Evaluación primaria explosión efectos In Vitro

El objetivo general de este método es generar ondas de choque representativas que pueden ocurrir durante eventos de voladura y evaluar el impacto de este choque mecánico en la viabilidad de las células primarias en cultivo. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave relacionadas con la respuesta de los tipos individuales de células a eventos de alta energía, como la exposición a una onda de choque. La principal ventaja de este método es que nos permite evaluar distintas respuestas celulares a una sola onda de choque en contraposición a las respuestas a nivel de tejido u órgano.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la identificación de los mecanismos celulares alterados como resultado de las lesiones por explosión primaria, que son causadas por la exposición a una onda de choque. Aunque este método se está demostrando con un tipo de célula específica de interés, cualquier célula puede cultivarse y colocarse dentro de la configuración de prueba para evaluar las respuestas específicas de la célula a una onda de choque. Para empezar, cultive la línea celular de interés en el cultivo estándar hasta que alcancen el 80% de confluencia.

A continuación, aspira el medio. Lave las células dos veces con PBS y agregue dos mililitros de Tripsina-EDTA. Incubarlos en condiciones estándar de cultivo durante cinco minutos.

Compruebe brevemente que las células se han disociado correctamente del matraz. Y luego agregue cuatro mililitros de medio de cultivo que contenga FBS al matraz para neutralizar la tripsina y transferir las células a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 200 veces g durante cuatro minutos para granular las células.

Luego, aspire lentamente el sobrenadante teniendo cuidado de no desalojar la bolita. Y volver a suspender el pellet en cinco mililitros de medio. Coloque tres platos de 35 mililitros etiquetados dentro de un plato de 90 mililitros.

Luego, agregue dos mililitros de medio a cada plato y siembre cada uno con 70 mil celdas. Incubar las células durante la noche para permitir una adhesión adecuada de las células antes de exponerlas a la onda de choque. Antes de comenzar el montaje del tubo de choque, póngase el equipo de protección personal adecuado, incluidas botas de trabajo con punta de acero y una bata de laboratorio.

Comience insertando dos barras de alineación a través de los orificios de los pernos que se encuentran en el plano horizontal de la brida de salida. Luego, coloque una lámina de junta de caucho de nitrilo sobre el extremo de las barras de alineación para que se asiente entre la brida de salida y el equipo de cultivo de órganos ex vivo. Fije el equipo EVOC a la brida de salida del tubo de choque deslizando el dispositivo sobre las barras de alineación.

Asegúrese de que esté orientado correctamente para que la sección que sostiene la placa de Petri se encuentre en su base. A continuación, inserte cuatro pernos y arandelas M24 en los orificios restantes y apriete firmemente las tuercas y los pernos secuencialmente en forma de simetría diagonal, mientras verifica visualmente que el equipo EVOC y el tubo de choque se han alineado correctamente. A continuación, conecte un transductor de presión al equipo EVOC y conéctelo a la fuente de corriente mediante un cable sensor.

Además, utilice un cable BNC para conectar la fuente de corriente al osciloscopio. Asegúrese de que todas las válvulas de liberación y los controles de flujo en el tubo de choque estén cerrados. A continuación, abra la línea de aire comprimida externa incorporada y gire manualmente el regulador de presión en el sentido de las agujas del reloj para cargar el solenoide a 2,5 bar.

Abra el cilindro de aire comprimido y, a continuación, gire lentamente el regulador de presión en el sentido de las agujas del reloj para aumentar la presión a aproximadamente 15 bar. A continuación, prepare los diafragmas cortando una lámina de plástico de 0,125 mililitros de grosor en cuadrados de 10 centímetros por 10 centímetros. Crea asas con cinta adhesiva y fíjalas a la parte superior e inferior del diafragma.

Utilícelos para colocar con cuidado el diafragma junto a la brida delantera pequeña junto a la cámara de la recámara. Asegúrese de que el diafragma esté recto y colocado correctamente antes de cerrar la recámara. Y luego asegúrelo en su lugar con cuatro pernos y tuercas M24.

Dentro de la campana estéril, prepare membranas adhesivas permeables al gas para que cada una sea lo suficientemente grande como para cubrir la parte superior de una placa de Petri de 35 mililitros. Luego, transfiera una placa de Petri de 90 mililitros que contiene tres muestras experimentales a la campana. Aspire el medio de una de las placas y cúbralo con dos secciones de membrana, asegurándose de que haya un sello hermético entre la membrana y el borde de la placa.

