li><li> Si es necesario, registre la migración celular en el dispositivo por microscopía de lapso de tiempo. </li></ol></li></ol> 4. Migración de celdas DAta Análisis ( Figura 1C ) <ol><li> Analizar el ensayo de quimiotaxis calculando la distancia de migración celular de la estructura de acoplamiento como se describe a continuación. Véase la figura 1C . </li><li> Importe la imagen en el software NIH ImageJ (ver 1.45). </li><li> Seleccione el centro de cada celda que se movió en el canal de degradado. </li><li> Mida las coordenadas de las celdas seleccionadas para sus posiciones finales. Mida la coordenada de un punto en el borde de la estructura de acoplamiento como la posición de referencia inicial. </li><li> Exporte los datos de coordenadas medidos a un programa de hoja de cálculo ( por ejemplo, Excel). Calcular la distancia de migración de las células como la diferencia entre la posición final de una célula y la posición de referencia inicial a lo largo de la dirección del gradiente. </li><li> Calibre la distancia a un micrómetro. Calcular el promedio y la desviación de la distancia de migración de todas las células como una medida de la quimiotaxis. </li><li> Comparar el migRación en presencia de un gradiente quimioatrayente al experimento de control de medio utilizando el test t de Student. </li><li> Si se registran las imágenes de lapso de tiempo de la migración celular, la migración celular y la quimiotaxis pueden analizarse adicionalmente mediante el análisis de seguimiento celular 15 . NOTA: Los materiales necesarios para construir y realizar el ensayo de quimiotaxis todo en chip se detallan en la tabla de materiales. </li></ol>

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En este artículo, se describió un protocolo detallado para aislar directamente los neutrófilos de la sangre entera seguido de la prueba de quimiotaxis, todos en un único chip microfluídico. Este método ofrece características útiles en su fácil operación, selección negativa de neutrófilos de alta pureza, prueba rápida de quimiotaxis de muestra a resultado, reducción de reactivos y consumo de muestras y análisis preciso de datos de migración celular. Como una estimación aproximada, al menos el 25% de los neutrófilos de la...

