Análisis de inducida por ácido retinoico Neural diferenciación de células madre embrionarias de ratón en cuerpos embrioides dos y tres dimensiones

El objetivo general de este procedimiento es analizar la expresión y producción de genes y marcadores proteicos, respectivamente, de la diferenciación neuronal de células madre embrionarias de ratón. Este método puede ayudar a determinar el mecanismo responsable de la inhibición de la diferenciación neuronal por la edad bruta de los DPA, y conducir a mejores protocolos para diferenciar las células madre en neuronas con fines terapéuticos. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el seguimiento del proceso de diferenciación neuronal a nivel de emerina y proteína, incluso mediante microscopía óptica.

El Dr. Junning Yang, investigador asociado en mi laboratorio, demostrará el procedimiento. Comience la formación del cuerpo embrioide cosechando células madre embrionarias con 0.25% de tripsina-EDTA durante dos a cinco minutos a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono. Agregue Dulbecco's Medium modificado de Iscove, o IMDM, con 15% de FBS a las celdas que se desprenden y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros.

Centrifugar a 160 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente. A continuación, se cuentan las células con un hemocitómetro y se prepara una suspensión de cinco x 10 a la quinta célula por mililitro en IMDM con ácido retinoico de 0,5 micromolares. A continuación, utilice una pipeta de ocho canales y puntas de 200 microlitros para colocar gotas de 120 microlitros por placa de Petri de 100 milímetros.

Invierta el plato y llene la tapa invertida con PBS para evitar que las gotas colgantes se sequen. Cultivo a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante tres o cuatro días. Utilice puntas de pipeta de 200 microlitros para cosechar cuerpos embrioides colgantes cultivados durante tres días.

Toque un cuerpo embrionario con la punta de una pipeta y transfiéralo a un cubreobjetos recubierto de fibra en una placa de 24 pocillos. Cambie el medio de los cultivos cada dos o tres días. Al cambiar el medio, recoja el medio usado para el análisis de secreción de proteínas según sea necesario.

Para detectar las proteínas secretadas en el medio, transfiera 500 microlitros de medio corporal embrioide a filtros centrífugos de corte de 10 kilodalton y centrifugue a 20.000 x G a cuatro grados centígrados. Examine el medio que queda dentro de los filtros centrífugos cada 15 a 20 minutos para evitar un enriquecimiento excesivo. Detenga la centrifugación cuando el volumen del medio restante haya disminuido a 25 microlitros.

Invierta el filtro y haga girar a 160 x G a cuatro grados centígrados, luego recoja el medio concentrado restante siguiendo las instrucciones del fabricante. Para un cultivo en 3D, coseche cuerpos embrioides cultivados durante cuatro días como gotas colgantes con puntas de pipeta de 200 microlitros, como antes. Transfiera 30 cuerpos embrioides a un tubo de centrífuga de 1,5 mililitros, luego prepare la solución de gel de colágeno diluyendo los volúmenes apropiados de solución de colágeno y DMEM 5X, agregando la solución de neutralización e inmediatamente mezclando bien.

Coloca el gel de colágeno en hielo. A continuación, pipetee un volumen adecuado de solución de colágeno enfriada en el tubo que contiene los cuerpos embrioides y, a continuación, pipetee suavemente la suspensión del cuerpo embrioide en los pocillos de una placa de seis pocillos sin crear burbujas. Transfiera inmediatamente la placa a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante 60 minutos para iniciar la polimerización del colágeno.

Pasados los 60 minutos, superponga la placa que contiene los cuerpos embrioides con IMDM. Para la disociación de cuerpos embrioides, recoja nuevamente los cuerpos embrioides de gota colgante de cuatro días con puntas de pipeta de 200 microlitros. Esta vez, transfiéralos a una placa de Petri bacteriológica no adhesiva que contenga IMDM con 15% de FBS y cultivo a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono, durante cuatro días más.

Revise los cuerpos embrioides dos veces al día para asegurarse de que no se adhieran al fondo. Agite suavemente el plato para evitar la adhesión del cuerpo embrioide. Después de cuatro días, transfiera los cuerpos embrioides a un tubo de centrífuga y centrifugue a 185 x G durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, retire el sobrenadante. El volumen de la paleta no debe exceder los 100 microlitros. A continuación, pipetee un mililitro de colagenasa tipo I al 0,25%, suplementada con un 20% de FBS en PBS en el tubo de los cuerpos embrioides.

Incubar la mezcla durante una hora a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Pipetear suavemente la suspensión con una punta de pipeta de un mililitro cada 20 minutos. Después de la incubación, lave suavemente las células tres veces con PBS.

Si hay agregados de células, use un colador de células con una malla de 100 micrones para eliminarlos. Coloque las células en cubreobjetos recubiertos de gelatina en IMDM, luego incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Lave los cuerpos embrioides 2D o 3D disociados con PBS.

Luego fije con un cuatro por ciento de paraformaldehído y PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar las celdas fijas tres veces con PBS para eliminar los desechos de celdas flotantes, agregue 1% de tritón X-100 en PBS para permeabilizar las celdas durante 20 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar como antes, retire el último lavado y bloquee con 5%BSA en PBS durante 30 minutos.

Hacia el final de la incubación, prepare una dilución de anticuerpos primarios en 1%BSA en PBS suplementado con 0.03%triton X-100. Cuando hayan transcurrido los 30 minutos, reemplace la solución de bloqueo con la solución de anticuerpos primarios. Incubar durante tres horas a temperatura ambiente, o toda la noche, a cuatro grados centígrados.

Después del lavado, aplique un anticuerpo secundario en PBS e incube durante una hora a temperatura ambiente. Por último, monte los cubreobjetos en portaobjetos de vidrio con un medio antidecoloración para microscopía óptica. Esta imagen muestra la emergencia de un brote de un cuerpo embrioide generado a partir de ESC, positivo para dos copias del gen Syx, que codifica un factor de intercambio de guanina que activa la GTPasa RhoA.

La imagen fue tomada después de seis días en cultivo 3D. Este cuerpo embrioide formado a partir de ESC Syx KnockOut demuestra un aumento de la brotación después del mismo tiempo en cultivo. Aquí, las imágenes de fase de los bordes del cuerpo de los embrioides en 2D muestran que las células se expandieron más rápido a partir de Syx KnockOuts que de Syx de tipo salvaje.

Estas imágenes de inmunofluorescencia ilustran que el marcador de diferenciación neuronal, Nestin, que se muestra en rojo, era más abundante en las células que se expandían a partir de cuerpos embrioides 2D6 KnockOut de seis días que en sus contrapartes de tipo salvaje Syx. Aquí, las imágenes de inmunofluorescencia muestran que los marcadores de diferenciación neuronal nestina y beta III tubulina eran más abundantes en las células disociadas de cuerpos embrioides 3D6 KnockOut de 13 días que en sus contrapartes de tipo salvaje Syx. Este es un procedimiento que requiere mucho tiempo debido a la duración del crecimiento y la diferenciación del cuerpo embrioidal.

No solo requiere al menos ocho días, sino que en algunos casos seguimos la diferenciación hasta 24 días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar limitar la viabilidad del diámetro del cuerpo embrioide para garantizar tasas de diferenciación similares a lo largo de los cuerpos embrioides.