Transfiera la muestra al equipo EVOC y asegúrela a la base del accesorio de modo que la parte superior del plato quede alineada con la base interior del tubo de choque. En este punto, colóquese protectores auditivos, gafas protectoras, botas de seguridad y una bata de laboratorio. Presurice el sistema de tubo de choque girando la perilla de control de flujo en el regulador en el sentido de las agujas del reloj.

En la parte inferior del panel de control, seleccione la entrada de recámara doble para una onda de choque de corta duración o la entrada del tubo controlador para una mayor duración de la onda. A continuación, encienda la fuente de alimentación de CC y el osciloscopio para requerir los datos de forma de onda. A continuación, encienda las luces de seguridad con el interruptor en la pared opuesta al panel de control para notificar a otros investigadores que no ingresen a la habitación cuando el tubo de choque se esté cargando.

En la caja de control del solenoide, presione el interruptor para cerrar el solenoide. Luego, en el panel de control, abra lentamente el control de flujo girando la perilla en sentido contrario a las agujas del reloj para aumentar gradualmente la presión dentro de la cámara de compresión. Cuando se alcanza la presión de ruptura del diafragma, el diafragma se romperá y se escuchará un estallido.

Una vez que escuche este ruido, cierre rápidamente la perilla de control de flujo. Luego, abra el solenoide apagando el interruptor de la caja de control del solenoide y apague la luz de seguridad. Transfiera la muestra de células a la campana estéril.

Allí, retire la membrana adhesiva permeable al gas y llene el plato con dos mililitros de medio de crecimiento fresco. Agregue 200 microlitros de reactivo indicador redox a cada placa experimental directamente después de rellenarlas con dos mililitros de medio de crecimiento fresco. Luego, transfiera el plato a una incubadora estándar durante cuatro horas.

Después de la incubación, transfiera dos alícuotas de 100 microlitros de cada placa a una placa apropiada de 96 pocillos. Lea la placa en un lector de placas de fluorescencia y, a continuación, exporte y guarde los datos. Para obtener imágenes fluorescentes de células vivas y muertas, las células deben colocarse inicialmente en una cubierta de vidrio dentro de las placas de cultivo de 35 mililitros.

Después del tratamiento con ondas de choque, aspire el medio y lave las células dos veces en un mililitro de PBS. A continuación, transfiera 100 microlitros del reactivo de muertos vivos del kit de imágenes a cada muestra. E incubar las células y el reactivo a temperatura ambiente, protegerlo de la luz durante 15 minutos.

Después de la incubación, retire el reactivo y lave las células una vez con un mililitro de PBS. Con pinzas de punta fina, retire con cuidado el cubreobjetos del plato de 35 mililitros y colóquelo boca abajo sobre un portaobjetos de microscopía de vidrio. Adquiera imágenes de cada muestra utilizando un microscopio fluorescente equipado con una lente de objetivo 5X con una apertura numérica de 0,25.

A continuación, utilice el software de análisis de imágenes para contar manual o automáticamente el número de células verdes vivas y rojas muertas de cada imagen. Usando el método descrito aquí, las células cultivadas en una monocapa se expusieron a ondas de choque generadas con un tubo de choque. Los sensores en el tubo de choque muestran los perfiles de presión observados en diferentes lugares a lo largo del tubo.

Utilizando un ensayo de indicación redox, se encontró que la aplicación de una onda de choque de 127 kilopascales pudo reducir significativamente la viabilidad de las células de la papila dérmica en comparación con los controles después de 24 horas en cultivo. La aplicación de 72 kilopascales o menos de una onda de choque no redujo la viabilidad. Para respaldar estas observaciones, un ensayo de muertos vivos también demostró una reducción de la viabilidad celular en aquellos expuestos a la onda de choque de 127 kilopascales en comparación con el control.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar de forma rápida y variable a una velocidad de 60 muestras por hora. El tubo de choque se puede usar para generar ondas de choque para explorar una variedad de lesiones primarias por explosión. Estos pueden variar desde el pulmón blasto hasta la osificación heterotópica, que es la formación inapropiada de hueso dentro de los tejidos blandos del cuerpo.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar los riesgos que conlleva trabajar con gases comprimidos y ondas de choque de alta energía, y seguir siempre las pautas de seguridad correctas. Pequeñas modificaciones en un tubo de choque pueden permitirnos alterar la onda de choque. A continuación, podemos evaluar la respuesta celular a diferentes perfiles de presión e intensidades, que representan diferentes escenarios de explosión.

Siguiendo este procedimiento, se puede realizar una secuenciación de próxima generación para responder a preguntas de investigación adicionales, como: ¿Cómo altera la exposición a una onda de choque nuestra inscripción natural dentro de las células?