La quimiotaxis, un proceso de migración celular dirigida a un gradiente de concentración química soluble, está implicada de manera crítica en muchos procesos biológicos incluyendo la respuesta inmune 1 , 2 , 3 , el desarrollo de tejido 4 y la metástasis de cáncer 5 . Los neutrófilos son el subconjunto de glóbulos blancos más abundantes y desempeñan un papel crucial en la habilitación de las funciones innatas de defensa del huésped del cuerpo, así como en la mediación de las respuestas inmunes adaptativas 6 , 7 . Los neutrófilos están equipados con maquinaria quimiotáctica altamente regulada que permite a estas células inmunitarias móviles responder tanto a los quimioatrayentes derivados de patógenos ( por ejemplo, fMLP) como a los quimioatractores derivados del huésped ( por ejemplo, interleucina-8) a través de la quimiotaxis 8 . La migración de neutrófilos y la quimiotaxis median diversos problemas fisiológicosY enfermedades tales como inflamación y cánceres 1 , 9 . Por lo tanto, la evaluación precisa de la quimiotaxis de neutrófilos proporciona una lectura funcional importante para el estudio de la biología de neutrófilos y las enfermedades asociadas. En comparación con los ensayos de quimiotaxis convencional ampliamente utilizados ( por ejemplo, el ensayo de transwell 10 ), los dispositivos microfluídicos son muy prometedores para la evaluación cuantitativa de la migración celular y la quimiotaxis debido a la generación de gradiente químico controlado con precisión y la miniaturización 11 , 12 , 13 . Durante las dos últimas décadas aproximadamente, se han desarrollado varios dispositivos microfluídicos para estudiar la quimiotaxis de diferentes tipos de células biológicas, especialmente los neutrófilos 11 . Se realizó un esfuerzo significativo para caracterizar la migración de neutrófilos<html> Micos que se configuraron en los dispositivos microfluídicos 14 , 15 . También se desarrollaron estrategias interesantes para estudiar la toma direccional de decisiones por parte de los neutrófilos utilizando los dispositivos microfluídicos. 16 Al margen de la investigación biológicamente orientada, las aplicaciones de los dispositivos microfluídicos se han ampliado para probar las muestras clínicas para la evaluación de la enfermedad 17,18,19. Sin embargo, el uso de muchos dispositivos microfluídicos se limita a laboratorios de investigación especializados y requiere un largo aislamiento de neutrófilos de un gran volumen de muestras de sangre. Por lo tanto, ha habido una tendencia creciente del desarrollo de dispositivos microfluídicos integrados para el análisis rápido de quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre entera 20 , 21 , 22 ,Ef &quot;&gt; 23 , 24 . Hacia esta dirección, se desarrolló un método de todo en chip que integra la purificación de neutrófilos negativos magnéticos y el subsiguiente ensayo de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico 25 . Este método todo-en-chip tiene las siguientes características novedosas: 1) en contraste con las estrategias de chip anteriores que aíslan neutrófilos de la sangre mediante la captura de células basadas en adhesión o el filtrado basado en tamaño de celda 20 , 22 , Pureza, separación magnética sobre chip de los neutrófilos de pequeños volúmenes de sangre completa, así como medición de quimiotaxis mediante estimulación quimioatrayente; 2) la estructura de acoplamiento de células ayuda a alinear las posiciones iniciales de los neutrófilos cerca del canal de gradiente químico y permite un análisis de quimiotaxis simple sin rastreo de células individuales; 3) la integración del aislamiento de neutrófilos y chemotEje en un único dispositivo microfluídico permite un análisis rápido de la quimiotaxis de muestra a resultado en 25 minutos cuando no hay interrupción entre los pasos experimentales. Este documento proporciona un protocolo detallado para la construcción, operación y análisis de datos método de este todo-en-chip quimiotaxis ensayo. El artículo demuestra el uso efectivo del método desarrollado para realizar la quimiotaxis de neutrófilos mediante la prueba de un quimioatrayente recombinante conocido y muestras quimiotácticas complejas de pacientes, seguido por una discusión sobre estrategias de resolución de problemas, limitaciones y direcciones futuras.

<table><tbody><tr><td>Fabricación de dispositivos</td>Alineador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mascarillas</td><td>ABM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spinner</td><td>Solitec</td><td>5000</td><td></td></tr><tr><td>Placa calefactora</td><td>VWR</td><td>11301-022</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Desecador al vacío</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Báscula digital</td><td>Ohaus</td><td>CS200</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2000 diluyente</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2000</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025 fotorresistente</td><td>Microchem</td><td>SU-8 2025</td><td></td></tr><tr><td>Revelador SU-8</td><td>Microchem</td><td>SU-8 revelador</td><td></td></tr><tr><td>Oblea Si Silicon</td><td>, Inc</td><td>LG2065</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416-4</td><td></td></tr><tr><td>(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo) triclorosilano</td><td>Gelest</td><td>78560-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Adhesivos Ellsworth</td><td>2065622</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-4</td><td></td></tr><tr><td>Almohadilla de corte</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida</td></tr><tr><td>Punzonadores</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Hecho a medida</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Fuente</fuerte</td><td>><fuerte>Número de catálogo</fuerte</td><td>><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Ensayo de aislamiento celular y quimiotaxis en chip</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025502</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002802</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>VWR CACB356008</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Discos magnéticos</td><td>Indigo Instruments</td><td>44202-1</td><td>5 mm de diámetro, 1 mm de espesor</td></tr><tr><td>FITC-Dextran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FD10S</td><td></td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td> Sigma-Aldrich</td><td>R4127-5G</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tinción de Giemsa</td><td>Rowley Biochemical Inc.</td><td>G-472-1-8OZ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Aislamiento directo de neutrófilos humanos Kit </td><td>STEMCELL Technologies Inc</td><td>19666</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente invertido Nikon Ti-U</td><td></td> Cámara ambiental del microscopio Nikon <td>Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>.</td>Cámara CCD <td>InVivo Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>DS-Fi1</td><td></td></tr></tbody></table>

un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

An All-on-chip Method for Rapid Neutrophil Chemotaxis Analysis Directly from a Drop of Blood

