A Multi-agujero criovial Elimina congelación Artifacts cuando los tejidos musculares se sumergen directamente en nitrógeno líquido

El objetivo general de este procedimiento es congelar tejidos musculares, sumergiéndolos directamente en nitrógeno líquido mientras se eliminan los artefactos de congelación. Maozhang He, un estudiante de mi laboratorio, demostrará este procedimiento junto con Yizhong Huang. Para comenzar, etiquete la identidad de la muestra en cada vial criogénico.

Luego, organice el siguiente equipo: un tanque de nitrógeno líquido, gafas de seguridad o un protector facial, guantes para congelador, fórceps de 10 centímetros y pinzas de 25 centímetros. Además, organice una nevera de poliestireno, película plástica, un escalpelo y fundas de encuadernación PVC tamaño A4. Para preparar las muestras musculares, comience llenando la nevera con nitrógeno líquido.

A los cinco minutos de obtener la muestra, coloque suavemente el espécimen sobre una hoja de plástico para encuadernar tamaño A4, y observe la dirección de las fibras musculares. A continuación, utilice un escalpelo para hacer dos incisiones paralelas a través del espécimen en la dirección de las fibras musculares, de aproximadamente 3 centímetros de longitud y separadas 0,6 centímetros. Recorte el músculo incisionado en forma de rectángulo de aproximadamente 0,6 centímetros de ancho, por 0,6 centímetros de alto, por 1,5 centímetros de largo.

Luego, utilizando fórceps de diez centímetros, coloque suavemente la muestra sobre un trozo de película plástica con el eje longitudinal del músculo inciso paralelo al borde largo de la película. Coloque el tejido muscular en la parte inferior central de un vial criogénico etiquetado, justo entre los orificios de entrada, y tape firmemente el vial. Para congelar la muestra de tejido, utilice pinzas de veinticinco centímetros para sumergir rápidamente todo el vial criogénico en nitrógeno líquido, dentro del recipiente de poliestireno previamente enfriado, esperando hasta que el nitrógeno líquido deje de hervir.

El nitrógeno líquido debe ser suficiente para sumergir completamente la criovial, y la ampolla criogénica debe estar completamente por debajo del nivel del líquido. Transfiera las muestras de músculo a un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido o a un congelador de -80 grados celsius para su almacenamiento a largo plazo. Es importante evitar el contacto accidental entre los músculos congelados y los recipientes o instrumentos a temperatura ambiente.

Para preparar los portaobjetos, enfríe previamente un criostato a una temperatura entre 20 grados centígrados y 22 grados centígrados. Retire y deseche la cuchilla de microtomo usada, y limpie el soporte de la cuchilla y la placa anti-arrastre dentro del criostato. A continuación, instale una cuchilla nueva de microtomo en el criostato y ajuste el grosor de corte a ocho micrómetros.

Retire el vial criogénico con la muestra de músculo del tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido o del congelador a 80 grados Celsius, y colóquelo en nitrógeno líquido o sobre hielo seco. A continuación, transfiera la muestra al criostato y espere 30 minutos para que el espécimen se equilibre con la temperatura del criostato. Después de usar OCT para incrustar la muestra, monte la muestra en el portamuestras.

Luego, corte secciones de ocho micrómetros. Monte las secciones hacia el centro de un portaobjetos a temperatura ambiente. Coloque inmediatamente el portaobjetos en una caja para portaobjetos.

Luego, coloque la caja de portaobjetos en un congelador a 80 grados Celsius. No permita que el portaobjeto se seque a temperatura ambiente. Como se observa aquí, se formaron cristales de hielo cuando una muestra de músculo de longísimus dorsi de cerdos se colocó directamente en un congelador a 80 grados Celsius, lo que provocó el conocido efecto de queso suizo en el crio-corte muscular.

Los cristales de hielo también se formaron cuando el tejido muscular se sumergió directamente en nitrógeno líquido. Mediante otro método, muchos cristales de hielo en forma de aguja se formaron en el compartimento citoplasmático de los miocitos cuando el tejido se sumergió en medio de montaje OCT en la orientación adecuada, y luego se congeló rápidamente en una suspensión de isopentano. La congelación del tejido en el criovial de múltiples orificios logra una excelente integridad de la muestra, con un compartimento citoplasmático claramente visible y una estrecha adyacencia de los miocitos al tejido circundante.

Utilizando este método, se analizó la actividad ATPasa en fibras musculares de contracción rápida y de contracción lenta. Cuando se les da tiempos equivalentes, las fibras de contracción rápida aparecen claras, con dos grados, y las fibras de contracción lenta aparecen negras. En un método estándar de congelación mostrado aquí, el tejido muscular se sumergió en una suspensión de isopentano sin contacto directo con el medio de montaje OCT, sin embargo, es difícil mantener el estado sólido-líquido de la suspensión de isopentano durante más de una hora, y el isopentano no siempre está disponible.