La migración de neutrófilos y la quimiotaxis son fundamentales para el sistema inmunológico de nuestro cuerpo. Los dispositivos microfluídicos se utilizan cada vez más para investigar la migración de neutrófilos y la quimiotaxis debido a sus ventajas en visualización en tiempo real, control preciso de la generación de gradiente de concentración química y consumo reducido de reactivos y muestras. Recientemente, los investigadores microfluídicos han hecho un esfuerzo creciente para desarrollar sistemas de análisis de quimiotaxis microfluídicos integrados y fáciles de operar, directamente de sangre entera. En esta dirección, se desarrolló el primer método todo en chip para integrar la purificación negativa magnética de los neutrófilos y el ensayo de quimiotaxis a partir de muestras de pequeño volumen sanguíneo. Este nuevo método permite una rápida prueba de quimiotaxis de neutrófilos de muestra a resultado en 25 min. En este artículo, proporcionamos la construcción detallada, operación y método de análisis de datos para este ensayo de quimiotaxis todo en chip con una discusión sobre estrategias de solución de problemas, limiTaciones y direcciones futuras. Se muestran resultados representativos del ensayo de quimiotaxis de neutrófilos que prueban un quimioatrayente definido, N -formil-Met-Leu-Phe (fMLP) y esputo de un paciente con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), utilizando este método todo en chip. Este método es aplicable a muchas investigaciones relacionadas con la migración celular y aplicaciones clínicas.

Los neutrófilos se seleccionan negativamente de una gota de sangre completa directamente en el dispositivo microfluídico. La pureza de los neutrófilos aislados se verificó por medio de chip Giemsa tinción y los resultados mostraron la forma de anillo en forma de anillo y lóbulo en forma de núcleos de neutrófilos ( Figura 2A ] [ 25] . Esto indica un aislamiento eficaz de neutrófilos en chip con alta pureza a partir de un pequeño volume...

Este artículo proporciona el método detallado de realizar un ensayo rápido de quimiotaxis de neutrófilos integrando el aislamiento de neutrófilos a bordo de la sangre entera y la prueba de quimiotaxis en un único chip microfluídico.

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

Neutrophil migration and chemotaxis are critical for our body's immune system. Microfluidic devices are increasingly used for investigating neutrophil ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar un método para separar los neutrófilos de una gota de sangre entera y luego realizar un ensayo de quimiotaxis posterior utilizando un solo dispositivo microfluídico. Este método proporciona nuestro código para realizar un ensayo de quimiotaxis de neutrófilos utilizando un pequeño volumen de sangre completa. Y puede ser fácilmente aplicado por los investigadores para responder preguntas biológicas relacionadas con la migración de células inmunitarias.La principal ventaja de esta técnica es la integración y nuestro ensayo de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico. Esto permite el montaje y análisis en 25 minutos. Para comenzar, prepare el maestro maldus descrito en el protocolo de texto adjunto.A continuación, silanice la superficie del molde SU8 para facilitar la liberación de PDMS del molde. A continuación, mezcle 40 gramos de base PDMS y cuatro gramos del agente portador en un vaso de precipitados de plástico. Coloque el molde maestro SU8 preparado en una placa de Petri y vierta con cuidado la solución mezclada de PDMS en el molde.Coloque la placa de Petri en un desecador y aplique un vacío para desgasificar la solución de PDMS durante 20 minutos. Luego, coloque la placa de Petri en un horno y cure el PDMS a 80 grados centígrados durante dos horas. Después de hornear, corte y despegue con cuidado la losa de PDMS del molde SU8.Corte la losa de PDMS para separarla en dispositivos individuales. Ajuste el dispositivo PDMS para hacer dos paredes alrededor del puerto de carga de la celda para sujetar los imanes. A continuación, perfore el puerto de carga de la celda con un perforador de tres milímetros de diámetro.Luego, cambie a un punzón de seis milímetros y retire los depósitos de entrada de productos químicos en la salida de desechos. Con un trozo de cinta adhesiva, elimine el polvo de la superficie de la losa de PDMS. Coloque la losa limpia en un portaobjetos de vidrio limpio en la máquina de plasma.Aplica la aspiradora durante tres minutos. Y luego encienda la energía de plasma y ajuste el nivel a alto. Ajuste suavemente la válvula de aire y el tratamiento con plasma del PDMS y el portaobjetos de vidrio durante tres minutos.Cuando termine, apague la energía del plasma y suelte la aspiradora. Saque con cuidado la losa de PDMS en el portaobjetos de vidrio con pinzas, coloque inmediatamente la losa de PDMS encima del portaobjetos de vidrio, con las estructuras de canales boca abajo, presione suavemente la losa de PDMS para unirla al vidrio y luego llene inmediatamente el canal microfluídico con agua desionizada. Los PDMS generalmente se presionaron sobre el sustrato de vidrio para evitar en el pozo en el canal de barrera.Retire el agua desionizada del dispositivo y agregue 100 microlitros de solución de fribronectina desde la salida. Espere tres minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos de solución de fibronectina. Luego, incube el dispositivo en una placa de Petri cubierta durante una hora a temperatura ambiente.A continuación, retire la solución de fibronectina del dispositivo y agregue 100 microlitros de medio de migración desde la salida. Nuevamente, espere tres minutos para asegurarse de que todos los canales estén llenos con el medio de migración. Incube el dispositivo durante otra hora a temperatura ambiente antes de usar el dispositivo en el experimento de quimiotaxis.Coloque diez microlitros de sangre entera en un tubo de 1,5 mililitros. A continuación, añade dos microlitros del cóctel de anticuerpos. Y dos microlitros de partículas magnéticas de un kit de aislamiento de neutrófilos y mezclar suavemente el tubo para marcar magnéticamente las células marcadas con anticuerpos.Incube la mezcla de la etiqueta durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, conecte dos pequeños discos magnéticos a los dos lados del puerto de carga de la celda del dispositivo. Aspire el medio desde todos los puertos del dispositivo.Luego, pipetee lentamente dos microlitros de la mezcla de sangre marcada en el dispositivo microfluídico desde el puerto de carga de celdas. Coloque el dispositivo microfluídico en la platina del microscopio con control de temperatura a 37 grados centígrados. Espere unos minutos hasta que haya suficientes neutrófilos atrapados en el área de acoplamiento de la célula.A continuación, agregue 100 microlitros de la solución quimioatrayente y 100 microlitros de medio de migración a sus depósitos de entrada designados usando dos pipetas. Esto generará un gradiente de quimioatracción mediante una mezcla química basada en flujo laminar continuo. El quimioatrayente puede ser proteínas recombinantes como FMLP o una muestra clínica como el sobrenadante de esputo de pacientes con EPOC.Una vez que el flujo se haya estabilizado, adquiera imágenes de fluorescencia del gradiente de FitZ dextron en el canal. A continuación, incube el dispositivo en la platina del microscopio con control de temperatura o en una incubadora de cultivo celular convencional durante 15 minutos. Después de la incubación, obtenga imágenes del canal de gradiente utilizando un objetivo diez veces para registrar las posiciones finales de la célula para el análisis de datos.Los neutrófilos se seleccionan negativamente a partir de una gota de sangre entera directamente en el dispositivo microfluídico utilizando un marcador de anticuerpos de partículas magnéticas y un par de imanes. Con el fin de confirmar la pureza de los neutrófilos aislados en chip, se realizó la tinción de Giemsa. Los resultados muestran los núcleos típicos en forma de anillo y lóbulo de los neutrófilos.Después de la carga de celdas, la estructura de acoplamiento alinea efectivamente las celdas junto al canal de gradiente antes de aplicar un gradiente químico. Cuando se expone a un gradiente químico durante 15 minutos, se produce la quimiotaxis. Y se puede medir mediante imágenes.Estos resultados muestran que después de 15 minutos, pocas células se arrastraron a través del canal de barrera en la muestra controlada con medio. Por el contrario, muchos neutrófilos se movieron rápidamente a través del canal de barrera y migraron hacia un gradiente FMLP de 100 nanomolares. Una vez que esto puede enviar la quimiotaxis directamente desde nuestro en 25 minutos.Esto ofrece una herramienta útil para que los investigadores estudien la mecánica de la migración de células completas. Y una herramienta para aplicaciones clínicas.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

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Un dispositivo de microfluidos para la cuantificación de la quimiotaxis bacteriana en gradientes de concentración estable

Este video muestra el ensayo de quimiotaxis de neutrófilos utilizando un método todo en chip. El método permite el aislamiento directo de neutrófilos de la sangre total mediante selección inmunomagnética negativa seguida de un ensayo de quimiotaxis en un chip microfluídico.

Un método basado en chips microfluídicos para el análisis rápido de quimiotaxis de neutrófilos utilizando sangre total

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Este protocolo detalla un ensayo diseñado para medir la quimiotaxis de neutrófilos humanos a partir de una gotita de sangre entera con robusta reproducibilidad. Este enfoque evita la necesidad de la separación de neutrófilos y requiere sólo unos pocos minutos de ensayo de tiempo de preparación. El chip de microfluidos permite la medición repetida de la quimiotaxis de neutrófilos en el tiempo en los bebés o pequeños mamíferos, donde el volumen de la muestra es limitado.

Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

Se presenta un método de cuantificación de la adhesión de neutrófilos. Este método crea un ambiente de flujo dinámica similar al que se encuentra en un vaso sanguíneo. Se permite la investigación de la adhesión de neutrófilos a cualquiera de las moléculas de adhesión purificadas (ligando) o sustrato de células endoteliales (HUVEC) en un contexto similar al entorno in vivo con el estrés pura.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

ensayos de quimiotaxis visuales son esenciales para una mejor comprensión de cómo las células eucariotas controlar la migración de células direccional quimioatrayente mediada. A continuación, se describen los métodos detallados para: 1) en tiempo real, monitoreo de alta resolución de múltiples ensayos de quimiotaxis, y 2) visualizar simultáneamente el gradiente quimioatrayente y la dinámica espacio-temporal de los acontecimientos en las células HL60 neutrófilos como señalización.

Imaging G acoplados a proteínas mediada por el receptor de quimiotaxis y sus eventos de señalización en células HL60 neutrófilos como

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Este protocolo genera microarrays de biopartículas que proporcionan enjambre de neutrófilos controlado espacialmente. Proporciona un fácil acceso a los mediadores que los neutrófilos liberan durante la migración y permite el análisis cuantitativo de imágenes.

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Aquí, presentamos un protocolo mejorado de ensayo de quimiotaxis. El objetivo de este protocolo es reducir los pasos y los costos de los métodos tradicionales de quimiotaxis bacteriana y servir como un recurso valioso para comprender las interacciones planta-microbio.

Un ensayo de quimiotaxis mejorado para la identificación rápida de quimioatrayentes rizobacterianos en exudados radiculares

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

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Presentamos un método automatizado de alto rendimiento para cuantificar las trampas extracelulares de neutrófilos (NET) utilizando el sistema de análisis de células vivas, junto con un enfoque de doble colorante dependiente de la permeabilidad de la membrana.

Técnica de alto rendimiento en tiempo real para cuantificar la formación de trampas extracelulares de neutrófilos en neutrófilos humanos

Aprende a aislar neutrófilos de sangre completa y realizar ensayos de quimiotaxis en un solo dispositivo microfluídico en solo 25 minutos. Este método integrado facilita el estudio de la migración de células inmunes.

Un método todo-en-chip para el análisis rápido de la quimiotaxis de neutrófilos directamente de una gota de sangre

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